Здесь мы представляем протокол для мышиной модели потери слуха, вызванной шумом (NIHL). Чтобы вызвать NIHL, мы разработали новое и простое устройство с использованием гофрированного пластика, клетки-ловушки для крыс и динамика. Слуховой ответ ствола мозга и иммунофлуоресцентная визуализация были использованы для оценки слуховой функции и повреждения наружных волосковых клеток соответственно.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Модифицированные экспериментальные условия для потери слуха, вызванной шумом, у мышей и оценка слуховой функции и повреждения наружных волосковых клеток
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Модель потери слуха, вызванной шумом (NIHL) на животных, полезна патологоанатомам, терапевтам, фармакологам и исследователям слуха, чтобы досконально понять механизм NIHL и впоследствии оптимизировать соответствующие стратегии лечения. Это исследование направлено на создание улучшенного протокола для разработки мышиной модели NIHL. В этом исследовании были использованы самцы мышей C57BL/6J. Мышей без анестезии подвергали воздействию громких звуков (1 и 6 кГц, предъявляемых одновременно при 115-125 дБ SPL-A) непрерывно в течение 6 ч в сутки в течение 5 дней подряд. Слуховую функцию оценивали через 1 день и 1 неделю после воздействия шума с помощью слуховой реакции ствола мозга (ABR). После измерения ABR мышей приносили в жертву, а их кортиевские органы собирали для иммунофлуоресцентного окрашивания. По результатам измерений слуховой реакции ствола мозга (ABR) значительная потеря слуха наблюдалась через 1 день после воздействия шума. Через 1 неделю пороги слышимости подопытных мышей снизились до ~80 дБ SPL, что все еще было значительно выше, чем у контрольных мышей (~40 дБ SPL). По результатам иммунофлуоресцентной визуализации было показано, что наружные волосковые клетки (OHC) повреждены. Таким образом, мы создали модель NIHL на самцах мышей C57BL/6J. Было разработано и внедрено новое и простое устройство для генерации и передачи чистотонального шума. Количественные измерения порогов слышимости и морфологическое подтверждение повреждений OHC показали, что приложенный шум успешно индуцировал ожидаемую потерю слуха.
Введение
Около 1,3 миллиарда человек во всем мире страдают от потери слуха из-завоздействия шума1. В этом исследовании мы стремились установить четкий пошаговый процесс индуцирования и подтверждения потери слуха, вызванной шумом (NIHL). NIHL возникает в результате дегенерации/разрушения волосковых клеток (HC) и спиральных ганглиозных нейронов (SGN), повреждения стереоцилии HC и/или потери синапсов между внутренними HC улитки и SGN. Такие аномалии могут также вызывать шум в ушах и нарушение восприятия речи (особенно в сложной акустической среде), помимо NIHL. Социальные, психологические и когнитивные функции могут быть последовательно затронуты этими физиологическими недостатками 2,3,4,5,6.
В доклинических исследованиях на мышах, связанных с NIHL, наиболее популярными штаммами мышей являются CBA/CaJ 2,3,6,7 и C57BL/6 4,5,8. Кроме того, самцы мышей 3,4,7 используются чаще, чем самки, так как эстроген оказывает защитное действие на слух. Поэтому в этом исследовании мы использовали только самцов мышей9. Обратившись к литературе, в качестве частот прикладываемого шума мы выбрали 1 кГц и 6 кГц. Интенсивность подаваемого шума составляла от 115 дБ SPL-A (окружающего клетку) до 125 дБ SPL-A (в центре клетки). После непрерывного воздействия шума на подопытных мышей в течение 6 ч в день в течение 5 дней подряд оптимальное повышение порога слуха указывало на то, что у подопытных мышей была сформирована оптимальная степень NIHL. Операции по обращению с животными, построению экспериментальной установки и созданию шума четко описаны шаг за шагом в прилагаемом протоколе.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Эксперименты на животных в этом исследовании были одобрены Комитетом по уходу за животными Медицинского колледжа Маккея. Восьминедельные мыши-самцы C57BL/6J были приобретены в Национальном центре лабораторных животных (г. Нью-Тайбэй, Тайвань). Все мыши были выведены и размещены в соответствии со стандартным протоколом для животных.
1. Индукция NIHL у мышей
- Подготовьте клетку для подопытных мышей
- Для этого используйте клетку-ловушку для крыс размерами 14 см × 17 см × 24 см. Нарежьте четыре куска гофрированных пластиковых досок подходящих размеров, сделав так, чтобы они поместились в клетку (13 см × 23 см и 13 см × 16 см).
- Чтобы мыши не порезали лапы сетчатой сеткой, поместите две части на нижнюю и заднюю сторону соответственно. Расположите две другие части перпендикулярно друг другу, чтобы разделить пространство внутри клетки на четвертинки.
- Проводите это исследование в звуконепроницаемой коробке. Разместите динамик на расстоянии 8,5 см перед клеткой и поместите динамик и клетку в звуконепроницаемую коробку.
- Откройте прикладное программное обеспечение CLIO
- Наведите курсор на значок динамика, затем нажмите TwoSin. Введите и измените значение частоты 1 на 1000 Гц, частоты 2 на 6000 Гц и нажмите OK, чтобы начать воспроизведение звука.
- На вкладке Leq измените dBV на dBSPL. Установив время в интерфейсе программы, нажмите кнопку с зеленым треугольником, чтобы воспроизвести звук.
- Поместите микрофон перед динамиком на расстоянии 8,5 см, чтобы откалибровать уровень шума (см. Дополнительный файл 1). Отрегулируйте уровень шума до 125 дБ SPL-A и непрерывно контролируйте его в течение не менее 3 минут, чтобы убедиться, что уровень шума достаточно стабилен. Используйте генератор, анализатор и усилитель для создания и управления шумом. (Рисунок 1)
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте этот шаг в звуконепроницаемом боксе, чтобы не повредить слух оператора. - Поместите в клетку четырех самцов мышей C57BL/6J (по одной на каждую четверть) для воздействия шума. Случайным образом распределите мышей в каждой четверти во время воздействия шума. Поместите микрофон в верхнюю часть клетки, чтобы контролировать уровень шума во время воздействия шума (Рисунок 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте этот шаг в звуконепроницаемом боксе, чтобы не повредить слух оператора. - Подвергайте мышей воздействию шума на частотах 1 кГц и 6 кГц непрерывно в течение 6 ч в день в течение 5 дней подряд.
- Измерьте пороги слышимости мышей через 1 день после воздействия шума (т.е. на 6-й день), измерив ABR. Повторите эти измерения ABR снова через 1 неделю после воздействия шума (т.е. на13-й день). После измерений ABR принесите в жертву всех задействованных мышей и соберите их улитки (рис. 3).
2. Оценка порога слышимости на основе слуховой реакции ствола мозга (ABR)
- Используйте коммерческую систему тестирования ABR, специально разработанную для мелких животных10.
- Внутрибрюшинно вводят мышам смесь тилетамина и золазепама (40 мг/кг) и ксилазина (9,3 мг/кг) для общей анестезии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка ABR занимает ~2 часа. Обязательно обеспечьте тепловую поддержку с помощью грелки и нанесите мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость, пока мышь находится под наркозом. - Измерьте ABR у мыши под общим наркозом. Поместите подкожные игольчатые электроды (12 мм) в макушку, за ушной раковиной левого уха и обратно возле хвоста, чтобы измерить порог слышимости.
- Предъявляйте акустические стимулы с помощью динамика, расположенного на расстоянии 1 см от левого уха животного.
- Используйте осциллограф для контроля акустических раздражителей. Выберите синусоиду для стимулов и 10 k для оконной шкалы. Поверните ручку частоты, чтобы получить желаемую частоту акустических стимулов.
- Отрегулируйте интенсивность стимула, повернув ручку AMLP на генераторе функций. Добейтесь желаемой интенсивности стимула, повернув ручку AMLP на подходящее напряжение, рассчитанное по калибровке.
- Соберите измерения ABR при серии интенсивностей стимула, от 10 дБ SPL до 100 дБ SPL, с шагом 10 дБ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте порог слышимости в звуконепроницаемой коробке. Минимальным уровнем интенсивности стимула, который мог бы привести к возникновению различимой волны V в собранном сигнале, был принят порог ABR10,11 (рис. 4). После оценки ABR наблюдайте за животным до тех пор, пока оно не оправится от анестезии (~1 ч).
3. Микроскопическое исследование
- Фиксация заготовленной ткани
- После измерений ABR пожертвуйте мышь, внутрибрюшинно введя смесь тилетамина и золазепама (100 мг/кг) и ксилазина (23,25 мг/кг) для микроскопического исследования.
- Соберите улитки у мышей и сразу же погрузите их в 10% формальдегид (FA) для фиксации (две улитки/мл) не менее чем на 8 ч при 4 °C.
- После фиксации раствор ЖК заменить 10% раствором этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) для декальцификации в течение 3-4 дней при 4 °С. Затем проверьте каждую улитку пинцетом, чтобы убедиться, что улитки достаточно размягчены.
- Поместите улитки в чашку Петри, наполненную фосфатно-солевым буфером (PBS), и разрежьте спиралевидный орган корти (OC) (каждую декальцинированную улитку) на три части — базальный поворот, средний поворот и апикальный поворот — для окрашивания тканей.
- Под препарирующим микроскопом (увеличение: 8x-35x) удаляют костные структуры (scala vestibuli, scala tympani и modiolus) декальцинированных улиток и получают мягкие ткани, включая OC (толщина: около 40 мкм).
- Иммунофлуоресцентное окрашивание улитки
- Приготовление блокирующего буфера: Приготовить 2% бычий сывороточный альбумин (БСА) и 0,2% раствор Тритона Х-100 в ПБС.
- Переложите окрашиваемую ткань из чашки Петри в микроцентрифужную пробирку и погрузите ткань в 0,1 мл блокирующего буфера на 2 ч при комнатной температуре (RT).
- Приготовление буфера первичных антител Myo7A: Разбавьте первичное антитело Myo7A в блокирующем буфере в объемном соотношении 1:200.
- Обработайте ткань в пробирке микроцентрифуги 100 мкл буфера первичных антител Myo7A в течение 2 ч при ЛТ.
- Трижды промойте салфетку в ПБС по 5 минут каждый.
- Приготовление вторичного антитела Myo7A (Myo7A-Rb-488) и буфера к фаллоидину (фаллоидин-594): Разбавьте вторичные антитела Myo7A (1:400) и антитела к фаллоидину (1:200) в блокирующем буфере.
- Обработайте ткань 100 мкл вторичного антитела Myo7A и буфера антител к фаллоидину в течение 2 ч при ЛТ.
- После лечения антителами + антителами к фаллоидину промыть ткань в PBS три раза, по 5 мин каждый.
- Перенесите промытую ткань из пробирки микроцентрифуги в чашку Петри, наполненную PBS, с помощью пластиковой трансферной пипетки объемом 1 мл с обрезанным наконечником.
- Чтобы подготовиться к микроскопическому исследованию, разверните ткань, поместите ее на предметное стекло и добавьте 15 мкл фторомонтной среды 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) на ткань, чтобы полностью покрыть ее. Аккуратно положите стеклянный покровный листок на салфетку. Оставьте предметное стекло на ночь в RT, прежде чем запечатать его лаком для ногтей.
- Получение изображений
- Получение 2D-изображений с помощью вертикального флуоресцентного микроскопа и программного обеспечения для получения изображений.
- Перед проведением микроскопического исследования центрируйте ткань в поле зрения и отрегулируйте чувствительность до ISO 100. Сначала отрегулируйте время экспозиции, нажав кнопку « Автоматический режим » в программном обеспечении, а затем выполните точную настройку вручную, нажав кнопку «Настройка », чтобы оптимизировать соотношение сигнал/шум.
- Отрегулируйте длину волны падающего света, чтобы возбудить флуорофоры, вращая куб флуоресценции. Псевдоцвета использовались для обозначения излучения от различных флуоресцентных меток (синий свет: DAPI; зеленый свет: Myo7A; красный свет: фаллоидин).
- Сканируя образец ткани, генерируйте и собирайте данные визуализации в виде файлов изображений в форматах .tif и .jpg.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Изменение порога слышимости ABR
Порог слышимости мышей измеряли с помощью тонального всплеска ABR через 1 день или 1 неделю после воздействия шума. Наблюдалось значительное повышение порога слышимости на всех трех исследуемых частотах (12 кГц: 84,29 ± 2,77 дБ SPL; 24 кГц: 91,43 ± 0,92 дБ SPL; 32 кГц: 98,57 ± 1,43 дБ SPL) через 1 день после воздействия шума (т.е. на6-й день). Частичное восстановление слуха произошло через 1 неделю после воздействия шума (т.е. на 13-й день), но пороги слышимо...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
NIHL можно разделить на два типа: временный NIHL, который показывает временное смещение порога слышимости, и постоянный NIHL, который характеризуется постоянным сдвигом порога слышимости. Считается, что потеря слуха, которую мы наблюдали на6-й день (1 день после воздействия шума), является комбинацией этих двух типов. В этом случае порог слышимости будет демонстрировать постепенное восстановление с течением времени из-за временного компонента потери слуха. В наших предварительных экспериментальных исследования...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Отсутствие конфликта интересов, подлежащего раскрытию.
Благодарности
Мы благодарим гранты Министерства науки и технологий (MOST) правительства Тайваня (MOST 110-2314-B-715-005, MOST 111-2314-B-715-009-MY3) и гранты на проведение исследований от Медицинского колледжа Маккея (MMC-RD-110-1B-P030, MMC-RD-111-CF-G002-03).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1/4" CCP Стандартный микрофонный комплект | GRAS | 428158 | Для шумового воздействия |
| Входной модуль усилителя, AMI100D | BIOPAC | Для слухового ответа ствола мозга | |
| Биоусилитель, BIO100C | BIOPAC | Для слухового ответа ствола | |
| мозга Бычья сыворотка Альбумин | SIGMA | A9647 | Иммунофлуоресцентное окрашивание |
| Программное обеспечение | CellsensOlympus медико-биологическая наука | Получение изображений | |
| Гофрированный пластик | |||
| DAPI флюоромонт | SouthernBiotech | 0100-20 | Иммунофлуоресцентное окрашивание |
| Этилендиаминтетрауксусная кислота | SIGMA | E5134 | |
| Усилитель вызванной реакции | BIOPAC | Для слуховой реакции | |
| ствола мозгаФормальдегид | APLHA | F030410 | Фиксация кохлеарной |
| высокопроизводительной системы сбора данных, MP160 | BIOPAC | Для слухового ответа ствола мозга | |
| Модульный удлинительный кабель, MEC110C | BIOPAC | Для слухового ответа ствола мозга | |
| Myo7A первичное антитело | Proteus | 25-6790 | Иммунофлуоресцентное окрашивание |
| Myo7A вторичное антитело | Jackson immunoresearch | 711-545-152 | Иммунофлуоресцентное окрашивание |
| Игольчатый электрод, униполярный 12 ммTp, EL452 | BIOPAC | Для слухового ответа ствола мозга | |
| к фаллоидину | Alexa Fluor | A12381 | Иммунофлуоресцентное окрашивание |
| фосфатно-солевой буферный | SIGMA | P4417 | |
| Клетка | 14 см x 17 см x 24 см | ||
| РОМПУН-кссилазин инъекционный, раствор | Bayer HealthCare, LLC | ||
| Усилитель звука, MT-1000 | unika | Для шумового воздействия | |
| Генератор/анализатор/разное, FW-02 | CLIO | 620300719 | Для шумового воздействия |
| Звукоизоляционная камера | IEA Electro-Acoustic Technology | Для шумового воздействия и | |
| ABR Динамик. | IEA Electro-Acoustic Technology | Для модуля стимулятора шумового воздействия | |
| , STM100C | BIOPAC | Для слуховой реакции ствола мозга | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | Иммунофлуоресцентное окрашивание |
| Tubephone Set, OUT101 | BIOPAC | Для слуховой реакции ствола мозга | |
| Вертикальный микроскоп, BX53 | Olympus | Получение изображений | |
| Золетил | Вирбак |
Ссылки
- World Report on Hearing. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240020481 (2021).
- Fernandez, K. A., et al. Noise-induced cochlear synaptopathy with and without sensory cell loss. Neuroscience. 427, 43-57 (2020).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. The Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Wang, J., et al. Overexpression of X-linked inhibitor of apoptosis protein protects against noise-induced hearing loss in mice. Gene Therapy. 18 (6), 560-568 (2011).
- Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. Effects of aging and noise exposure on auditory brainstem responses and number of presynaptic ribbons in inner hair cells of C57BL/6J mice. Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).
- Rouse, S. L., Matthews, I. R., Li, J., Sherr, E. H., Chan, D. K. Integrated stress response inhibition provides sex-dependent protection against noise-induced cochlear synaptopathy. Scientific Reports. 10 (1), 18063(2020).
- Amanipour, R. M., et al. Noise-induced hearing loss in mice: Effects of high and low levels of noise trauma in CBA mice. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2018, 1210-1213 (2018).
- Edderkaoui, B., Sargsyan, L., Hetrick, A., Li, H. Deficiency of duffy antigen receptor for chemokines ameliorated cochlear damage from noise exposure. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 173(2018).
- Hultcrantz, M., Simonoska, R., Stenberg, A. E. Estrogen and hearing: a summary of recent investigations. Acta Oto-laryngologica. 126 (1), 10-14 (2006).
- Tsai, S. C. -S., et al. The intravenous administration of skin-derived mesenchymal stem cells ameliorates hearing loss and preserves cochlear hair cells in cisplatin-injected mice: SMSCs ameliorate hearing loss and preserve outer hair cells in mice. Hearing Research. 413, 108254(2022).
- Choi, M. Y., Yeo, S. W., Park, K. H. Hearing restoration in a deaf animal model with intravenous transplantation of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood. Biochemical and Biophysical Research Communications. 427 (3), 629-636 (2012).
- Yu, S. -K., et al. Morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (147), e59189(2019).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
