Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Усиление тирамидного сигнала для иммунофлуоресцентного окрашивания ZBP1-зависимого фосфорилирования RIPK3 и MLKL после инфекции HSV-1 в клетках человека

2.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64332

⸱

20 октября 2022 г.

 ,  ,  , 
1VIB-UGent Center for Inflammation Research, 2Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University

В этой статье

Краткое содержание

Усиление тирамидного сигнала во время иммунофлуоресцентного окрашивания позволяет чувствительно обнаруживать фосфорилированные RIPK3 и MLKL во время ZBP1-индуцированного некроптоза после инфекции ВПГ-1.

Аннотация

Киназна-взаимодействующая с рецептором серин/треонин протеинкиназа 3 (RIPK3) и ее субстрат смешанной линии киназы доменной (MLKL) являются критическими регуляторами некроптоза, воспалительной формы гибели клеток с важными противовирусными функциями. Аутофосфорилирование RIPK3 индуцирует фосфорилирование и активацию порообразующего белка-палача некроптоза MLKL. Незаконный оборот и олигомеризация фосфорилированного МЛКЛ на клеточной мембране приводит к лизису клеток, характерному для некроптотической гибели клеток. Датчик нуклеиновых кислот ZBP1 активируется путем связывания с левосторонней Z-формой двухцепочечной РНК (Z-РНК) после заражения РНК и ДНК-вирусами. Активация ZBP1 ограничивает вирусную инфекцию, вызывая регулируемую гибель клеток, включая некроптоз, инфицированных клеток-хозяев. Иммунофлуоресцентная микроскопия позволяет визуализировать различные сигнальные стадии после ZBP1-опосредованного некроптоза на клеточной основе. Однако чувствительность стандартной флуоресцентной микроскопии с использованием современных коммерчески доступных фосфоспецифических антител против человека RIPK3 и MLKL исключает воспроизводимую визуализацию этих маркеров. Здесь мы описываем оптимизированную процедуру окрашивания сериновых (S) фосфорилированных RIPK3 (S227) и MLKL (S358) в клетках HT-29 человека, инфицированных вирусом простого герпеса 1 (HSV-1). Включение стадии усиления тирамидного сигнала (TSA) в протокол иммунофлуоресцентного окрашивания позволяет специфически обнаруживать фосфорилированный RIPK3 S227. Кроме того, TSA значительно повышает чувствительность обнаружения фосфорилированного MLKL S358. Вместе этот метод позволяет визуализировать эти два критических сигнальных события во время индукции некроптоза, индуцированного ZBP1.

Введение

Рецептор-взаимодействующая серин/треонин протеинкиназа 3 (RIPK3) и доменная диназа смешанной линии (MLKL) являются центральными регуляторами некроптотической гибели клеток 1,2. Некроптоз является литической и воспалительной формой регулируемой гибели клеток, участвующей в противовирусном иммунитете и аутовоспалении. Некроптоз инфицированных вирусом клеток немедленно отключает репликацию вируса. Лизис клеток после индукции некроптоза также высвобождает связанные с повреждением молекулярные паттерны, которые стимулируют противовирусный иммунитет 3,4. Некроптоз инициируется активацией RIPK3 после опосредованного мотивом гомотипического взаимодействия RIP (RHIM) с одной из трех восходящих активирующих молекул: RIPK1 (при вовлечении рецептора TNF 1 [TNFR1]), TIR-доменсодержащим адаптером, индуцирующим интерферон-β (TRIF; при вовлечении Toll-подобных рецепторов 3 и 4) или датчиком противовирусной нуклеиновой кислоты Z-ДНК-связывающим белком 1 (ZBP1)1,2 . Передача сигналов некроптоза протекает через серию событий фосфорилирования, начиная с автофосфорилирования RIPK3. Аутофосфорилирование человеческого RIPK3 при серине (S)227 внутри его киназного домена является предпосылкой для некроптоза, обеспечивая взаимодействие с MLKL, и обычно используется в качестве биохимического маркера активации RIPK3 человека и некроптотической гибели клеток 1,5. После активации RIPK3 фосфорилирует цикл активации MLKL при треонине (T)357 и S3581. Это вызывает изменение конформации MLKL, что приводит к воздействию N-концевого домена четырехспирального пучка спирали. Затем MLKL олигомеризуется и транспортируется к клеточной мембране, где он образует пору через вставку открытых четырех пучков спирали в липидный бислой, что в конечном итоге приводит к гибели клеток 2,6.

ZBP1 - это датчик противовирусных нуклеиновых кислот, который распознает левосторонние Z-образные нуклеиновые кислоты, включая двухцепочечную РНК в Z-конформации (Z-РНК). Связывание Z-РНК происходит через два Zα-домена, расположенных на N-конце ZBP1. Считается, что Z-РНК, накапливающаяся во время заражения РНК и ДНК вирусами, напрямую влияет на ZBP1 7,8. Активированный ZBP1 набирает RIPK3 через свои центральные RHIM и индуцирует регулируемую гибель клеток, включая некроптоз 9,10. Вирусы приняли многочисленные механизмы побега для противодействия ZBP1-индуцированному некроптозу клеток-хозяев11. Например, вирус простого герпеса 1 (ВПГ-1) рибонуклеотидредуктазы субъединицы 1, известный как ICP6 и кодируемый UL39, содержит RHIM на своем N-конце, который препятствует ZBP1-опосредованной активации RIPK3 в клетках человека 12,13,14,15. ZBP1 не только ограничивает репликацию вируса, но исследования на мышах показали, что активация ZBP1 вызывает воспалительные заболевания и стимулирует раковый иммунитет 16,17,18,19,20,21. Поэтому протоколы, которые обнаруживают сигнальные события, происходящие во время ZBP1-индуцированного некроптоза в клетках человека, ценны для оценки роли ZBP1 в этих процессах.

Амплификация тирамидного сигнала (TSA), также называемая катализируемым репортерным осаждением (CARD), была разработана для улучшения предела обнаружения и отношения сигнал/шум в иммуноанализах на основе антител. Во время TSA любое первичное антитело может быть использовано для обнаружения интересующего антигена. Пероксидаза хрена (HRP) в сочетании со вторичным антителом катализирует местное накопление биотинилированных тирамидных радикалов в присутствии перекиси водорода. Эти активированные биотин-тирамидные радикалы затем реагируют с проксимальными остатками тирозина с образованием ковалентных связей. Потенциальные тирамидно-биотиновые субстраты включают сам антиген, первичные и вторичные антитела и соседние белки. Таким образом, в то время как TSA значительно улучшает чувствительность анализа, часть его пространственного разрешения теряется. На заключительном этапе молекулы биотина обнаруживаются с использованием флуоресцентно меченого стрептавидина. Реакция HRP откладывает много молекул тирамида-биотина на интересующем антигене или рядом с ним. Это значительно увеличивает количество сайтов связывания стрептавидин-фторхром, тем самым значительно усиливая чувствительность анализа (рисунок 1). Альтернативно, тирамид может быть непосредственно соединен с фторхромом, устраняя необходимость в флуорофорах, связанных со стрептавидином. Иммуногистохимия белка и гибридизация ДНК/РНК in situ были одними из первых методов, с помощью которых TSA был использован для улучшения интенсивности сигнала22,23. Совсем недавно TSA был объединен с внутриклеточной проточной цитометрией24 и масс-спектрометрией25.

Здесь мы представляем протокол для обнаружения серина 227 фосфорилированного человеческого RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) и фосфорилированного человеческого MLKL (p-MLKL [S358]) при активации ZBP1 инфекцией HSV-1 с использованием иммунофлуоресцентной микроскопии. Мы используем чувствительную к некроптозу клеточную линию колоректальной аденокарциномы человека HT-29, которая была трансдуцирована для стабильной экспрессии человеческого ZBP1. Эти клетки были инфицированы штаммом HSV-1, экспрессирующим мутантный белок ICP6 (HSV-1 ICP6mutRHIM), в котором четыре основные аминокислоты в вирусном RHIM (VQCG) были заменены аланинами (AAAA), тем самым делая ICP6 неспособным блокировать ZBP1-опосредованный некроптоз 13,14,15. Чтобы преодолеть проблему низкого отношения сигнал/шум коммерчески доступных в настоящее время антител, направленных против p-RIPK3 и p-MLKL в иммуноокрашивании26, мы выполняем стадию усиления тирамидного сигнала (TSA) (рисунок 1), которая приводит к надежному обнаружению человеческого p-RIPK3 (S227) и улучшает чувствительность обнаружения p-MLKL человека (S358) на порядок.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Получение биотинилированного тирамида

  1. Готовят биотинилированный тирамид, начиная с биотин-тирамида. Чтобы сделать 10 мМ запасного раствора, растворить 3,6 мг биотин-тирамида в 1 мл ДМСО. Хранить растворенный продукт в аликвотах при −20 °C для сохранения качества.

2. Поддержание клеток HT-29 в культуре

ПРИМЕЧАНИЕ: ZBP1-экспрессирующие HT-29 были сгенерированы трансдукцией с лентивектором27 , кодирующим человеческий ZBP1.

  1. Храните ZBP1-экспрессирующие клетки HT-29 в среде McCoy 5A, дополненной L-глутамином, пируватом натрия и 10% фетальной бычьей сывороткой (отныне называемой полной средой) и поддерживайте в инкубаторе при 37 ° C с 5% углекислого газа. В идеале используйте ячейки с низким проходным числом (менее 10). Оставьте клетки восстанавливаться в течение как минимум 5 дней после цикла оттаивания до начала эксперимента.
  2. Чтобы отсоединить клетки от колбы для культивирования, удалите среду и промыть клетки 5 мл PBS (предварительно нагретым до 37 °C). Затем добавьте соответствующее количество трипсина/ЭДТА (0,05% трипсина и 0,032% ЭДТА, соответственно, предварительно нагретого до 37 °C) в клетки (2 мл для колбы T75, 3 мл для колбы T175).
  3. Инкубировать клетки с трипсином/ЭДТА в течение 10 мин в инкубаторе при 37 °C с 5% углекислого газа. После этого коснитесь колбы и визуально проверьте, отделились ли клетки от колбы с помощью микроскопа с объективным увеличением 4x-20x.
  4. Если клетки не полностью отсоединены, инкубируют еще 5 мин при 37 °C. Когда клетки отделяются, остановите ферментативную реакцию, добавив 6 мл полной среды в колбу.
  5. Соберите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл. Подсчитайте клетки, используя синее пятно трипана для оценки жизнеспособности; рекомендуется разведение 1:5. Приступайте к эксперименту только в том случае, если жизнеспособность клеток превышает 90%.

3. Начало эксперимента, посев и стимуляция клеток

  1. Посейте 90 000 ZBP1-экспрессирующих клеток HT-29 в полной среде в пластине скважины площадью 1 см², которая позволяет проводить микроскопию высокого класса. Используйте конечный объем 200 мкл на скважину.
  2. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 °C с 5% углекислого газа. Примите во внимание, что некоторые дополнительные колодцы должны быть засеяны для контроля окрашивания, что более подробно объясняется на этапе 5.6.
  3. Когда клетки достигнут 70%-80% конфлюзии, добавьте к клеткам стимул, вызывающий некроптоз. Здесь клетки были инфицированы HSV-1 ICP6mutRHIM (кратность инфекции [MOI] 5, определяемая как бляшеобразующие единицы (pfu), разделенные на количество клеток; pfu количественно оценивали с помощью анализа бляшек на клетках Vero) в течение 6 ч, 8 ч или 10 ч.
  4. В качестве положительного контроля индукции некроптоза стимулируют клетки в течение 4 ч с помощью вызывающего некроптоз коктейля, содержащего 30 нг/мл TNF, 20 мкМ ингибитора панкаспазы zVAD-fmk и 5 мкМ миметического BV6 SMAC.
  5. В качестве отрицательного контроля для окрашивания p-RIPK3 (S227) включают GSK'840 (1 мкМ) для ингибирования активности киназы RIPK3 и предотвращения аутофосфорилирования S227. В идеале добавляют ингибитор в необработанном состоянии и после стимуляции некроптоза. Ингибитор может быть добавлен одновременно с вирусной инфекцией.
  6. Подготовьте стимуляцию в полной среде, предварительно разогретой до 37 °C. Используйте конечный объем 200 мкл на лунку для всех стимуляций.

4. Фиксация ячеек

  1. Удалите среду и промыть клетки 200 мкл 1x PBS. Затем добавляют в клетки 150 мкл 4% PFA (уже уравновешенного при комнатной температуре) и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы используете ячейки, которые легко отсоединяются, фиксация ячеек может быть оптимизирована следующим образом. Извлеките из скважины 100 мкл среды, чтобы на пластине остался объем 100 мкл. Добавьте 100 мкл 4% PFA к клеткам. Инкубировать клетки в течение 5 мин при комнатной температуре. После этого удалите среду/фиксатор из скважин и замените 150 мкл 4% PFA. Инкубируйте клетки еще 20 мин при комнатной температуре, чтобы обеспечить полную фиксацию клеток.
  2. После фиксации удалите 4% PFA и промыть ячейки 3x с 200 мкл 1x PBS. Образцы могут храниться в избытке (>200 мкл) 1x PBS при 4 °C в течение ночи до дальнейшей обработки.

5. Пермеабилизация и первичное окрашивание

  1. Удалите PBS и добавьте 100 мкл буфера пермеабилизации (0,5% Triton X-100 в PBS). Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин.
  2. Удалите буфер проницаемости и, впоследствии, промыть скважины 100 мкл промывочного буфера (0,1% Triton X-100 в PBS). Инкубируйте камеру визуализации с буфером промывки в течение 5 мин при комнатной температуре на наклонном лабораторном шейкере (20-30 качающихся движений в минуту).
  3. Для предотвращения неспецифического связывания первичных антител добавляют 100 мкл блокирующей среды и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч. Альтернативно, этот блокирующий шаг может быть заменен блокировкой 3% BSA, 0,1% Triton-X-100 в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре.
  4. Промывайте скважины 3x со 100 мкл промывочного буфера (0,1% Triton X-100 в PBS). Инкубируйте шаги промывки в течение 5 мин при комнатной температуре на наклонном лабораторном шейкере.
  5. После удаления буфера промывки добавьте первичные антитела в камеру визуализации и инкубируйте в течение ночи при 4 °C. Используйте конечный объем 100 мкл для покрытия скважины. Во время ночной инкубации при 4°C не размещайте камеру визуализации на наклонном лабораторном шейкере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анти-p-MLKL (S358; разбавление: 1:200) и анти-p-RIPK3 (S227; разбавление: 1:200) разделяют кролика в качестве вида-хозяина и поэтому не должны комбинироваться в одной лунке. Для мониторинга вирусной инфекции комбинируйте первичное антитело против вирусного белка по выбору с p-MLKL (S358) или p-RIPK3 (S227). Здесь клетки были инфицированы инфекцией ВПГ-1 с последующим окрашиванием ICP0 (разведение: 1:50, вид хозяина: мышь).
  6. Примите во внимание необходимые элементы управления окрашиванием на этом этапе. Всегда включайте состояние отсутствия первичных антител для визуализации потенциального фона стадии амплификации TSA для установки порога маскировки (см. шаг 9).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В случае протокола совместного окрашивания (например, комбинирования p-MLKL [S358] или p-RIPK3 [S227] с антителом против вирусного белка) также используйте одиночные пятна. Использование одиночных пятен важно для коррекции потенциального сквозного сигнала в других каналах визуализации.

6. Усиление тирамидного сигнала (TSA)

  1. Удалить первичную смесь антител и промыть колодцы в 3 раза со 100 мкл промывочного буфера (0,1% Triton X-100 в PBS). Инкубируйте шаги промывки в течение 5 мин при комнатной температуре на наклонном лабораторном шейкере.
  2. Удалите промывочный буфер и добавьте 100 мкл меченого HRP вторичного антитела, распознающего вид первичного антитела, которое необходимо усилить. Для усиления сигнала p-RIPK3 (S227) или p-MLKL (S358) добавьте 100 мкл анти-rabbit-HRP и инкубируйте в течение 30 мин при комнатной температуре на наклонном лабораторном шейкере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будет усилен только p-MLKL (S358) или p-RIPK3 (S227). Окрашивание вирусного белка будет визуализироваться с помощью стандартного метода косвенного окрашивания.
  3. После этого промывайте скважины 3x 100 мкл промывочного буфера (0,1% Triton X-100 в PBS). Инкубируйте шаги промывки в течение 5 мин при комнатной температуре на наклонном лабораторном шейкере.
  4. На следующих этапах добавьте биотинилированный тирамид к микроскопической пластине. Используя HRP-группу, связанную со вторичными антителами, ферментативная реакция вызовет образование тирамидных радикалов в непосредственной близости от первичной мишени (здесь p-MLKL [S358] или p-RIPK3 [S227]).
  5. Чтобы активировать ферментативную активность HRP, добавляют окисляющий субстрат вместе с биотинилированным тирамидом. Для достижения этой цели дополните буфер TSA (0,1 М борной кислоты [рН 8,5]) 0,03 М H2O2; в частности, возьмите 5 мл буфера TSA и добавьте 5 мкл 30% H2O2.
  6. Теперь разбавьте биотин-тирамид вH2O 2-дополненномбуфером TSA в диапазоне от 1:1000 до 1:20 000.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент разбавления биотин-тирамида должен быть оптимизирован для каждой партии.
  7. Извлеките промывочный буфер из скважин и добавьте в скважины разбавленный биотин-тирамид до конечного объема 100 мкл. Инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин на наклонном лабораторном шейкере.
  8. Далее промываем скважины 3x со 100 мкл промывочного буфера (0,1% Triton X-100 в PBS). Инкубируйте шаги промывки в течение 5 мин при комнатной температуре на наклонном лабораторном шейкере.

7. Флуорофоры

ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку сигнал первичного антитела преобразуется в биотин-группу, p-MLKL (S358) и p-RIPK3 (S227) визуализируются с помощью стрептавидина, связанного с флуорофором (флуорофор 568, разведение: 1:500). Кроме того, ядра окрашиваются DAPI (5 мкг/мл). Если вирусный белок включен в протокол окрашивания, включите подходящее флуоресцентно меченое вторичное антитело против вида хозяина вашего первичного антитела. В репрезентативных результатах использовался мышиный анти-ICP0. В качестве вторичного антитела была включена козья антимышка, связанная с флуорофором 633 (разведение: 1:1000).

  1. Внесите окрашивающую смесь в буфер для стирки (0,1% Triton X-100 в PBS), содержащую антитела и пятна, упомянутые выше. Снимите буфер для стирки, добавьте 100 мкл смеси для окрашивания и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 ч на наклонном лабораторном шейкере. Держите камеру визуализации защищенной от света с этого шага вперед.
  2. Далее промываем скважины 2х с промывочным буфером (0,1% Triton X-100 в PBS). Инкубируйте шаги промывки в течение 5 мин при комнатной температуре на наклонном лабораторном шейкере.
  3. Наконец, промыть скважины 2x с 1x PBS. Храните образцы в избытке (> 200 мкл) 1x PBS до получения изображения. В качестве альтернативы, погружайте образцы в монтажную среду, чтобы сохранить окрашивание. Камера визуализации теперь готова к визуализации на конфокальном микроскопе.

8. Визуализация с помощью конфокального микроскопа

  1. Включите конфокальный микроскоп и лазеры не менее чем за 10 минут до получения изображения.
  2. Используйте цель погружения для чувствительности. Предпочтительно использовать 40-кратное или 63-кратное объективное увеличение. Перед визуализацией очистите погружные объективы с помощью очистителя линз с помощью соответствующих ватных шариков. Грязные цели (например, из-за пыли) могут привести к снижению качества изображения.
  3. Поместите избыточное количество масла на дно камеры визуализации. Кроме того, добавьте каплю масла на цель выбора.
  4. Поместите камеру визуализации на микроскоп. Найдите поле фокусировки с помощью окрашивания DAPI или с помощью визуализации яркого поля. При необходимости перемещайтесь по камере визуализации, чтобы обеспечить правильное распределение погружного масла.
  5. Настройте необходимые дорожки визуализации на микроскопе. В зависимости от микроскопа следующие шаги могут варьироваться (таблица 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При настройке треков визуализации запрограммируйте дорожки таким образом, чтобы ядерное окрашивание измерялось последним. Лазер 405 нм может способствовать фотоотбеливанию и, таким образом, потере определенного сигнала во всех каналах.
  6. Чтобы проанализировать всю ячейку на наличие p-RIPK3 (S227) или p-MLKL (S358), измерьте z-стеки, которые охватывают высоту ячейки. Здесь z-стеки были сделаны из 40 срезов каждые 0,16 мкм, что привело к диапазону 6,22 мкм.

ДорожкаЛазерСветоделительФильтр
pRIPK3 (S227) /pMLKL (S358)561МБС -405 +BP 570-620 + LP645
MBS 488/561/633 + SBS с пакетом обновления 615 (SP615)
Вирусный ген: ICP0633МБС -405 +ВР 420-480 + LP605
MBS 488/561/633 + SBS LP570
Ядро: DAPI405МБС -405 +ВР 420-480 + ВР 495-550
МБС 488/561/633

Таблица 1: Визуальные дорожки для визуализации клеток.

9. Анализ и количественная оценка данных

  1. Загрузите микроскопические изображения в программное обеспечение. Используйте расширенный фокус для визуализации всей информации z-стека в 2D-изображении.
  2. Затем запрограммируйте протокол анализа, чтобы извлечь следующую информацию: количество ячеек на изображение, сумму вокселей, показывающих окрашивание p-RIPK3 (S227)+ или p-MLKL (S358)+ . Воксель представляет собой трехмерный объем, определяемый как трехмерный эквивалент пикселя.
  3. Чтобы количественно оценить количество клеток на изображении, сегментируйте ядро. Чтобы уменьшить шум в результатах сегментации, добавьте ограничение по размеру сегментации (>100 мкм³). Количество сегментированных ядер представляет собой количество клеток на изображении.
  4. Для количественной оценки количества вокселей p-RIPK3 (S227)+ или p-MLKL (S358)+ запрограммируйте сегментацию на основе пороговых значений. Установите порог таким образом, чтобы сигнал не улавливался на изображениях без первичных антител (NP).
  5. Далее адаптируйте порог, используя изображения из необработанного имитационного состояния. Чтобы обеспечить чувствительное обнаружение увеличения сигнала из-за стимуляции некроптоза, ограничьте прием вокселей p-RIPK3 (S227)+ или p-MLKL (S358)+ в имитационных условиях, установив более высокий порог. Всегда проверяйте запрограммированный протокол анализа на нескольких изображениях из имитационного состояния и вирусной инфекции, вызывающей некроптоз.
  6. Выполните анализ всех наборов изображений. Экспортируйте квантовую оценку вокселя и сегментацию ядра в файл .txt для дальнейшей обработки в программном обеспечении для работы с электронными таблицами.
  7. Составьте сводную таблицу данных, показывающую имя изображения, количественную оценку ядра и сумму обнаруженных вокселей.
  8. Затем разделите сумму положительных вокселей на количество ячеек на изображении. Это приводит к относительному значению положительных вокселей на клетку. Чтобы визуализировать увеличение складки, разделите относительное значение p-RIPK3 (S227)+ или p-MLKL (S358)+ вокселей на ячейку на медиану необработанного состояния (макет).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Иммунофлуоресцентное обнаружение фосфорилирования MLKL и особенно фосфорилирования RIPK3 в клетках человека технически сложно26. Здесь мы представляем улучшенный протокол окрашивания для человека p-RIPK3 (S227) и p-MLKL (S358) при активации ZBP1. Протокол включает в себя шаг TSA для улучшения предела обнаружения и чувствительности флуоресцентных сигналов. Для валидации метода было проведено параллельное сравнение TSA-опосредованной иммунофлуоресценции со стандартным непрямым флуоресцентным окрашив...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол иммунофлуоресцентного окрашивания описывает использование амплификации тирамидного сигнала (TSA) для повышения чувствительности к сигнальным событиям некроптотического сигнального пути человека, которые трудно обнаружить, включая фосфорилирование RIPK3 и MLKL26. Включение ступени TSA значительно улучшает порог обнаружения p-RIPK3 (S227) и p-MLKL (S358) и повышает чувствительность p-MLKL (S358) деформации. TSA выявила сигнал p-RIPK3 (S227), уже присутствующий в образцах, обработанных ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить VIB Bioimaging Core за обучение, поддержку и доступ к инструментальному парку. J.N. поддерживается стипендией PhD от Исследовательского фонда Фландрии (FWO). Исследования в группе J.M. были поддержаны грантом Odysseus II (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), грантом для младших исследователей (G031022N) от Исследовательского фонда Фландрии (FWO), грантом CRIG для молодых исследователей, доказательством концепции, а также Гентским университетом. Исследования в группе P.V. были поддержаны EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), старшими исследовательскими грантами FWO (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Фондом против рака (F/2016/865, F/2020/1505), консорциумами CRIG и GIGG и VIB.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильные>антитела
кролика HRPAgilent Technologies БельгияK4002Envision+ Система-HRP меченый полимер против кролика
козы против мыши DyLight 633Thermofisher35513Второе антитело
HSV-1 ICP0Santa Cruzsc-53070Мышиное антитело
против ICP0 (HSV-1) антителаМышиная сыворотка IAV-PR8Собственное производствоxxМышиное анти-IAV-PR8 поликлональное антитело
pMLKLAbcamab187091Кролик анти-MLKL-фосфо S358 антитело
pRIPK3Abcamab209384Кролик анти-RIPK3-фосфо S227
антителоFluorophores
DAPIThermofisherD21490Для визуализации ядра клеток
стрептавидин соединен с Alexa Fluor 568ThermofisherS11226Для визулализации молекул биотина
<сильно>соединений
30% H<суб>2O<суб>2сигмаH1009Окислительный субстрат, необходимый для активности HRP
4% PFASANBIO AR1068Для фиксации/сшивания клеток
БиотинилтирамидR& D Systems6241Для усиления сигнала, подложка HRP
BV-6SelleckchemS7597BV6 IAP Ингибитор
         Для клеточной культуры: для отделения клеток
         8,0 г/л NaCl
         0,4 г/л динатриевой соли ЭДТА
ЭДТА 0,04%Собственная формула1,1 г/л Na2HPO4
         0,2 г/л NaH2PO4
         0,2 г/л KCl
         0,2 г/л глюкозы
Фетальная бычья сывороткаTICOFBS EU XXXДля клеточной культуры, поддерживающей клеточную культуру; номер партии: 90439
GSK'840AobiousAOB0917ингибитор киназы RIPK3
L-глутаминSigma-AldrichG7513Для клеточной культуры, поддержания клеточной культуры
MAXblockActive Motif15252Блокирующий раствор
PBSGibco
Пируват натрияSigma-AldrichS8636Для клеточной культуры, поддержания клеточной культуры
TNF-αВ собственномпроизводстве-Сигнальная молекула, способная вызывать гибель клеток в комбинации с BV6 и zVAD
Triton X-100Sigma AldrichT8787-50MLДля проникновения в клетки
Trypan blueMerck11732Для подсчета клеток, используется в качестве маркера живых/мертвых в 0,1%
ТрипсинSigma-AldrichT4424Для клеточной культуры: для отделения клеток
zVADBachemBACE4026865.0005Z-Val-Ala-DL-Asp-фторметилкетон
Material
µ-Slide 8 лунок высокое стеклянное дноiBidi80807Для культивирования клеток
Вата Препинг Шарики размером со средуЭлектронная микроскопия Науки71001-10Для очистки объективов
Immersol 518 F/30 ° CZEISS444970-9000-000Для визуализации образца при большом увеличении
Очиститель объективаZEISS000000-0105-200Для очистки объективов
Конфокальный микроскопДля визуализации образца
Software
ExcelOfficexxДля обработки данных
Prism 9GraphpadxxДля анализа данных - статистическое тестирование и генерация графиков
Volocity 6.3VolocityxxДля выполнения количественных оценок
Zen blackZEISSxxДля получения и обработки изображений
Zen blueZEISSxxДля визуализации изображений
Virus
Штамм HSV-1 (mutRHIM) F,полученный доктором Цзяхуай Ханьв собственной репликацииHSV-1 в качестве триггера для некроптоза; Основным доменом RHIM UL39/ICP6 является мутировавший (VQCG>AAAA)
HSV-1 (WT) штамм FПолучен доктором Цзяхуай Ханьв домашних условиях репликацияHSV-1 (WT) в качестве отрицательного контроля для индукции некроптоза (ингибирование ICP6)
IAV PR8в домашнем поголовьев домашних условиях репликацияIAV в качестве триггера для некроптоза
против10444402 LSM880 Fast Airyscan ,

Ссылки

  1. Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The regulation of necroptosis by post-translational modifications. Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).
  2. Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The structural basis of necroptotic cell death signaling. Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).
  3. Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense. Virology. 479-480, 160-166 (2015).
  4. Nailwal, H., Chan, F. K. Necroptosis in anti-viral inflammation. Cell Death & Differentiation. 26 (1), 4-13 (2019).
  5. Meng, Y., et al. Human RIPK3 maintains MLKL in an inactive conformation prior to cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 6783(2021).
  6. Samson, A. L., Garnish, S. E., Hildebrand, J. M., Murphy, J. M. Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling. Science Signalling. 14 (668), (2021).
  7. Koehler, H., et al. Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis. Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).
  8. Balachandran, S., Mocarski, E. S. Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death. Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).
  9. Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation. Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).
  10. Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. Nucleic acid sensors and programmed cell death. Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).
  11. Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis. Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).
  12. Guo, H., et al. Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells. Cell Host & Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).
  13. Yu, X., et al. Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1. Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).
  14. Huang, Z., et al. RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice. Cell Host & Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).
  15. Guo, H., et al. Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1. Cell Death & Disease. 9 (8), 816(2018).
  16. Devos, M., et al. Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation. The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913(2020).
  17. Jiao, H., et al. Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation. Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).
  18. de Reuver, R., et al. ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation. Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).
  19. Jiao, H., et al. ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1. Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).
  20. Hubbard, N. W., et al. ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology. Nature. 607 (7920), 769-775 (2022).
  21. Zhang, T., et al. ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis. Nature. 606 (7914), 594-602 (2022).
  22. Adams, J. C. Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).
  23. Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization. Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).
  24. Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry. Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).
  25. Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins. The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207(2020).
  26. Samson, A. L., et al. A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells. Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).
  27. De Groote, P., et al. Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells. Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).
  28. Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).
  29. Mandal, P., et al. RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity. Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).
  30. Zhang, T., et al. Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis. Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).
  31. Garnish, S. E., et al. Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 2211(2021).
  32. Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
  33. Parra, E. R., et al. Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies. Cancers. 12 (2), 255(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

ZBP1RIPK3MLKLHT 29
Усиление тирамидного сигнала для иммунофлуоресцентного окрашивания ZBP1-зависимого фосфорилирования RIPK3 и MLKL после инфекции HSV-1 в клетках человека
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.