Оптимизация параметров проточной цитометрической сортировки для высокопроизводительной изоляции и очистки малых внеклеточных везикул

Summary

Этот протокол обеспечивает быстрый и специфический по размеру метод выделения небольших внеклеточных везикул за счет оптимизации размера сопла для распыления воздуха, давления жидкости в оболочке, давления потока образца, напряжения, усиления и пороговых параметров запуска.

Abstract

Малые внеклеточные везикулы (sEV) могут высвобождаться из всех типов клеток и переносить белок, ДНК и РНК. Сигнальные молекулы служат индикаторами физиологического и патологического состояния клетки. Тем не менее, не существует стандартного метода выделения sEV, который препятствует последующей идентификации биомаркеров и исследованиям лекарственного вмешательства. В этой статье мы приводим подробный протокол выделения и очистки 50-200 нм sEV с помощью сортировщика проточных ячеек. Для этого было выбрано сопло 50 мкм и давление жидкости в оболочке 80 фунтов на квадратный дюйм для получения хорошей скорости сортировки и стабильного бокового потока. Микросферы полистирола стандартного размера использовались для обнаружения популяций частиц размером 100, 200 и 300 нм. С дополнительной оптимизацией порога срабатывания напряжения, усиления и прямого рассеяния (FSC) сигнал sEV может быть отделен от фонового шума. Эти оптимизации предоставляют панель критических настроек сортировки, которая позволяет получить репрезентативную популяцию sEV, используя только FSC по сравнению с боковым рассеянием (SSC). Метод выделения на основе проточной цитометрии не только обеспечивает высокопроизводительный анализ, но также позволяет проводить синхронную классификацию или протеомный анализ sEV на основе экспрессии биомаркеров, открывая множество последующих исследовательских приложений.

Introduction

Клетка высвобождает внеклеточные везикулы (ВВ) различных размеров, что приводит к появлению сигнальных молекул и мембранных включений, которые важны для межклеточной коммуникации¹. EV разных размеров также играют разные биологические роли: 50-200 нм sEV способны точно распределять РНК, ДНК и белки в правильном внеклеточном месте. sEV также помогает определить механизмы секреции, включающие не только регуляцию нормальных физиологических процессов, таких как иммунный надзор, поддержание стволовых клеток, свертывание крови и восстановление тканей, но и патологию, лежащую в основе нескольких заболеваний, таких как прогрессирование опухоли и метаста....

Protocol

1. Клеточная культура

1. Приготовьте питательную среду модифицированной орлиной среды (DMEM) Дульбекко с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS). Культивируйте раковую клетку поджелудочной железы человека, PANC-1, в колбе для культуры размером 75^см2 с плотностью 1 x 10⁶ клеток/мл. Инкубируют культуру при 37 °C с 5%_CO2.
2. Субкультурируйте клетки, когда плотность клеток достигает 75% -80% при микроскопическом наблюдении. Удалите среду и промойте 2 раза 3-5 мл фосфатного буферного физиологического раствора (PBS; 0,01 M, pH 7,2-7,4).
3. Откажитесь от раствора, добавьте 1-2 мл раствора три....

Results

Блок-схема экспериментального протокола показана на рисунке 1. В этом методе в качестве эталонов для распределения частиц по размерам использовались полистирольные микросферы стандартного размера. При определенных инструментальных параметрах сигнал частицы можно было четко отличить от фонового шума на графике FSC и SSC с использованием логарифмической формы. Стратегии стробирования показаны на рисунке 2. R4, R5 и R6 относятся к положениям микросфер 100 нм, 200 н.......

Discussion

В этом протоколе описывается оптимизированный метод выделения и очистки sEV с заданным размером частиц 50-200 нм с использованием сортировщика проточных ячеек, который был проверен NTA. Метод решил проблему узкого места получения sEV с однородным размером частиц и высокой чистотой, избегая интерференции со стороны неродственных биологических молекул, обернутых в крупногабаритные EV²². Быстрый и высокопроизводительный анализ возможен с помощью проточной цитометрии, которая может захватывать 100 000.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Центрифужная пробирка	Beckman Coulter	344058
Culture колбы	Corning
Дульбекко' s модифицированная орлиная среда	Corning Cellgro	10-013-CV
Фетальная бычья сыворотка	SUER	SUER050QY
Проточный сортировщик клеток	Beckman Coulter	Moflo Astrios EQ
Клетка рака поджелудочной железы человека, PANC-1	NA	NA	PANC-1 клетки были пожертвованы профессором Вэйцзюнь Янгом, Колледж наук о жизни, Чжэцзянский университет
Размер лазерных частиц и дзета-потенциал Анализатор	Malvern	Zetasizer Nano ZS 90
Фосфатный буфер физиологический раствор	Gibco	C20012500BT
Флуоресцентные микросферы из полистирола	Beckman Coulter	6602336
Просвечивающая электронная микроскопия	JEOL	JEM-1200EX
Trypsin-EDTA раствор	Gibco	1713949
Ультра радужные флуоресцентные частицы	Beckman Coulter	B28479
Ультрацентрифуга	Beckman Coulter	Optima-L80XP
Ультрацентрифуга	Beckman Coulter	SW32TI