Методическая статья

Высокопроизводительный скрининг кардиотоксичности с использованием зрелых монослоев кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека

DOI:

10.3791/64364

⸱

24 марта 2023 г.

 ,  ,  ,  , 
1Frankel Cardiovascular Regeneration Core Laboratory, Cardiovascular Medicine-Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, 2CAIRN Research, 3StemBioSys, Inc.

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Индуцированные человеком плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (hiPSC-CM), предлагают альтернативу использованию животных для доклинического скрининга кардиотоксичности. Ограничением для широкого внедрения hiPSC-CM в доклиническом скрининге токсичности является незрелый, эмбрионоподобный фенотип клеток. Здесь представлены протоколы для надежного и быстрого созревания hiPSC-CM.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток человека (hiPSC-CM), используются для замены и снижения зависимости от животных и клеток животных для доклинических испытаний на кардиотоксичность. В двумерных монослойных форматах hiPSC-CM повторяют структуру и функцию клеток сердечной мышцы взрослого человека при культивировании на оптимальном внеклеточном матриксе (ECM). ECM, полученный из перинатальных стволовых клеток человека (индуцирующий созревание внеклеточный матрикс-MECM-MECM), созревает структуру, функцию и метаболическое состояние hiPSC-CM через 7 дней после нанесения покрытия.

Зрелые монослои hiPSC-CM также реагируют, как и ожидалось, на клинически значимые лекарства с известным риском возникновения аритмий и кардиотоксичности. Созревание монослоев hiPSC-CM до сих пор было препятствием для широкого внедрения этих ценных клеток для нормативной науки и скрининга безопасности. В этой статье представлены валидированные методы нанесения покрытия, созревания и высокопроизводительного функционального фенотипирования электрофизиологической и сократительной функции hiPSC-CM. Эти методы применимы к коммерчески доступным очищенным кардиомиоцитам, а также к кардиомиоцитам, полученным из стволовых клеток, полученным собственными силами с использованием высокоэффективных протоколов камерно-специфической дифференцировки.

Высокопроизводительная электрофизиологическая функция измеряется с помощью чувствительных к напряжению красителей (VSD; излучение: 488 нм), кальций-чувствительных флуорофоров (CSF) или генетически кодируемых кальциевых датчиков (GCaMP6). Для оптической записи каждого функционального параметра используется высокопроизводительное оптическое картографическое устройство, а для анализа электрофизиологических данных используется специальное программное обеспечение. Протоколы MECM применяются для скрининга лекарств с использованием положительного инотропа (изопреналин) и блокаторов канала, связанных с эфиром (hERG) человека. Эти ресурсы позволят другим исследователям успешно использовать зрелые hiPSC-CM для высокопроизводительного доклинического скрининга кардиотоксичности, тестирования эффективности сердечных препаратов и сердечно-сосудистых исследований.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Индуцированные плюрипотентные кардиомиоциты человека, полученные из плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC-CM), были валидированы в международном масштабе и доступны дляскрининга кардиотоксичности in vitro1. Высокочистые hiPSC-CM могут генерироваться практически в неограниченном количестве, криоконсервироваться и размораживаться. После перекладывания они также реанимируются и начинают сокращаться с ритмом, напоминающим человеческое сердце 2,3. Примечательно, что отдельные hiPSC-CM соединяются друг с другом и образуют функциональные синцитии, которые бьются как единая ткань. В настоящее время ИПСК обычно получают из образцов крови пациентов, поэтому любой человек может быть представлен с помощью скрининговых анализов кардиотоксичности hiPSC-CM in vitro 4,5. Это создает возможность для проведения «клинических испытаний в блюде» со значительным представительством различных групп населения6.

Одним из важнейших преимуществ по сравнению с существующими подходами к скринингу кардиотоксичности клеток животных и животных является то, что hiPSC-CM используют полный геном человека и предлагают систему in vitro с генетическим сходством с человеческим сердцем. Это особенно привлекательно для фармакогеномики и персонализированной медицины - прогнозируется, что использование hiPSC-CM для разработки лекарств и других методов лечения обеспечит более точные, точные и безопасные назначения лекарств. Действительно, двумерные (2D) монослойные анализы hiPSC-CM доказали свою эффективность прогнозирования кардиотоксичности лекарств с использованием панели клинически используемых лекарств с известным риском возникновения аритмий 1,7,8,9. Несмотря на огромный потенциал hiPSC-CM и обещание упростить и удешевить разработку лекарств, существует нежелание использовать эти новые анализы10,11,12.

До сих пор одним из основных ограничений широкого внедрения и принятия скрининговых анализов hiPSC-CM является их незрелый, похожий на плод внешний вид, а также их функция. Критический вопрос созревания hiPSC-CM был рассмотрен и обсужден в научной литературе до тошноты13,14,15,16. Аналогичным образом, для стимулирования созревания hiPSC-CM было использовано множество подходов, включая манипуляции с внеклеточным матриксом (ECM) в 2D-монослоях и разработку 3D-инженерных тканей сердца (EHT)17,18. В настоящее время широко распространено мнение, что использование 3D EHT обеспечит превосходное созревание по сравнению с подходами на основе 2D монослоя. Однако 2D-монослои обеспечивают более высокую эффективность использования ячеек и больший успех в нанесении покрытия по сравнению с 3D-EHT; 3D EHT используют большее количество клеток и часто требуют включения других типов клеток, которые могут исказить результаты. Поэтому в этой статье основное внимание уделяется использованию простого метода созревания hiPSC-CM, культивируемых в виде 2D-монослоев электрически и механически связанных клеток.

Усовершенствованное созревание hiPSC-CM может быть достигнуто в 2D-монослоях с помощью ECM. 2D-монослои hiPSC-CM могут созревать с использованием мягкого, гибкого полидиметилсилоксанового покровного стекла, покрытого матриксом базальной мембраны, секретируемым клеткой саркомы мыши Энгельбрета-Холма-Роя (ECM мыши). В 2016 году отчеты показали, что hiPSC-CM, культивируемые в этом мягком состоянии ECM, функционально созревают, демонстрируя скорости проводимости потенциала действия вблизи значений сердца взрослого человека (~ 50 см / с)18. Кроме того, эти зрелые hiPSC-CM проявляли многие другие электрофизиологические характеристики, напоминающие сердце взрослого человека, включая гиперполяризованный мембранный потенциал покоя и экспрессию Kir2.1. Совсем недавно в отчетах было идентифицировано покрытие ECM, полученное из перинатальных стволовых клеток человека, которое способствует структурному созреванию 2D hiPSC-CMs19. Здесь представлены простые в использовании методы структурно зрелых 2D-монослоев hiPSC-CM для использования в высокопроизводительных электрофизиологических экранах. Кроме того, мы проводим валидацию оптического картографического прибора для автоматического сбора и анализа 2D монослойной электрофизиологической функции hiPSC-CM с использованием чувствительных к напряжению красителей (VSD) и чувствительных к кальцию зондов и белков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование hiPSC в этом протоколе было одобрено комитетом HPSCRO Мичиганского университета (Комитет по надзору за плюрипотентными стволовыми клетками человека). Список материалов и оборудования см. в таблице материалов . В таблице 1 приведены носители и их составы.

1. Размораживание и покрытие коммерчески доступных криоконсервированных hiPSC-CM для созревания на индуцирующем созревание внеклеточном матриксе (MECM)

  1. Нагрейте все реагенты до комнатной температуры и регидратируйте планшеты MECM сбалансированным солевым раствором Хэнка (HBSS) или фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS), содержащим кальций и магний, в течение 1 часа до покрытия кардиомиоцитов (200 мкл буфера на лунку 96-луночного планшета).
  2. Промойте планшеты MECM 2 раза HBSS или PBS, содержащими кальций и магний, в течение 1 часа перед кардиомиоцитами (200 мкл буфера на лунку 96-луночной пластины) и держите лунки гидратированными.
  3. Приготовьте водяную баню с температурой 37 °C.
  4. Извлеките кардиомиоцитарные пробирки из резервуара с жидким азотом, перенесите пробирки на сухой лед и слегка приоткройте крышки пробирок, чтобы сбросить давление.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сброс давления в трубках чрезвычайно важен! Если внутри труб будет слишком большое давление, они могут взорваться.
  5. Закройте крышки тюбиков и поместите их на водяную баню, чтобы они оттаяли на 4 минуты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дайте им полностью оттаять, чтобы избежать повреждения клеток из-за частичного оттаивания.
  6. После того, как клетки оттают, опрыскайте пробирки 70% этанолом перед открытием. Перенесите клетки в конические пробирки объемом 15 мл с помощью пипетки объемом 1 мл. Медленно капайте 8 мл гальванической среды, перемешивая пробирку каждый раз, когда добавляется 1 мл, чтобы клетки могли приспособиться к изменениям осмолярности.
    1. Промойте криовиал 1 мл гальванической среды с помощью стеклянной пипетки объемом 1 мл. Затем медленно капните жидкость в коническую трубку объемом 15 мл.
  7. Центрифугируют пробирки при ~300 × г в течение 5 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 1 мл гальванической среды. Удалите аликвоту и проведите подсчет живых клеток с помощью гемоцитометра. Добавьте дополнительную гальваническую среду для получения 7,5 × 10,5 клеток/мл .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительно 10 мл клеточной суспензии требуется для подготовки 96 лунок.
  8. Дозируйте 100 мкл клеточной суспензии на лунку 96-луночной пластины с покрытием MECM с помощью многоканальной пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вы избегаете осаждения ячеек и добиваетесь равномерной плотности ячеек во всех лунках во время нанесения покрытия.
  9. Инкубируйте клетки при 37 °C, 5% CO 2 в течение2 дней перед сменой среды на поддерживающую среду (200 мкл / лунка). Замените поддерживающую среду на 5-й день после размораживания. Выполняйте анализы ЭП на 7-й день или позже, как описано ранее8,9. Меняйте среду через день, выбирая расширение клеточной культуры.

2. hiPSC-направленная кардиальная дифференцировка и очистка hiPSC-CM

  1. Теплый 1x коммерчески доступный раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), HBSS без кальция и магния (HBSS--) и 6-луночные пластины, покрытые солюбилизированным матриксом базальной мембраны, секретируемым клеткой саркомы мыши Энгельбрета-Холма-Роя (ECM мыши) до комнатной температуры.
  2. Отметьте дифференцированные колонии с помощью фазово-контрастной микроскопии и аспирата/аблята. Хорошо промойте каждый из них 1 мл HBSS--. Проведите две промывки в лунках, содержащих >10 пятен дифференциации.
  3. Аспирируйте HBSS и добавьте 1 мл раствора ЭДТА в каждую лунку. Выдерживайте пластины до 5 минут при 37 °C. Проверьте пластины через 3 минуты и найдите полупрозрачные белые видимые колонии.
  4. Аспирируйте раствор ЭДТА и добавьте 1 мл в одну лунку. Вытесните клетки с 2 мл среды hiPSC, многократно пипетируя суспензию вверх и вниз, используя стеклянную пипетку объемом 10 мл, чтобы отделить все стволовые клетки от лунки и перенести клеточную суспензию в пробирку для сбора. Повторяют аспирацию и выбивание с последующими лунками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вытесните трудно поднимаемые колонии кончиком стеклянной пипетки.
  5. Подсчитайте стволовые клетки и отрегулируйте объем до пластины 8,0 × 105 клеток / лунка. Культивируйте клетки на среде hiPSC (2 мл / лунка) до тех пор, пока стволовые клетки не достигнут 90% слияния (это время отныне называется D0).
  6. Приготовьте 2 мл среды для базальной дифференцировки с добавлением 4 мкМ CHIR99021.
  7. На D0 промойте каждую лунку 6-луночной пластины стволовых клеток 1 мл HBSS на лунку. Замените HBSS средой базальной дифференцировки с добавлением 4 мкМ CHIR99021.
  8. На D1 ничего не делать.
  9. На D2 готовят среду для базальной дифференцировки с добавлением 4 мкМ IWP4.
  10. Замените среду 2 мл среды для базальной дифференцировки с добавлением IWP4 на лунку.
  11. На D3 ничего не делать для желудочково-специфической дифференцировки. Для предсердно-специфической дифференцировки аспирируют среду и добавляют 2 мл базальной среды с добавлением 4 мкМ раствора IWP4 и 1 мкМ ретиноевой кислоты (РА) на лунку.
  12. На D4 аспирируют среду и добавляют 2 мл базальной среды в лунку для дифференцировки желудочков. Для дифференцировки предсердий аспирируют среду и добавляют 2 мл базальной среды с добавлением 1 мкМ раствора РА на лунку.
  13. На D5 ничего не делать.
  14. На D6 аспирируют среду и добавляют 2 мл базальной среды на лунку (как для предсердной, так и для желудочковой дифференцировки).
  15. На D7 ничего не делать.
  16. На D8 аспирируйте среду и добавьте 2 мл поддерживающей среды кардиомиоцитов. Меняйте среду через день до разделения клеток или следуйте плану воздействия хронического препарата.

3. Очистка hiPSC-CM с помощью MACS (магнитно-активируемая сортировка клеток)

  1. Аспирируйте питательную среду для клеток и хорошо промойте каждую из них 1 мл HBSS--. Диссоциируют клетки, добавляя 1 мл 0,25% трипсина / ЭДТА и инкубируя при 37 ° C, 5% CO2 в течение 10 мин. Ресуспендируют и сингуляризируют клетки в каждой лунке 2 мл гальванической среды для инактивации трипсина / ЭДТА.
  2. Соберите клетки из шести лунок в коническую пробирку объемом 50 мл с сетчатым фильтром 70 мкм. Затем промойте сетчатый фильтр 3 мл гальванической среды. Посчитайте ячейки.
  3. Центрифугу суспензии при ~300 × г в течение 5 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость и промойте клетки 20 мл ледяного разделительного буфера MACS. Затем снова центрифугу при ~300 × г в течение 5 мин.
  4. Ресуспендируют гранулу в 80 мкл холодного разделительного буфера MACS на 5 ×10-6 ячеек. Добавьте 20 мкл холодного коктейля истощения некардиомиоцитов (человеческого) на 5 × 106 клеток. Аккуратно перемешайте клеточную суспензию и выдержите на льду в течение 10 минут.
  5. Промойте образец, добавив 4 мл холодного разделительного буфера MACS на 5 × 106 клеток. Центрифугируют образец при ~300 × г в течение 5 мин и аспирируют надосадочную жидкость.
  6. Ресуспендируют гранулу в 80 мкл холодного разделительного буфера MACS на 5 ×10-6 ячеек. Добавьте 20 мкл холодных антибиотиновых микрогранул на 5 × 106 клеток. Аккуратно перемешайте клеточную суспензию и выдержите 10 мин на льду.
  7. Во время инкубации образцов поместите колонки положительного истощения (оснащенные фильтрами предварительного разделения 30 мкм) на сепаратор MACS и поместите маркированные пробирки для сбора объемом 15 мл под колонки. Один столбец нужен на каждые 5 × 106 ячеек.
  8. Заправьте каждую колонку 3 мл холодного разделительного буфера MACS. Смешайте клеточную суспензию, обработанную антителами, с 2 мл разделительного буфера MACS на 5 ×10-6 клеток и добавьте в колонку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не центрифуга! Центрифугирование на этом этапе оказывает пагубное влияние на выход кардиомиоцитов.
  9. Добавьте 2 мл разделительного буфера MACS в каждую колонку и собирайте проточный буфер до тех пор, пока не будет собрано 12 мл проточной суспензии кардиомиоцитов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не допускайте полного высыхания колонн.
  10. Центрифугируйте кардиомиоциты при ~ 300 × г в течение 5 мин, выбросьте надосадочную жидкость и суспендируйте кардиомиоциты в 1 мл гальванической среды.
  11. Подсчитайте ячейки, чтобы определить концентрацию, отрегулируйте объем до желаемой плотности посева и наклейте ячейки. Нанесите очищенные кардиомиоциты на 96-луночные планшеты MECM, как описано выше на этапах 1.9-1.11 (7,5 × 105 клеток/лунка).

4. Оптическое картирование с использованием чувствительных к напряжению красителей (VSD) и кальций-чувствительных флуорофоров (CSF)

  1. Приготовьте соответствующее количество VSD в HBSS с кальцием и магнием, добавив 1 мкл красителя VSD на мл HBSS и 10 мкл загрузочного адъюванта на мл HBSS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, для 96-луночного планшета требуется 10 мл раствора VSD.
  2. В качестве альтернативы можно приготовить HBSS с кальцием и магнием с добавлением 5 мкМ спинномозговой жидкости. Аспирируйте поддерживающую среду кардиомиоцитов и замените 100 мкл VSD или CSF на лунку 96-луночного планшета. Инкубируют клетки в течение 30 мин в инкубаторе клеточных культур.
  3. Удалите красители и замените их проанализирующей средой или HBSS. Уравновешивание при 37 °C для получения базовых данных оптического картографирования с помощью высокопроизводительного оптического картографического устройства.
  4. Обработайте клетки препаратами для тестирования на острое воздействие или сопоставьте клетки, которые подвергались хроническому воздействию интересующих лекарств.
  5. Для тестирования кардиотоксичности на 96-луночных планшетах используйте четыре дозы соединения, по крайней мере, с шестью лунками на дозу. Используйте дозы в диапазоне от ниже до выше эффективной терапевтической концентрации в плазме, включая дозу клинической эффективной терапевтической концентрации в плазме.
  6. Разбавьте препараты в диметилсульфоксиде, храните их в виде исходных растворов при -20 °C, а затем разбавьте их в HBSS до желаемых концентраций.
  7. Перед применением лекарственного средства проведите базовые электрофизиологические измерения, как описано в разделе 5. После того, как препараты были применены, сделайте электрофизиологические записи не менее чем через 30 минут для хронических исследований. Процедуры сбора и анализа данных оптического картографирования см. в следующих разделах.

5. Оптическое картирование с использованием генетически кодируемого кальциевого индикатора (GECI)

  1. Пластины, коммерчески доступные или очищенные MACS-hiPSC-CM, как описано выше, с использованием 96-луночных пластин с покрытием MECM для изготовления зрелых hiPSC-CM. Для формирования сливающихся монопластов плита 7,5 × 104 СМ на скважину каждой 96-луночной плиты. Используйте гальваническую среду.
  2. Через 48 ч в гальванической среде переключитесь на поддерживающую среду кардиомиоцитов.
  3. На 4-й день после размораживания и повторного окрашивания добавьте рекомбинантный аденовирус для экспрессии GCaMP6m (AdGCaMP6m) в клетки при кратности инфекции (MOI) = 5. Добавьте вирус с помощью среды для анализа CM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь эксперименты с использованием GCaMP6m были проведены в кардиомиоцитах iCell2 от коммерческого поставщика.
  4. На 5-й день удалите носитель adGCaMP6m и замените его свежим RPMI+B27 (поддерживающая среда кардиомиоцитов).
  5. На 7-й день наблюдайте за КМ с помощью микроскопии или оптического картографа, чтобы визуализировать спонтанные сокращения и соответствующие переходные процессы кальция.
  6. На 7-й день или позже, для скрининга лекарств, непосредственно перенесите 96-луночные планшеты зрелых монослоев hiPSC-CM, экспрессирующих GCaMP6m, в оптический картографирующий тепловизор из инкубатора для сбора исходных данных.
  7. После сбора данных электрофизиологии верните планшеты КМ в инкубатор для культивирования тканей для измерений в последующий момент времени.
  8. После исходных записей применяйте лекарства, используя не менее четырех доз каждого лекарства и не менее шести лунок на дозу. Уравновешивайте лекарства на клетках в течение не менее 30 минут до сбора данных. Нагрейте температуру скважины до ~37 °C до и во время сбора данных.
  9. После базовой регистрации всей пластины добавьте изопротеренол (500 нМ) в каждую лунку, чтобы получить надежные данные об ответе на лекарство. Количественно оцените влияние изопротеренола на частоту биения монослоя, амплитуду сжатия (эмплитуду переходного процесса кальция) и продолжительность переходного процесса кальция (см. рис. 6), как описано в разделе 5.

6. Сбор и анализ данных оптического картографирования

  1. Убедитесь, что камера оптического картографического устройства, трансиллюминатор и нагреватель пластин включены.
  2. Откройте программное обеспечение для сбора данных и определите место сохранения файла.
  3. Откройте передний ящик и установите тарелку на нагреватель.
  4. Получите темную рамку, нажав кнопку « Темная рамка ».
  5. Выберите «Продолжительность (10–30 с)» и «Частота кадров съемки» (например, 100 кадров в секунду; 250 кадров в секунду для более высокого временного разрешения) и нажмите «Начать съемку».
  6. Откройте аналитическое программное обеспечение и на вкладке « Импорт/фильтр » выберите « Обзор одного файла» или « Несколько плиток », чтобы восстановить пластину.
  7. Выберите «Режим параметров» (APD или CaTD), введите «Расстояние на пиксель» и используйте мастер скважин для определения местоположения скважин на изображении. Нажмите кнопку Process Save (Сохранить процесс), чтобы перейти на следующую вкладку.
  8. Откройте вкладку ROI (области интереса) и выберите, чтобы нарисовать ROI вручную, автоматически или вообще не использовать ROI, что затем рассмотрит весь колодец для анализа. После того, как рентабельность инвестиций будет выбрана, нажмите кнопку «Обработать/Сохранить», чтобы перейти к следующему шагу. Установите флажки «Скрыть колодцы» и «Показывать только отфильтрованные», чтобы визуализировать рентабельность инвестиций.
  9. Откройте вкладку «Анализ » и в правом верхнем углу экрана выберите каждую скважину или ROI , чтобы подтвердить точность автоматического обнаружения ударов. Добавьте или удалите биты из трассировок, нажав «Добавить бит» / «Сохранить биты» или выбрав отдельный бит и нажав клавишу «Delete » на клавиатуре.
  10. При желании используйте функцию «Средние тепловые карты » для создания тепловых карт выбранных параметров для пластины.
  11. Нажмите кнопку «Пространственно-временной график» на вкладке «Анализ», чтобы визуализировать данные для каждой скважины или окупаемости инвестиций. Убедившись, что определение биений точно, перейдите на вкладку «Экспорт» и выберите «Формат файла». Нажмите «Экспорт» и создайте папку для экспортируемых данных. Перейдите к открытию файлов данных и запустите выбранную процедуру статистического анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Файлы .xlxs предпочтительнее, так как все параметры экспортируются в один файл; Другие форматы (.csv или .tsv) генерируют один файл для каждого параметра.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Созревание hiPSC-CM, характеризующееся фазовым контрастом и иммунофлюоресцентной конфокальной визуализацией
График ECM-опосредованного созревания коммерчески доступных hiPSC-CM с использованием 96-луночных планшетов с покрытием MECM представлен на рисунке 1A. Эти данные собираются с использованием коммерчески доступных кардиомиоцитов, которые поступают в лабораторию в виде криоконсервированных флаконов с клетками. Каждый флакон содержит >5 ×10,6 жизнеспособн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Существует несколько различных подходов к скринингу кардиотоксичности in vitro с использованием hiPSC-CM. В недавнем документе «Передовая практика» по использованию hiPSC-CM были представлены различные анализы in vitro , их первичные показания и, что важно, детализация каждого анализа для количественной оценки электрофизиологической функции сердца человека20. В дополнение к использованию прокалывающих мембрану электродов, наиболее прямое измерение электрофизиологической функции с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TJH является консультантом и научным советником StemBioSys, Inc. TB является сотрудником StemBioSys, Inc. AMR и JC являются бывшими консультантами StemBioSys, Inc. TJH, TB, AMR и JC являются акционерами StemBioSys, Inc.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами NIH HL148068-04 и R44ES027703-02 (TJH).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,25% Трипсин ЭДТАGibco25200-056
0,5 мг/мл БСА (7,5 &; мол/л)Millipore SigmaA3294
2.9788 г/500 мл HEPES (25 ммоль/л)Millipore SigmaH4034
AdGCaMP6mVector biolabs1909
Альбумин человеческийSigmaA9731-1G
альфа-актинин антителоThermoFisherMA1-22863
B27Gibco17504-044
BlebbistatinSigmaB0560
CalBryte 520AMAAT Bioquest20650
CELLvo MatrixPlus 96wpStemBiosysN/Ahttps://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus
CHIR99021LC Laboratoriesc-6556
Прозрачная среда для анализа (флуоробрит)ThermoFisherA1896701Для аденовируса трансдукция
DAPIThermoFisher62248
DMEM:F12Gibco11330-032
FBS (фетальная бычья сыворотка)SigmaF4135-500ML
FluoVoltThermoFisherF10488
HBSSGibco14025-092
iCell CM поддерживающий носительFUJIFILM/Cellular DynamicsM1003
iCell2 CMsFUJIFILM1434
Incucyte Zoom Sartorius
iPS DF19-9-11T. HWiCell
изопротеренолMilliporeSigmaCAS-51-30-9
IWP4Tocris5214
L-аскорбиновая кислота 2-фосфат сесквимагния соль гидрат SigmaA8960-5g
L-глутаминGibcoA2916801
LS колонкиMiltenyii Biotec130-042-401
Буфер MACS (Бегущий буфер autoMACS)Miltenyii Biotec130-091-221
MatrigelCorning354234
MitoTracker RedThermoFisherM7512
Nautilus HTS Optical Mapping CuriBiohttps://www.curibio.com/products-overview
Nikon A1R Конфокальный микроскоп Nikon
11140-050
фильтр предварительной сепарацииMiltenyii Biotec130-041-407
PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, человекMiltenyii Biotec130-110-188
PulseCuriBiohttps://www.curibio.com/products-overview
Quadro MACS сепаратор (магнит)Miltenyii Biotec130-091-051
Ретиноевая кислотаSigmaR2625
RPMI 1640 Gibco11875-093
RPMI 1640 (+HEPES, +L-глютамин)Gibco22400-089
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyii Biotec130-107-086
TnI антитело (pan TnI)Millipore SigmaMAB1691 
Версен (этилендиаминтетрауксусная кислота - раствор ЭДТА)Gibco15040-066
Y-27632 дигидрохлоридTocris1254
&бета;-меркаптоэтанолGibco21985023
заменимые аминокислоты Gibco

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  2. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
  3. Lee, P., et al. Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers. Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).
  4. Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development. SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).
  5. Strauss, D. G., Blinova, K. Clinical trials in a dish. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).
  6. Blinova, K., et al. Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs. Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).
  7. Blinova,, et al. Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias. Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).
  8. da Rocha, A. M., et al. hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen. Scientific Reports. 7 (1), 13834(2017).
  9. da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay. Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).
  10. Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
  11. Lam, C. K., Wu, J. C. Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come. European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).
  12. Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
  13. Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178(2020).
  14. Guo, Y., Pu, W. T. Cardiomyocyte maturation: new phase in development. Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).
  15. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
  16. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  17. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
  18. Herron, T. J., et al. Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638(2016).
  19. Block, T., et al. Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes. Scientific Reports. 10 (1), 19071(2020).
  20. Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756(2020).
  21. Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. JCI Insight. 3 (12), 99941(2018).
  22. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
  23. Davis, J., et al. In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. JCI Insight. 6 (10), 134368(2021).
  24. Diaz, R. J., Wilson, G. J. Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models. Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи