Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Флуоресцентная гибридизация in situ и маркировка 5-этинил-2'-дезоксиуридина для стволовых клеток в гидрозоанской медузе Cladonema pacificum

2.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64285

⸱

3 августа 2022 г.

 ,  ,  , 
1Graduate School of Life Sciences, Tohoku University, 2Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем протокол визуализации стволовых пролиферирующих клеток в медузе Cladonema. Флуоресцентная гибридизация in situ с маркером стволовых клеток позволяет обнаруживать стволовые клетки, а маркировка 5-этинил-2'-дезоксиуридином позволяет идентифицировать пролиферирующие клетки. Вместе могут быть обнаружены активно размножающиеся стволовые клетки.

Аннотация

Книдарии, в том числе морские анемоны, кораллы и медузы, демонстрируют разнообразную морфологию и образ жизни, которые проявляются в сидячих полипах и свободно плавающих медузах. Как показано на примере установленных моделей , таких как Гидра и Нематостелла, стволовые клетки и / или пролиферативные клетки способствуют развитию и регенерации книдарийных полипов. Тем не менее, основные клеточные механизмы у большинства медуз, особенно на стадии медузы, в значительной степени неясны, и, таким образом, разработка надежного метода идентификации конкретных типов клеток имеет решающее значение. В этой статье описывается протокол визуализации стволовых пролиферирующих клеток у гидрозоанской медузы Cladonema pacificum. Cladonema medusae обладают разветвленными щупальцами, которые непрерывно растут и поддерживают регенеративную способность на протяжении всей своей взрослой стадии, обеспечивая уникальную платформу для изучения клеточных механизмов, организованных пролиферирующими и / или стволовыми клетками. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) с использованием маркера стволовых клеток позволяет обнаруживать стволовые клетки, в то время как пульсовая маркировка 5-этинил-2'-дезоксиуридином (EdU), маркером S-фазы, позволяет идентифицировать пролиферирующие клетки. Сочетая маркировку FISH и EdU, мы можем обнаруживать активно размножающиеся стволовые клетки на фиксированных животных, и этот метод может быть широко применен к другим животным, включая немодельные виды медуз.

Введение

Cnidaria считается базально ветвящимся метазойным типом, содержащим животных с нервами и мышцами, что ставит их в уникальное положение для понимания эволюции развития животных и физиологии 1,2. Книдарии подразделяются на две основные группы: Anthozoa (например, морские анемоны и кораллы) обладают только личинками планулы и сидячими полипами, в то время как Medusozoa (члены Hydrozoa, Staurozoa, Scyphozoa и Cubozoa) обычно принимают форму свободно плавающих медуз, или медуз, а также личинок планулы и полипов. Книдарийцы обычно демонстрируют высокую регенеративную способность, и их основные клеточные механизмы, особенно их обладание взрослыми стволовыми клетками и пролиферативными клетками, привлекли большое внимание 3,4. Первоначально идентифицированные у гидры, гидрозоановые стволовые клетки расположены в интерстициальных пространствах между эпителиальными клетками эктодермии и обычно называются интерстициальными клетками или i-клетками3.

Гидрозоановые i-клетки имеют общие характеристики, которые включают мультипотентность, экспрессию широко сохраненных маркеров стволовых клеток (например, Nanos, Piwi, Vasa) и миграционный потенциал 3,5,6,7,8. Как функциональные стволовые клетки, i-клетки активно участвуют в развитии, физиологии и реакциях окружающей среды гидрозоанских животных, что свидетельствует об их высокой регенеративной способности и пластичности3. В то время как стволовые клетки, похожие на i-клетки, не были идентифицированы вне гидрозоанов, даже у установленного модельного вида Nematostella, пролиферативные клетки все еще участвуют в поддержании и регенерации соматической ткани, а также зародышевой линии9. Поскольку исследования в области развития и регенерации книдариев были преимущественно проведены на животных полипового типа, таких как гидра, гидрактиния и нематостелла, клеточная динамика и функции стволовых клеток у видов медуз остаются в значительной степени без внимания.

Гидрозойская медуза Clytia hemisphaerica, космополитический вид медуз с различными местами обитания по всему миру, включая Средиземное море и Северную Америку, была использована в качестве экспериментального модельного животного в нескольких исследованиях развития и эволюции10. Благодаря своим небольшим размерам, простоте обращения и большим яйцам, Clytia подходит для лабораторного обслуживания, а также для внедрения генетических инструментов, таких как недавно установленные методы трансгенеза и нокаута11, открывая возможность для подробного анализа клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе биологии медуз. В щупальце Clytia medusa i-клетки локализуются в проксимальной области, называемой луковицей, а предшественники, такие как нематобласты, мигрируют к дистальной кончику, дифференцируясь в различные типы клеток, включая нематоциты12.

Во время регенерации Clytia manubrium, орального органа медуз, Nanos1+ i-клетки, которые присутствуют в гонадах, мигрируют в область, где манубрий теряется в ответ на повреждение и участвуют в регенерации манубриума7. Эти результаты подтверждают идею о том, что i-клетки в Clytia также ведут себя как функциональные стволовые клетки, которые участвуют в морфогенезе и регенерации. Однако, учитывая, что свойства i-клеток различаются у репрезентативных животных полипового типа, таких как гидра и гидрактиния3, возможно, что характеристики и функции стволовых клеток разнообразны среди видов медуз. Кроме того, за исключением Клитии, экспериментальные методы были ограничены для других медуз, а подробная динамика пролиферативных клеток и стволовых клеток неизвестна13.

Гидрозоанская медуза Cladonema pacificum является новым модельным организмом, который может содержаться в лабораторных условиях без водяного насоса или системы фильтрации. Cladonema medusa имеет разветвленные щупальца, общую характеристику в семействе Cladonematidae, и орган фоторецепторов, называемый ocellus на эктодермальном слое около луковицы14. Процесс ветвления щупальца происходит на новом месте ветвления, которое появляется вдоль адаксиальной стороны щупальца. Со временем щупальца продолжают удлиняться и ветвиться, а старые ветви выталкиваются к кончику15. Кроме того, щупальца Cladonema могут регенерировать в течение нескольких дней после ампутации. Недавние исследования показали роль пролиферирующих клеток и стволовых клеток в разветвлении и регенерации щупальца в Cladonema 16,17. Однако, в то время как обычная гибридизация in situ (ISH) использовалась для визуализации экспрессии генов в Cladonema, из-за ее низкого разрешения в настоящее время трудно наблюдать динамику стволовых клеток на клеточном уровне в деталях.

В данной статье описывается метод визуализации стволовых клеток в Cladonema методом FISH и совместного окрашивания с EdU, маркером пролиферации клеток18. Мы визуализируем паттерн экспрессии Nanos1, маркера стволовых клеток 5,17, с помощью FISH, который позволяет идентифицировать распределение стволовых клеток на уровне одной клетки. Кроме того, совместное окрашивание экспрессии Nanos1 маркировкой EdU позволяет различать активно пролиферирующие стволовые клетки. Этот метод мониторинга как стволовых, так и пролиферативных клеток может быть применен к широкому спектру исследуемых областей, включая ветвление щупалец, гомеостаз тканей и регенерацию органов при кладонеме, и аналогичный подход может быть применен к другим видам медуз.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации , относящейся ко всем материалам, реагентам и оборудованию, используемым в этом протоколе.

1. Зондовый синтез

  1. Экстракция РНК
    1. Поместите три живых Cladonema medusae, которые культивируются в искусственную морскую воду (ASW), в трубку объемом 1,5 мл, используя передаточную пипетку объемом 3,1 мл с отрезанным наконечником, и удалите как можно больше ASW.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ASW получают путем растворения смеси минеральных солей в водопроводной воде с нейтрализатором хлора; конечный удельный вес (S.G.) равен 1,018 или частей на тысячу (ppt) ~ 27.
    2. Заморозьте пробирки объемом 1,5 мл в жидком азоте, чтобы ингибировать активность РНКазы. Добавьте 30 мкл буфера лизиса из набора для выделения общей РНК, в который был добавлен 2-меркаптоэтанол (1 мкл /100 мкл буфера лизиса), и гомогенизируйте образцы в буфере лизиса с использованием гомогенизатора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать переполнения буфера и образца из пробирок, рекомендуется гомогенизация с небольшим количеством буфера лизиса.
    3. Добавьте 570 мкл буфера лизиса и извлеките общую РНК в соответствии с протоколом комплекта полной изоляции РНК (рисунок 1).
    4. Измерьте концентрацию экстрагированной РНК с помощью спектрофотометра и храните при −80 °C до использования.
  2. Синтез кДНК
    1. Используя набор, синтезируйте кДНК, используя общую РНК, извлеченную из медуз, в качестве шаблона (рисунок 1 и таблица 1).
    2. Инкубировать при 65 °C в течение 5 мин.
    3. Быстро остывает на льду.
    4. Осуществляют синтез кДНК со смесью со стадии 1.2.1 (таблица 1). Тщательно перемешать путем пипетки и инкубировать при 42 °C в течение 60 мин.
    5. Инкубировать при 95 °C в течение 5 мин.
    6. Быстро остывает на льду.
    7. Измеряют концентрацию синтезированной кДНК с помощью спектрофотометра и хранят при температуре или ниже −20 °C до использования.
  3. Синтез продукта ПЦР
    1. Чтобы создать шаблон ПЦР, спроектируйте конкретную грунтовку с помощью Primer-BLAST. Источник эталонной последовательности из данных NCBI или данных RNA-seq.
      ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для грунтовок, используемых в этом протоколе.
    2. Для усиления целевой последовательности выполняют клонирование ТА, которое не требует применения рестрикционных ферментов. Для получения продукта ПЦР, в который добавляют аденин на конце 3', используйте следующие настройки: 98 °C в течение 2 мин; 35 циклов 98 °C в течение 10 с, 55-60 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 1 мин. Для реакций используют ДНК-полимеразу Taq (табл. 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы определить условия ПЦР, следуйте протоколу, который сопровождает используемую ДНК-полимеразу, которая обычно обеспечивает рекомендуемую температуру отжига и время продления.
    3. Пропустите продукт ПЦР через 1% агарозный гель и вырежьте интересующую полосу. Извлеките продукты ПЦР из разрезанных гелей с помощью набора для экстракции геля.
  4. Лигатура
    1. Лигируйте продукт ПЦР к вектору с 3' тиминовыми навесами путем смешивания реагентов (таблица 1) и инкубации при 37 °C в течение 30 мин (рисунок 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Молекулярное соотношение вектор:ПЦР должно составлять 1:>3. Размер вектора pTA2 составляет приблизительно 3 кб. Если продукт ПЦР (вставка) равен A (kb) и B (ng/μL), объем вкладыша (X в таблице 1), который необходимо взять, может быть рассчитан по ([50 нг векторной × A kb вставки])/(3 kb vector × [1/3]) = 50· Нг вставки. Если концентрация вставки составляет В нг/мкл, то взятый объем равен 50· А/В мкл вставки.
  5. Трансформация и нанесение покрытий
    1. Для трансформации разморозьте компетентные клетки на льду и распределите их в аликвоты по 20 мкл каждая. Добавьте 1 мкл плазмид, содержащих продукт ПЦР (менее 5% от компетентного клеточного объема) и вихрь в течение 1 с. Инкубировать на льду в течение 5 мин, а затем инкубировать при 42 °C в течение 45 с, а вихрь в течение 1 с.
    2. Добавьте 180 мкл супероптимального бульона со средой подавления катаболита (SOC) (богатая питательными веществами бактериальная культуральная среда) к компетентным клеткам и инкубируйте при 37 °C в течение 30 мин. Через 30 мин распределите компетентные клетки на агаровую пластину, содержащую ампициллин, 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-галакто-пиранозид (X-галлон) и изопропил-β-d-1-тиогалакопиранозид (IPTG), и инкубируйте при 37 °C в течение 12-16 ч (рисунок 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: X-gal и IPTG используются для выбора синих и белых колоний.
  6. Жидкая культура
    1. Выберите белую колонию из белых и синих колоний на тарелке. Добавьте его в 3-5 мл среды LB с ампициллином и инкубируйте на шейкере в течение 12-16 ч при 37 °C (рисунок 1).
  7. Минипреп
    1. Извлеките плазмиду из среды LB с помощью плазмидного минипрепа (рисунок 1).
    2. Количественно оцените концентрацию плазмиды с помощью спектрофотометра.
  8. Прочитайте последовательность.
    1. Чтобы прочитать последовательность ДНК плазмиды, отправьте плазмиду для секвенирования Сэнгера, а затем используйте программное обеспечение для выравнивания ее с последовательностью генома / транскриптома, чтобы подтвердить, правильно ли синтезирована целевая последовательность, и оценить, в каком направлении целевая последовательность вставлена в плазмиду (от 5' до 3' или от 3' до 5').
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если целевая последовательность вставлена в плазмиду в направлении от 5' до 3' от места связывания РНК-полимеразы около конца 3', антисмысловый зонд может быть сгенерирован транскрипцией in vitro . Если целевая последовательность вставлена в обратном направлении от 3' до 5', может быть сгенерирован датчик (отрицательный контроль). При использовании векторов, таких как pTA2, можно использовать два сайта связывания транскрипции в зависимости от цели.
  9. Транскрипция in vitro
    1. Подготовьте шаблон ДНК из созданной плазмиды, выполнив ПЦР с использованием праймеров вне сайта связывания РНК-полимеразы (например, сайтов связывания T7/T3) в плазмиде (рисунок 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Универсальные праймеры, такие как форвардный праймер M13-20 и обратный праймер M13, могут быть использованы для подготовки шаблона ДНК, который включает сайты связывания РНК-полимеразы.
    2. Очистите шаблон после амплификации ПЦР с помощью набора для экстракции геля/ПЦР.
    3. Смешайте реагенты, показанные ниже, и выполните реакцию транскрипции при 37 °C в течение 3 ч (рисунок 1 и таблица 1).
    4. Добавить 1,5 мкл ДНКазы и инкубировать при 37 °C в течение 30 мин.
    5. Добавьте 10 мкл рваной воды и очистите зонд от реакционного раствора транскрипции с помощью очистительной колонны.
    6. Проверьте размер синтезированной РНК, загрузив 1 мкл на 1% агарозный гель и определите концентрацию с помощью спектрофотометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Синтезированные РНК-зонды должны иметь концентрацию не менее 100 нг/мкл.
    7. Добавить 30 мкл формамида для хранения при температуре или ниже −20 °C.

2. Регистрация и фиксация EdU

  1. Поместите Cladonema medusae (5-10 животных на трубку) в пробирки по 1,5 мл с помощью передаточной пипетки объемом 3,5 мл и добавьте ASW до общего объема 500 мкл. Добавьте 7,5 мкл 10 мМ раствора EdU и инкубируйте образцы в течение 1 ч при 22 °C (рисунок 2). Конечная концентрация EdU составляет 150 мкМ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 5-7-дневные медузы для мониторинга образования третьей ветви (рисунок 3А). День, когда медузы отделяются от полипа, считается днем 1, а на 5-й день медузы обычно начинают проявлять третью ветвь на своих основных щупальцах.
  2. Через 1 ч удалить как можно больше ASW, содержащей EdU.
  3. Для обезболивания медуз добавляют 7% MgCl2 вH2Oи инкубируют в течение 5 мин.
  4. Удалить 7% MgCl2 вH2O изафиксироватьмедузу на ночь (O.N.) при 4 °C с 4% параформальдегидом (PFA) в ASW (рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении FISH без включения EdU образцы могут быть зафиксированы аналогично образцам, обработанным EdU после анестезии (этапы 2.3-2.4).

3. Флуоресцентная гибридизация in situ

  1. Лечение протеиназой и постфиксация
    1. Снимите PFA и промывайте образцы PBS, содержащим 0,1% Tween-20 (PBST) в течение 3 x 10 мин. Используйте 300-500 мкл PBST на стирку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: От этого шага до конца гибридизации эксперимент должен проводиться в среде, свободной от РНКазы, в перчатках и маске. 1x PBS на этом этапе должен быть изготовлен из воды, обработанной DEPC. После гибридизации можно использовать 1x PBS, изготовленный с водой без обработки DEPC. Некоторые протоколы ISH и FISH обезвоживают образцы с использованием этапов метанола, что позволяет сохранять фиксированные образцы при -20 °C до использования. Чтобы избежать лишней работы, процесс обезвоживания исключен из этого протокола, особенно потому, что образцы могут храниться в PBST до нескольких дней.
    2. После фиксации поместите образец в пробирки объемом 1,5 мл на шейкер, за исключением стадии инкубации антитела O.N. анти-DIG-POD (этап 3.4.2). После промывки добавляют 10 мг/мл раствора протеиназы К в ПБСТ и инкубируют медузу с протеиназой К (конечная концентрация: 10 мкг/мл) при 37 °C в течение 10 мин.
    3. Удалить раствор протеиназы К и промыть образцы в течение 2 х 1 мин с ПБСТ.
    4. Для постфикса медузы добавляют 4% PFA в 1x PBS и инкубируют при 37 °C в течение 15 мин.
    5. Удалите раствор PFA и промывайте образцы в течение 2 x 10 минут pBST.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если ген-мишень высоко экспрессируется с низким фоновым сигналом, шаги 3.1.2-3.1.5 могут быть пропущены.
  2. Гибридизация
    1. Удалите PBST и добавьте буфер гибридизации (HB Buffer, таблица 1). Инкубируйте образцы в HB Buffer в течение 15 мин при комнатной температуре (RT). Используйте 300-400 мкл HB Buffer, который обеспечивает достаточный объем для успешной гибридизации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Hb Buffer, Wash Buffer 1 и Wash Buffer 2 готовятся с 20-кратным запасом SSC. HB Buffer хранится при температуре или ниже −20 °C и должна быть доведена до RT перед использованием.
    2. Удалите буфер HB и добавьте новый HB Buffer. Прегибридировать при 55 °C в течение не менее 2 ч в гибридизационном инкубаторе.
    3. Удалите буфер HB и инкубируйте с HB Buffer, содержащим зонды, которые хранились на этапе 1.9.7 (конечная концентрация зонда: 0,5-1 нг/мкл в HB Buffer). Гибридизируйте при 55 °C в течение 18-24 ч (рис. 2) в гибридизационном инкубаторе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность и специфичность сигнала FISH могут варьироваться в зависимости от экспрессии генов-мишеней, а также длины и специфичности зонда. Для увеличения интенсивности можно регулировать такие параметры, как продолжительность гибридизации (18-72 ч) и температура (50-65 °C), а также тестировать различные зонды. Чтобы избежать неспецифических сигналов, лечение протеиназой К (концентрация и продолжительность) может быть модифицировано19.
  3. Удаление зонда
    1. Удалите буфер HB, содержащий зонды, а затем добавьте буфер очистки 1 (таблица 1). Промывайте образцы с помощью Wash Buffer 1 в течение 2 x 15 мин при 55 °C. Используйте 300-400 мкл промывочного буфера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: HB Buffer, содержащие зонды, могут использоваться многократно, примерно до десяти раз. Вместо того, чтобы выбрасывать, храните использованный HB Buffer, содержащий зонды, при температуре или ниже −20 °C. Перед использованием разогрейте Wash Buffer 1, Wash Buffer 2, 2x SSC и PBST при 55 °C.
    2. Удалите буфер стирки 1, а затем добавьте буфер стирки 2 (таблица 1). Промывайте образцы с помощью Wash Buffer 2 в течение 2 x 15 мин при 55 °C.
    3. Удалите Wash Buffer 2, а затем добавьте 2x SSC. Промывайте образцы с 2x SSC в течение 2 x 15 мин при 55 °C.
    4. Удалите 2X SSC, а затем добавьте предварительно нагретый PBST. Промывайте образцы в течение 1 х 15 мин с PBST на RT.
  4. Инкубация антител анти-DIG
    1. Удалите PBST, а затем добавьте 1% блокирующего буфера. Инкубируйте образцы в течение не менее 1 ч при РТ при медленном встряхивании на коромысле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте 1% блокирующего буфера заново, разбавив 5% блокирующего буферного запаса (таблица 1). Проверьте образцы перед следующей реакцией антител, потому что образец имеет тенденцию прилипать к задней части крышки или стенке в результате тряски.
    2. После блокировки удалите 1% блокирующий буфер, добавьте анти-DIG-POD раствор (1:500, в 1% блокирующем буфере) и инкубируйте образцы O.N. при 4 °C (рисунок 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы время инкубации оставалось в течение 12-16 ч, чтобы предотвратить обнаружение неспецифических сигналов.
  5. Обнаружение зонда с маркировкой DIG
    1. Удалите анти-DIG-POD раствор, а затем добавьте буфер Tris-NaCl-Tween (TNT, таблица 1). Промывайте образцы тротилом в течение 3 х 10 мин на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование метода усиления тирамидного сигнала (TSA) обеспечивает лучшее разрешение изображения против реагентов, меченных пероксидазой хрена (например, анти-DIG-POD).
    2. Разбавляют флуоресцентный краситель-конъюгированный тирамид (Cy5-тирамид) стоковым раствором (1:50) в буфере амплификационного разбавителя для получения активного раствора Cy5-тирамида (фиг.2).
    3. Удалите как можно больше тротила, а затем добавьте активный раствор Cy5-тирамида. Инкубировать образцы в течение 10 мин в темноте.
    4. Промывайте образцы PBST в течение 3 x 10 мин в темноте.
  6. Обнаружение EdU
    ПРИМЕЧАНИЕ: Комплект EdU обнаруживает встроенные EdU в виде флуоресцентных сигналов (рисунок 2).
    1. Чтобы приготовить коктейль для обнаружения EdU, смешайте компоненты, как показано в таблице 1. Используйте 100 мкл коктейля обнаружения EdU для каждого образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте 1-кратную реакционную буферную добавку, разбавив 10-кратную добавку реакционного буфера сверхчистой водой.
    2. Удалите PBST, а затем добавьте коктейль обнаружения EdU. Инкубировать в темноте в течение 30 мин.
    3. Мойте с ПБСТ в течение 3 х 10 мин в темноте.
  7. Окрашивание ДНК
    1. Разбавить Hoechst 33342 (1:500) в PBST для приготовления раствора Hoechst. Удалите PBST, а затем добавьте раствор Hoechst. Инкубируйте образцы в течение 30 мин в темноте (рисунок 2).
    2. Промывайте образцы ПБСТ в течение 3-4 х 10 мин в темноте.
  8. Установка
    1. Сделайте банку на стеклянной горке, чтобы предотвратить дробление образца. Нанесите виниловую ленту на стеклянную горку и выдолблите центр.
    2. Переложите медузу в банку на скользящем стекле с помощью передаточной пипетки объемом 3,1 мл с отрезанным наконечником.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не позволить щупальцам перекрываться.
    3. Удалите любой PBST с помощью пипетки P200, а затем медленно добавьте 70% глицерина в качестве монтажной среды (рисунок 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо 70% глицерина можно использовать антивядающую монтажную среду для предотвращения выцветания флуоресценции.
    4. Аккуратно поместите на медузу щипцами обложку, а боковую часть обшивки заклейте прозрачным лаком для ногтей.
    5. Держите слайды при температуре 4 °C в темноте, если не сразу выполняете микроскопическое наблюдение.
  9. Отображение
    1. Используйте лазерный сканирующий конфокальный микроскоп для получения изображений. Для одноэлементного разрешения используйте 40-кратную масляную линзу или линзу для более высокого увеличения.
    2. После получения изображения откройте изображения с помощью программного обеспечения ImageJ/FIJI и подсчитайте ячейки, которые являются положительными для EdU+ и/или Nanos1+ с помощью многоточечного инструмента20.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Щупальца кладонема были использованы в качестве модели для изучения клеточных процессов морфогенеза и регенерации 15,16,17. Структура щупальца состоит из эпителиальной трубки, где стволовые клетки, или i-клетки, расположены в проксимальной области, называемой колбой щупальца, а новые ветви последовательно добавляются к задней части дистальной области луковицы вдоль адаксиальной стороны (рисунок 3A

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Пролиферирующие клетки и стволовые клетки являются важными клеточными источниками в различных процессах, таких как морфогенез, рост и регенерация21,22. В данной статье описывается способ совместного окрашивания маркера стволовых клеток Nanos1 с помощью маркировки FISH и EdU в Cladonema medusae. Предыдущая работа с использованием маркировки EdU или BrdU предполагала, что пролиферативные клетки локализуются в щупальце луковиц16,1...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Эта работа была поддержана AMED под номером гранта JP22gm6110025 (к Y.N.) и грантом JSPS KAKENHI No 22H02762 (к Y.N.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-Меркаптоэтанол Wako137-06862
3,1 мл переводной пипеткаThermo Scientific233-20S
5-Bromo-4-хлор-3-индолил-&бета;-D-галактопиранизид (X-Gal)Wako029-15043
анти-DIG-PODRoche11207733910
Cladonema pacificum Nanos1 прямой праймер5'- AAGAGACACAGTCATTATCAAGC
GA-3'
Cladonema pacificum Nanos1 обратный праймер5'-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3'
Cladonema pacificum Piwi forward primer5'- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA
AGGC -3'
Cladonema pacificum Piwi обратный праймер5'- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA
CTGGC -3'
Набор для пролиферации клеток Click-iT EdU для визуализации, краситель Alexa Fluor 488Invitrogen C10337Комплект EdU
Coroline offGEX Co. ltdN/AНейтрализатор хлора
DIG Набор для обнаружения нуклеиновых кислот Блокирующий реагентRoche11175041910блокирующий буфер 
Смесь мечения DIG RNA Roche11277073910
DTT PromegaP117B
ECOS компетентная ячейка DH5αNIPPON GENE316-06233компетентная клетка
Fast gene Gel/PCR Extraction kitFast geneFG-91302набор для экстракции геля
Fast gene plasmid mini kitFast geneFG-90502plasmid miniprep
FormamideWako 068-00426
Гепарин натриевая соль из свининыSIGMA-ALDRICH H3393-10KU
Изопропил-&бета;-D(-)-тиогалактопиранозид (IPTG)Wako096-05143
LB АгарИнвитроген22700-025агаровая пластина
LB Бульонная основаInvitrogen12780-052LB средняя
Малеиновая кислотаWako134-00495
мини Колонки РНК быстрого вращенияRoche11814427001колонка для очистки
NaClWako 191-01665
NanoDrop OneC Микрообъемный УФ-Вид спектрофотометр с Wi-FiThermo ScientificND-ONEC-Wспектрофотометр
Полиоксиэтлен (20) Сорбитан Монолаурат (Tween-20)Wako 166-21115
Измельчитель PowerMasher 2ниппи891300Гомогенизатор
Протеиназа КНакарай Теске 29442-14
Ингибитор РНКазыTaKaRa2313A
RNeasy Mini kitQiagen 74004набор для выделения общей РНК
RQ1 РНКаза без РНКазы DnasePromegaM6101
Буфер цитрата натрия 20x порошок (20x SSC)TaKaRaT9172
SEA LIFEMarin TechN/Aсмесь минеральных солей
T3 РНК-полимераза Roche11031163001
РНК-полимераза T7 Roche10881767001
TAITEC HB-100TAITEC0040534-000Инкуватор гибридизации
TaKaRa Ex Taq TaKaRaRR001ATaq ДНК-полимераза
TaKaRa PrimeScript 2 1st набор для синтеза кДНКTaKaRa6210Aнабор для синтеза кДНК
Target CloneTOYOBO TAK101pTA2 Векторная
тРНКRoche10109541001
TSA Plus Cyanine 5AKOYA BiosciencesNEL745001KTметод усиления тирамидного сигнала (TSA)
Zeiss LSM 880ZEISSN/Aлазерный сканирующий конфокальный микроскоп

Ссылки

  1. Leclère, L., Röttinger, E. Diversity of cnidarian muscles: Function, anatomy, development and regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 157(2017).
  2. Bosch, T. C. G., et al. Back to the basics: Cnidarians start to fire. Trends in Neurosciences. 40 (2), 92-105 (2017).
  3. Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: Are there unifying principles. Development Genes and Evolution. 223 (1-2), 53-66 (2013).
  4. Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology: Cnidaria. Development. 138 (8), 1447-1458 (2011).
  5. Leclère, L., et al. Maternally localized germ plasm mRNAs and germ cell/stem cell formation in the cnidarian Clytia. Developmental Biology. 364 (2), 236-248 (2012).
  6. Bradshaw, B., Thompson, K., Frank, U. Distinct mechanisms underlie oral vs aboral regeneration in the cnidarian Hydractinia echinata. eLife. 4, 05506(2015).
  7. Sinigaglia, C., et al. Pattern regulation in a regenerating jellyfish. eLife. 9, 54868(2020).
  8. David, C. N. Interstitial stem cells in Hydra: Multipotency and decision-making. The International Journal of Developmental Biology. 56 (6-7-8), 489-497 (2012).
  9. Röttinger, E. Nematostella vectensis, an emerging model for deciphering the molecular and cellular mechanisms underlying whole-body regeneration. Cells. 10 (10), 2692(2021).
  10. Houliston, E., Momose, T., Manuel, M. Clytia hemisphaerica: A jellyfish cousin joins the laboratory. Trends in Genetics. 26 (4), 159-167 (2010).
  11. Peron, S., Houliston, E., Leclère, L. The Marine Jellyfish Model, Clytia hemisphaerica. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology. Boutet, A., Shierwater, B. , CRC Press. Boca. Raton, FL. 129-147 (2021).
  12. Denker, E., Manuel, M., Leclère, L., Le Guyader, H., Rabet, N. Ordered progression of nematogenesis from stem cells through differentiation stages in the tentacle bulb of Clytia hemisphaerica (Hydrozoa, Cnidaria). Developmental Biology. 315 (1), 99-113 (2008).
  13. Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Regeneration potential of jellyfish: Cellular mechanisms and molecular insights. Genes. 12 (5), 758(2021).
  14. Suga, H., et al. Flexibly deployed Pax genes in eye development at the early evolution of animals demonstrated by studies on a hydrozoan jellyfish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14263-14268 (2010).
  15. Fujiki, A. Branching pattern and morphogenesis of medusa tentacles in the jellyfish Cladonema pacificum (Hydrozoa, Cnidaria). Zoological Letters. 5 (12), 13(2019).
  16. Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Cell proliferation controls body size growth, tentacle morphogenesis, and regeneration in hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. PeerJ. 7, 7579(2019).
  17. Hou, S., Zhu, J., Shibata, S., Nakamoto, A., Kumano, G. Repetitive accumulation of interstitial cells generates the branched structure of Cladonema medusa tentacles. Development. 148 (23), (2021).
  18. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  19. Angerer, L. M., Angerer, R. C. Detection of poly A + RNA in sea urchin eggs and embryos by quantitative in situ hybridization. Nucleic Acids Research. 9 (12), 2819-2840 (1981).
  20. Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. Purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures. Journal of Visualized Experiments. (154), e60353(2019).
  21. Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).
  22. Penzo-Méndez, A. I., Stanger, B. Z. Organ-size regulation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 019240(2015).
  23. Sinigaglia, C., Thiel, D., Hejnol, A., Houliston, E., Leclère, L. A safer, urea-based in situ hybridization method improves detection of gene expression in diverse animal species. Developmental Biology. 434 (1), 15-23 (2018).
  24. King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13 (1), 8(2013).
  25. Flici, H., et al. An evolutionarily conserved SoxB-Hdac2 crosstalk regulates neurogenesis in a cnidarian. Cell Reports. 18 (6), 1395-1409 (2017).
  26. He, S., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377-1380 (2018).
  27. Govindasamy, N., Murthy, S., Ghanekar, Y. Slow-cycling stem cells in hydra contribute to head regeneration. Biology Open. 3 (12), 1236-1244 (2014).
  28. Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Developmental Biology. 12 (1), 34(2012).
  29. Gold, D. A., et al. Structural and developmental disparity in the tentacles of the moon jellyfish Aurelia sp.1. PLoS One. 10 (8), 0134741(2015).
  30. Gold, D. A., Nakanishi, N., Hensley, N. M., Hartenstein, V., Jacobs, D. K. Cell tracking supports secondary gastrulation in the moon jellyfish Aurelia. Development Genes and Evolution. 226 (6), 383-387 (2016).
  31. Cheng, L. -C., Alvarado, A. S. Whole-mount BrdU staining with fluorescence in situ hybridization in planarians. Planarian Regeneration. 1774, 423-434 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

EdUNanos1FISH
Флуоресцентная гибридизация in situ и маркировка 5-этинил-2'-дезоксиуридина для стволовых клеток в гидрозоанской медузе Cladonema pacificum
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.