Методическая статья

Эффективная трансфекция транскрибированной мРНК in vitro в культивируемых клетках с использованием наночастиц пептид-полоксамин

DOI:

10.3791/64288

⸱

17 августа 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Engineering Research Center of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, Third Military Medical University, 2Department of Pediatrics, Ludwig-Maximilians University of Munich, 3Department of Pharmacy, Southwest Hospital, Third Military Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Самособранная пептидно-полоксаминовая наночастица (PP-sNp) разработана с использованием микрофлюидного смесительного устройства для инкапсулирования и доставки in vitro транскрибированной матричной РНК. Описанная мРНК/PP-sNp может эффективно трансфектировать культивируемые клетки in vitro.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Транскрибированные вакцины in vitro с матричной РНК (мРНК) продемонстрировали огромный потенциал в борьбе с пандемией коронавирусной болезни 2019 года (COVID-19). Эффективные и безопасные системы доставки должны быть включены в мРНК-вакцины из-за хрупких свойств мРНК. Самособранная система доставки генов пептидно-полоксаминовых наночастиц (PP-sNp) специально разработана для легочной доставки нуклеиновых кислот и демонстрирует многообещающие возможности в опосредовании успешной трансфекции мРНК. Здесь описан улучшенный метод получения PP-sNp, чтобы подробно рассказать о том, как PP-sNp инкапсулирует мРНК Metridia luciferase (MetLuc) и успешно трансфектирует культивируемые клетки. MetLuc-mRNA получают процессом транскрипции in vitro из линейного шаблона ДНК. PP-sNp получают путем смешивания синтетического пептида/ полокамина с раствором мРНК с использованием микрофлюидного миксера, что позволяет самостоятельно собирать PP-sNp. Заряд PP-sNp впоследствии оценивается путем измерения дзета-потенциала. Между тем, полидисперсность и гидродинамический размер наночастиц PP-sNp измеряют с помощью динамического рассеяния света. Наночастицы мРНК/PP-sNp трансфектируются в культивируемые клетки, а супернатанты из клеточной культуры анализируются на активность люциферазы. Репрезентативные результаты демонстрируют их способность к трансфекции in vitro. Этот протокол может пролить свет на разработку систем доставки мРНК-вакцин следующего поколения.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вакцинация была объявлена одним из наиболее эффективных медицинских вмешательств для снижения заболеваемости и смертности, вызванных инфекционнымизаболеваниями1. Важность вакцин была продемонстрирована со времен вспышки коронавирусной болезни 2019 года (COVID-19). В отличие от традиционной концепции инъекции инактивированных или ослабленных живыми патогенов, современные подходы к вакцинам, такие как вакцины на основе нуклеиновых кислот, концентрируются на сохранении иммуностимулирующих свойств патогенов-мишеней, избегая при этом потенциальных проблем безопасности, связанных с обычным цельным микробным вирусом или в вакцинах на основе бактерий. ....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Транскрипция in vitro химически модифицированной мРНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо использовать безнуклеазные трубки, реагенты, стеклянную посуду, наконечники пипеток и т. Д., Потому что РНКазы повсеместно распространены в окружающей среде, такой как лабораторные растворы, поверхности инструментов, волосы, кожа, пыль и т. Д. Тщательно очистите поверхности скамейки и пипетки перед использованием и наденьте перчатки, чтобы избежать загрязнения RNase.

  1. Выполните линеаризацию шаблона ДНК.
    1. Синтезируют открытую рамку считывания (ORF) люциферазы Metridia (MetLuc), окруженную промотором полимеразы T7, 5' нетра....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рекомбинантную плазмиду переваривали с образованием линеаризованного шаблона ДНК (рисунок 2А). Используя описанный протокол, набор транскрипции T7 in vitro может производить до 80-120 мкг неограниченной MetLuc-мРНК на реакцию 20 мкл и 50-60 мкг закрытой MetLuc-мРНК на реакцию 100 мкл. При анализе с помощью электрофореза интактная MetLuc-мРНК с высоким качеством должна показывать единую и четкую полосу, как показано на рисунке 2B. Загрязняющие вещества, .......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, описанный здесь, не только позволяет экономически эффективно и быстро производить составы вакцины мРНК IVT с определенными свойствами, но также предлагает возможность настройки состава PP-sNp в соответствии с конкретными терапевтическими целями, такими как генная терапия. Чтобы обеспечить успешную генерацию IVT mRNA/PP-sNp, предлагается уделить дополнительное внимание некоторым критическим шагам. При работе с мРНК всегда помните, что условия, свободные от РНКазы, должны поддерживаться на протяжении всего процес.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (NSFC, грант No 82041045 и 82173764), крупным проектом «Исследование системы технологий патогенеза и профилактики эпидемий» (2021YFC2302500) Министерства науки и технологий Китая, проектом «Чунцинские таланты: исключительные молодые таланты» (CQYC202005027) и Фондом естественных наук Чунцина (cstc2021jcyj-msxmX0136). Авторы благодарны доктору Сяоянь Дину за измерение гидродинамического диаметра (нм) и индекса полидисперсности (PDI).

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
BamHITakara1010
cap 1 capping systemJinanM082
Дендритная клеточная линияSigmaSCC142
Последовательность ДНКGenescript
Эпителиальные клетки бронхов человекаSigmaSCC150
KpnITakara1068
LPBeyotimeC0533
Хлорид литияAPEXBioB6083
Malvern Zetasizer Nano ZS90MalvernNB007605
Микрофлюидный чипZHONGXINQIHENGСтандартный чип
Микропланшетные считывателиThermoFisherVarioskan lux
NanoDrop OneThermoFisherND-ONE-W (A30221)
Безнуклеазовая водаThermoFisherAM9932
OptiMEMGibco31985070
пенициллин-стрептомицинGibco15140122
псевдоуридинAPE× BioB7972
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106
Quanti-LucInvivoGenRep-qlc2
RiboRuler High Range РНК-лестницаThermoFisherSM1821
РНКаза без РНКазы коническая трубкаBiosharpBS-100-M
RPMI Medium 1640ThermoFisherC11875500BT
Шприцевая помпаChemyxFusion 101
T7 Transcription KitJinanE131
PDMS

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fehervari, Z., Minton, K., Duarte, J. H. Nature milestones in vaccines. Springer Nature. , Available from: https://www.nature.com/collections/hcajdiajij (2020).
  2. Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
  3. Mulligan, M. J., et al.....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in vitroMetridia

Похожие статьи