Анализ бесконтактного лигирования позволяет обнаружить, локализовать и количественно оценить метилирование аргинина белка в фиксированной ткани

Summary

Анализ бесконтактного лигирования является очень полезным методом для локализации и количественного определения метилирования аргинина данного белка, когда модифицированный остаток аргинина неизвестен и/или если специфическое антитело недоступно.

Abstract

Метилирование аргинина становится ключевой посттрансляционной модификацией, участвующей в широком спектре биологических процессов. Его изучение в тканях часто ограничено отсутствием специфического антитела, распознающего целевой остаток аргинина. Анализ бесконтактного лигирования (PLA) был первоначально разработан для изучения взаимодействий белка и белка. Здесь мы подробно описываем протокол PLA, предназначенный для обнаружения метилирования аргинина, который мы применили к глюкокортикоидному рецептору (ГР). Ранее показав, что PRMT5 диметилирует ГР в клетках, мы использовали PLA с пансимметричным диметиловым антителом и анти-GR антителом для измерения метилирования ГР в опухолях молочной железы. Мы демонстрируем, что PLA предлагает уникальный подход к измерению метилирования аргинина белка-мишени, даже когда сайт метилирования не был идентифицирован. Этот метод может быть распространен на другие посттрансляционные модификации, где доступны эффективные пан-антитела. Следовательно, мы подробно описываем технологию PLA, используемую для обнаружения метилирования аргинина в неподвижных тканях на примере ГР.

Introduction

Метилирование аргинина белками аргининметилтрансферазами (PRMTs) является обильной посттрансляционной модификацией (ПТМ), участвующей в многочисленных биологических процессах. ПРМТ катализируют перенос метильных групп от S-аденозилметионина к остаткам аргинина. Семейство PRMT состоит из девяти членов, классифицированных в соответствии с типом метилирования, которое они осуществляют. Все участники выполняют монометилирование (ММА). Тип 1 (PRMT1, 2, 3, 4, 6 и 8) катализируют асимметричное диметилирование (ADMA), в то время как тип 2 (PRMT5 и 9) катализируют симметричное диметилирование (SDMA), а тип 3 (PRMT7) генерируют только MMA¹. Метилируя многочисленные субстраты, различные PRMT регулируют широкий спектр важных клеточных процессов, таких как репарация ДНК, регуляция транскрипции, иммунный ответ, процессинг РНК и передача сигнала ^2,3. Это особенно верно для передачи сигналов стероидных гормонов, где PRMT модифицируют активность стероидных рецепторов путем метилирования не только самих рецепторов, но и их регуляторов или гистонов².

Метилирование аргинина широко изучено при раке, так как было показано, что большинство PRMTs сверхэкспрессируются при раке по сравнению с нормальными тканями, и их экспрессия часто связана с плохим прогнозом ^4,5. Обнаружение метилирования аргинина in vivo имеет важное значение для понимания клеточных функций, связанных с этой модификацией. Обычно это достигается путем проведения иммуногистохимии (ИГХ) со специфическим антителом, распознающим метилированный остаток аргинина. Однако этот метод очень ограничен, поскольку он основан на идентификации модифицированного остатка аргинина и полагается на эффективность используемого антитела. Анализ близкого лигирования in situ (PLA) первоначально был разработан для изучения белок/белковых взаимодействий в фиксированных клетках или тканях⁶. Интересно, что эта технология также может быть использована для обнаружения ПТМ с помощью пан-антитела против интересующей модификации, а также антитела, распознающего целевой белок. Наша команда ранее адаптировала этот метод для изучения метилирования рецептора эстрогена альфа (ERα) с использованием антитела против ERα и антитела, специфически распознающего сайт метилирования на аргинине 260⁷. Следует отметить, что этот метод может быть распространен на антитела, распознающие особый тип метилирования, даже если метилированный остаток неизвестен. Действительно, несколько компаний поставляют пан-антитела, специфически распознающие MMA, ADMA или SDMA, которые могут быть успешно использованы для изучения метилирования белков in vivo.

Здесь, в качестве доказательства концепции, мы представляем подробный анализ метилирования GR с использованием антител SDMA в опухолях молочной железы человека от экспериментального дизайна до анализа данных.

Protocol

От каждого пациента было получено письменное информированное согласие. Протокол исследования был одобрен комитетом по институциональной этике Онкологического исследовательского центра Лиона.

1. Выбор антител

1. Используйте первичные антитела, валидированные с помощью ИГХ или иммунофлюоресценции (ИФ).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные антитела, выбранные для исследования, имеют решающее значение для успеха PLA и, в частности, в фиксированных тканях. Использование антител, валидированных ИГХ или ИФ, повысит вероятность успеха эксперимента. Перед проведением экспериментов требуется оптимизация и специфичность антител, в идеале путем проведения контрольных экспериментов на клетках, аннулированных по экспрессии интересующего белка, и с использованием ингибитора, специфичного для ферментативной активности вовлеченной метилтрансферазы. Здесь условия предварительно были оптимизированы¹⁰.

2. Приготовление гранул клеточной линии с парафином

ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы помещаются в гель, а затем помещаются в автоматизированный тканевый процессор для обезвоживания образцов и заделки парафина.

1. Приготовьте клеточную гранулу в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл с использованием диссоциации трипсина.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не соскабливайте клетки для сбора урожая.
2. Ресуспендируйте клеточную таблетку в 1,5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS).
3. Центрифугируйте ячейки при комнатной температуре (RT) при 200 x g. Аспирируйте надосадочную жидкость PBS.
4. Суспендируйте гранулу в 1 мл 4% формалина и храните пробирки при температуре 4 °C в течение 3 часов.
5. Промойте клетки в 1X Трис-буферизованном физрастворе (TBS).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте раствор на основе фосфата, так как он деполимеризует гель.
6. Добавьте 1 мл TBS и гомогенизируйте в течение 30 с путем вортексирования. Центрифугируйте в течение 5 минут при 200 х г и удалите надосадочную жидкость.
7. Повторите шаги с 2.5 по 2.7 дважды.
8. Выполните включение ткани в автоматизированный тканевый процессор по специальной программе:
   Формалин 1 ч 37 °C
   Дистиллированная вода 2 мин RT
   EtOH 70% 40 мин 45 °C
   EtOH 80% 40 мин 45 °C
   EtOH 95% 40 мин 45 °C
   EtOH 100% 40 мин 45 °C
   EtOH 100% 40 мин 45 °C
   EtOH 100% 40 мин 45 °C
   Ксилол 40 мин 45 °C
   Ксилол 40 мин 45 °C
   Ксилол 40 мин 45 °C
   Парафин 1 ч 60 °C
   Парафин 1 ч 60 °C
   Парафин 1 ч 30 мин 60 °C

3. Фиксация тканей и подготовка предметного стекла

1. Зафиксируйте ткани в 4% формалине за 24 ч до включения.
2. Разрежьте микротомом серийные срезы блоков, содержащих ткани, толщиной 3 мкм.
3. Проведите депарафинизацию с помощью автокрасителя путем последовательной инкубации предметных стекол в ксилоле (10 мин) дважды, 100% этаноле (5 мин), 95% этаноле (5 мин) и воде (5 мин).
4. Проведите индуцированное тепловым извлечение эпитопов в цитратном буфере с концентрацией 10 мМ с использованием водяной бани при температуре 98 °C в течение 40 мин при соответствующем pH (обычно 6-9).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Два антитела должны работать при одинаковом pH для того, чтобы метод был успешным. Было проведено несколько тестов, прежде чем был установлен оптимальный рН, используемый в настоящем документе. Антителами, используемыми в этом исследовании, являются антитела SDMA и антитела GR.
5. Дайте предметным стеклам остыть в течение 20 минут, затем вымойте их в 1x PBS в течение 20 минут.

4. Эксперимент ИГХ

ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты с ИГХ проводятся с использованием исследовательского прибора Discovery XT (Таблица материалов) для автоматизации и воспроизводимости.

1. Чтобы избежать гашения пероксидазы, используйте ингибитор, входящий в набор диаминобензидина (DAB).
2. Инкубируйте предметные стекла с двумя первичными антителами, разведенными в разбавителе антител, в течение 60 минут.
3. Инкубируйте предметные стекла с вторичным антителом против пероксидазы хрена кролика (HRP) в течение 16 мин или антителом против мышей в течение 30 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для обнаружения ИГХ рекомендуется использовать коммерческий набор с диаминобензидином (DAB) (Таблица материалов).
4. Нанесите гематоксилин (100 мкл/слайд в течение 8 мин) и воронение (100 мкл/слайд в течение 4 мин) на образцы для окрашивания ядер.
5. Вымойте слайды в теплой мыльной воде, затем обезвожьте с помощью автопятнителя и закрепите автоматический чехол на тапочке с помощью монтажного материала.

5. Реакции анализа на бесконтактное лигирование

ПРИМЕЧАНИЕ: Все используемые реагенты входят в наборы PLA (Таблица материалов). Рекомендуется использовать 40 мкл реагента на 1 см² ткани. Все инкубации должны проводиться во влажной среде, чтобы предотвратить чрезмерное испарение. Не допускайте пересыхания образца, так как это может привести к появлению фонового шума. Рекомендуется использовать 1x буфер A (буфер для промывки на месте , Таблица материалов) для промывки в банках. Минимальный объем должен составлять 70 мл при инкубации образцов при перемешивании. Перед использованием образцы следует хранить в RT.

1. Гашение пероксидазой
   1. Разграничьте область реакции с помощью гидрофобной ручки, чтобы предотвратить чрезмерное испарение раствора во время эксперимента. Добавьте по одной капле раствора перекиси водорода на 1 см² каждого образца. Инкубировать в течение 5 минут при RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется оптимизировать время инкубации в соответствии с используемыми образцами/антителами.
2. Блокировка
   1. Аккуратно капните буфер А на образцы и промойте в буфере А при 50 об/мин при перемешивании в течение 5 минут при RT.
   2. Постучите оставшийся буфер А и добавьте одну каплю на 1 см² раствора для блокировки (входит в комплект PLA). Выдерживать в течение 30 минут при температуре 37 °C.
3. Первичная инкубация антител
   1. Разведите два первичных антитела в подходящих концентрациях в разбавителе антител.
   2. Снимите блокирующий раствор со стекол и сразу же добавьте первичный раствор антитела (входит в комплект PLA). Выдерживать в течение 1 ч в камере с влажностью при температуре 37 °C.
4. Инкубация зонда PLA
   1. Разведите зонд PLA PLUS (1:5) зондом PLA минус (1:5) в разбавителе антител.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для реакции объемом 40 мкл рекомендуется использовать 8 мкл зонда PLA минус запас (5x), 8 мкл зонда PLA плюс запас (5x) и 24 мкл разбавителя антител.
   2. Аккуратно капните буфер А на образцы и промойте в буфере А при 50 об/мин в течение 5 минут при RT.
   3. Постучите по оставшемуся буферу А и нанесите раствор зонда PLA (входит в комплект PLA) на образцы. Выдерживать в течение 1 ч при 37 °C.
5. Лигатура
   1. Разморозьте буфер для лигирования (входящий в комплект PLA) перед следующими этапами.
   2. Аккуратно капните буфер А на образцы и промойте в буфере А при 50 об/мин в течение 5 минут при RT.
   3. Разбавьте 5-кратный буфер для лигирования (1:5) (входит в комплект PLA) в воде высокой чистоты. Добавьте лигазу (1:40) (входит в комплект PLA) непосредственно перед добавлением ее в образец.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется добавить 8 мкл 5-кратного лигионного буфера в 31 мкл воды высокой чистоты для реакции 40 мкл. Затем добавьте 1 мкл лигазы.
   4. Постучите по оставшемуся буферу А и нанесите раствор лигазы на образцы. Выдерживать в течение 30 минут при температуре 37 °C.
6. Усиление
   1. Разморозьте буфер усиления перед выполнением следующих действий.
   2. Аккуратно капните буфер А на образцы и промойте в буфере А при 50 об/мин в течение 2 минут при RT.
   3. Разбавьте 5-кратный амплификационный буфер (1:5) (входит в комплект PLA) в воде высокой чистоты. Добавьте полимеразу (1:80) (входит в комплект PLA) непосредственно перед тем, как аккуратно капнуть ее на образец.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется добавить 8 мкл 5-кратного лигионного буфера в 31,5 мкл воды высокой чистоты для реакции 40 мкл. Затем добавьте 0,5 мкл лигазы.
   4. Постучите по оставшемуся буферу А и нанесите раствор для амплификации на образцы. Выдерживать в течение 2 ч при температуре 37 °C.
7. Обнаружение
   1. Аккуратно капните буфер А на образцы и промойте в буфере А при 50 об/мин в течение 2 минут при RT.
   2. Разбавьте 5-кратный буфер для обнаружения яркого поля (1:5) (входит в комплект PLA) в воде высокой чистоты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется добавить 8 μL 5x детектирующего буфера в 32 μL воды высокой чистоты для реакции 40 μL.
   3. Постучите по оставшемуся буферу A и нанесите раствор для обнаружения на образцы. Инкубировать в течение 1 ч при РТ.
8. Разработка субстрата
   1. Аккуратно капните буфер А на образцы и промойте в буфере А при 50 об/мин в течение 2 минут при RT.
   2. Разбавьте раствор субстрата путем разбавления реагентов субстрата A (1:70), B (1:100), C (1:100) и D (1:50) (входят в комплект PLA) в воде высокой чистоты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется добавить 0,6 мкл субстрата А, 0,4 мкл субстрата В, 0,4 мкл субстрата С и 0,8 мкл субстрата D в 37,8 мкл воды высокой чистоты для реакции объемом 40 мкл.
   3. Постучите по оставшемуся буферу А и нанесите раствор для амплификации на образцы. Инкубировать в течение 10 минут при RT.
9. Ядерное окрашивание
   1. Аккуратно капните дистиллированную воду на образцы и промойте в дистиллированной воде со скоростью 50 об/мин в течение 2 минут при RT.
   2. Слейте оставшуюся дистиллированную воду. Добавьте по одной капле ядерного красителя (входит в комплект PLA) на каждый образец размером 1 см² и инкубируйте в течение 2 минут при RT.
   3. Промойте предметные стекла под проточной водой из-под крана в течение 10 минут, чтобы пятно созрело и приобрело синюю окраску. Не используйте стоячую воду из-под крана.
10. Обезвоживание
    1. Инкубируйте предметные стекла в растворе, содержащем 96% этанол, дважды в течение 2 мин. Затем инкубируйте предметные стекла в растворе, содержащем 99,7% этанола, дважды в течение 2 мин.
    2. Инкубируйте предметные стекла в ксилоле в течение 10 минут. Затем переложите предметные стекла на свежий ксилол.
11. Монтаж слайдов
    1. Используйте минимальный объем неводной монтажной среды и наклейте покровное стекло поверх образца, следя за тем, чтобы пузырьки воздуха не попали под покровные стекла.
    2. Дайте предметным стеклам высохнуть, прежде чем анализировать их на светлопольном микроскопе.

6. Визуализация для локализации

1. Получение изображений с помощью вертикального микроскопа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании визуализация предметных стекол проводилась под вертикальным светлопольным микроскопом (Таблица материалов). Изображения были получены в идентичных условиях при 40-кратном увеличении не менее чем в 10 случайно выбранных полях зрения автоматическим способом. Рекомендуется анализировать минимум 500 клеток на одно условие.

7. Анализ для количественной оценки

ПРИМЕЧАНИЕ: Количественная оценка образцов проводилась с использованием программного обеспечения ImageJ⁸. FIJI, дистрибутив ImageJ, включающий ImageJ и другие предустановленные плагины, был использован для последующих анализов ^9,10.

1. Чтобы определить количество точек:
   1. Откройте изображение.
   2. Выполните деконволюцию цвета. Для этого нажмите на Изображение > Цвета > Деконволюция цвета.
   3. Выберите изображение: - (color_1) в имени файла.
   4. Используйте команду Find Maxima для определения количества точек (Process > Find Maxima).
2. Чтобы определить количество ячеек:
   1. Откройте изображение.
   2. Выполните деконволюцию цвета. Для этого нажмите на Изображение > Цвета > Деконволюция цвета.
   3. Выберите изображение: - (color_1) в имени файла.
   4. Найдите пороговое значение, показывающее максимальное количество ядер. Для этого нажмите на Изображение > Яркость/Контрастность > порог.
   5. Заполните дыры, нажав на кнопку «Обработать > двоичные файлы > заполнить дыры».
   6. Используйте команду watershed для разделения соединенных компонентов на отдельные. Нажмите на кнопку Процесс > двоичном > водоразделе.
   7. Проанализируйте частицы, чтобы определить количество ядер, нажав на «Анализ» > «Анализ частиц».

Results

Используя описанную выше процедуру, можно обнаружить и количественно определить метилирование представляющего интерес белка. Здесь мы покажем пример метилирования GR с помощью PRMT5. Антитела и экспериментальные условия для PLA ранее были применены к клеткам¹⁰. Вкратце, первичные антитела, нацеленные на GR и SDMA, распознаются бесконтактными зондами, конъюгированными с комплементарными олигонуклеотидами. Затем происходит гибридизация кольцевого зонда ДНК, когда белки находятся в непосредственной б...

Discussion

Метилирование аргинина, как и других ПТМ, способствует тонкой регуляции функций белка. Однако его влияние недооценивается из-за сложности оценки этих модификаций, в первую очередь из-за нехватки инструментов. Это особенно верно при изучении метилирования in vivo, где единственным способом измерения метилирования аргинина является обладание специфическими антителами, распознающими метилированный остаток интересующего белка. Это, безусловно, является ограничением, поскольку метили...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Адгезионные слайды TOMO 90°, x100	VWR	631-1239
антитело против GR (мышь)	Santa Cruz	sc393232
антитело против GR (мышь)	Santa Cruz	sc393232
антитело против PRMT5 (кролик)	Merck	07-405
антитело против SDMA (кролик)	CST	13222
Automate d'include	Leica	ASP 6025	Парафиновая инфильтрация и блок-препарирование
Автоокрашиватель XL	Leica	ST5010	Автоокрашиватель
Кассеты Q path macrostar III  x1500	VWR	720-2233
CC1	Roche	5279801001
Цитратный буфер pH 6 10x, 100 мл mmf		f/T0050
Разбавитель антител Dako	Dako Agilent	S202230-2	разбавитель антител
Discovery ChromoMap Diaminobenzidine (DAB)	kit Roche	760-159	Diaminobenzidine (DAB) kit
Discovery Wash	Roche	7311079001
Duolink insitu  Зонд PLA антимышиный минус	Sigma-Aldrich	DUO92004	PLA  kit (зонд анти-кролик минус)
Duolink insitu detection reagents brightfield	Sigma-Aldrich	DUO92012	PLA  kit (реагенты для обнаружения in situ)
Duolink insitu PLA probe anti-rabbit plus	Sigma-Aldrich	DUO92002	PLA  kit (зонд против кролика плюс)
Duolink insitu wash buffer brightfield	Sigma-Aldrich	DUO82047	PLA  kit (буфер для промывки in situ)
Этанол 96% VOL TECHNISOLV, 5 л	VWR	83804.360
Абсолютный этанол ≥ 99,8%, AnalaR NORMAPUR ACS,  5 л	VWR	20821.365
EZ Prep 10x	Roche	5279771001
Formol, готовый к использованию, 5 л	MMF	F/40877-36	Формалин
Полностью автоматизированная стеклянная туфелька	Leica	CV5030	автоматизированная покровная туфля
Стеклянные покровные туфли 24 x 40	Dutscher	100037
гематоксилина	Ventana	760-2021
IHC прибор	Roche	DISCOVERY XT	Автоматизация IHC
LCS	Roche	5264839001
Microtome	Thermo Scientific	Microm HM340E	Резка тканей в том числе в блоках
Монтаж Medium Pertex	Histolab	00801-FR
PAP Pen для иммуноокрашивания	Sigma-Aldrich	Z672548-1EA
Парафиновый воск tek III, 4 x 2, 5 кг	Sakura	4511
Пастер Одноразовые пипетки	Fisher Scientific	12583237
PBS Buffer 10x, 100 мл	MMF	f/T0020
Реакционный буфер 10x	Roche	5353955001
Ribo Wash 10x	Roche	5266262001
RiboCC1	Roche
Вторичное антитело против мыши	Abcam	ab133469
Вторичное антитело OmniMap против кролика HRP	Roche	760-4311
Центр встраивания тканей	MMF	EC 350
Ксилол (смесь изомеров) ≥ 98.5%, AnalaR NORMAPUR ACS, 5 л	VWR	28975.360
Zeiss Axio Imager M2 микроскоп			вертикальный светлопольный микроскоп