Method Article

Решение практических вопросов микроиндентирования на основе атомно-силовой микроскопии на эксплантах суставного хряща человека

DOI:

10.3791/64371

⸱

October 28th, 2022

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cell Biology, Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen, 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University Hospital Tübingen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представлен пошаговый подход к выявлению и решению наиболее распространенных проблем, связанных с микровдавливаниями в атомно-силовой микроскопии. В качестве примера мы приводим возникающие проблемы на экплантах суставного хряща человека, характеризующихся различными степенями дегенерации, вызванной остеоартритом.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Без сомнения, атомно-силовая микроскопия (АСМ) в настоящее время является одним из самых мощных и полезных методов для оценки микро- и даже наносигналов в биологической области. Однако, как и в случае с любым другим микроскопическим подходом, могут возникнуть методологические проблемы. В частности, характеристики образца, пробоподготовки, тип прибора и датчик для индентирования могут привести к появлению нежелательных артефактов. В этом протоколе мы иллюстрируем эти возникающие проблемы на здоровых, а также на костно-артритных эксплантатах суставного хряща. С этой целью мы сначала покажем с помощью пошагового подхода, как генерировать, классифицировать и визуально классифицировать диски суставного хряща ex vivo в соответствии с различными стадиями дегенерации с помощью большой 2D-мозаичной флуоресцентной визуализации всей ткани. Основное преимущество модели ex vivo заключается в том, что она включает в себя старые, естественные хрящи человека, что позволяет исследовать изменения, связанные с остеоартритом, от раннего начала до прогрессирования. Кроме того, представлены общие подводные камни при подготовке тканей, а также сама процедура АСМ вместе с последующим анализом данных. Мы показываем, как основные, но важные этапы, такие как подготовка и обработка образцов, характеристики топографических образцов, вызванные прогрессирующей дегенерацией, и взаимодействие образца с наконечником образца, могут повлиять на сбор данных. Мы также тщательно изучаем наиболее распространенные проблемы в АСМ и описываем, где это возможно, способы их преодоления. Знание этих ограничений имеет первостепенное значение для правильного сбора данных, интерпретации и, в конечном счете, включения полученных результатов в широкий научный контекст.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В связи с постоянно уменьшающимися размерами электронных устройств и систем набирает обороты стремительное развитие микро- и нанотехнологий и оборудования. Одним из таких устройств является атомно-силовая микроскопия (АСМ), которая может сканировать биологические поверхности и извлекать топографическую или биомеханическую информацию как в нано-, так и в микрометровом масштабе 1,2. Среди его обширных возможностей можно отметить, что этот прибор может работать как в микро-, так и в нано-инденторе для получения информации о механических свойствах различных биологических систем 3,4,5,6. Данные собираются путем физического контакта с поверхностью с помощью механического зонда, который может иметь размер около 1 нм на конце7. Результирующая деформация образца затем отображается в зависимости от глубины вдавливания консольного наконечника и силы, приложенной к образцу8.

Остеоартроз (ОА) – это длительное дегенеративное хроническое заболевание, характеризующееся ухудшением состояния суставного хряща в суставах и окружающих тканей, что может привести к полному обнажению костных поверхностей. Бремя ОД является существенным; В настоящее время половина всех женщин и одна треть всех мужчин в возрасте 65 лет и старше страдают от ОА9. Травмы, ожирение и, как следствие, изменение биомеханики сустава10 определяют дегенерацию суставного хряща, которая рассматривается как общий конечный результат. Новаторское исследование Ganz et al. постулировало, что ранние стадии процесса ОА могут быть связаны с биомеханическими свойствами хряща11, и с тех пор исследователи подтвердили эту гипотезу12. Кроме того, принято считать, что биомеханические свойства ткани функционально управляются ультраструктурной организацией, а также перекрестными помехами между клетками и клетками-матриксами. Любые изменения могут существенно повлиять на общее биомеханическое функционирование тканей13. На сегодняшний день диагноз ОА носит клинический характер и основывается на рентгенографии на обычной пленке14. Этот подход является двусторонним: во-первых, отсутствие определенного дегенеративного порога отсечения для постановки диагноза ОА затрудняет количественную оценку этого состояния, и, во-вторых, методы визуализации не обладают достаточной чувствительностью и стандартизацией и не могут обнаружить локализованное повреждение хряща15,16,17. С этой целью оценка механических свойств хряща имеет решающее преимущество в том, что она описывает параметр, который изменяется в течение ОА независимо от этиологии заболевания и оказывает непосредственное влияние на функциональность тканей на самой ранней стадии. Инструменты для индентирования измеряют силу, с которой ткань сопротивляется вдавливанию. Это, на самом деле, не новая концепция; Самые ранние исследования датируются 1980-ми и 1990-ми годами. В этот период многочисленные исследования показали, что инструменты для индентирования, предназначенные для артроскопических измерений суставного хряща, могут быть хорошо приспособлены для обнаружения дегенеративных изменений в хряще. Еще 30 лет назад некоторые исследования смогли продемонстрировать, что инструменты для индентирования способны обнаруживать in vivo изменения поверхности хряща при дегенерации тканей путем проведения измерений компрессионной жесткости во время артроскопии18,19,20.

АСМ индентирование (АСМ-ИТ) суставного хряща дает информацию об основных механических свойствах ткани, а именно о жесткости. Это механический параметр, описывающий связь между приложенной неразрушающей нагрузкой и результирующей деформацией вдавленной областиткани 21. Было показано, что AFM-IT способна количественно оценивать возрастные изменения жесткости в макроскопически непораженных коллагеновых сетях, таким образом, дифференцировать патологические изменения, связанные с началом ОА (степень 0 по шкале Outerbridge в суставном хряще)22. Ранее мы показали, что АСМ-ИТ на основе пространственной организации хондроцитов в качестве биомаркера ранней дегенерации хряща на основе изображений позволяют не только количественно оценить, но и фактически точно определить самые ранние дегенеративные механические изменения. Эти выводы уже подтверждены другими23,24. Таким образом, AFM-IT выступает в качестве интересного инструмента для диагностики и выявления ранних дегенеративных изменений. Эти изменения уже могут быть измерены на клеточном уровне, что меняет понимание патофизиологического процесса ОА.

В этом протоколе мы демонстрируем полную процедуру гистологической и биомеханической классификации эксплантов суставного хряща, начиная с подготовки экплантов из нативного хряща и заканчивая сбором и обработкой данных АСМ. С помощью пошагового подхода мы показываем, как генерировать, классифицировать и визуально классифицировать суставную хрящевую ткань в соответствии с различными стадиями дегенерации с помощью 2D-визуализации большой мозаики с последующей микро-АСМ индентацией.

Несмотря на то, что в настоящее время АСМ-ИТ является одним из наиболее чувствительных инструментов для измерения биомеханических изменений в хряще7, как и любой другой инструментальный метод, он имеет ограничения и практические особенности25, которые могут привести к ошибочному получению данных. С этой целью мы тщательно рассмотрим наиболее распространенные проблемы, возникающие при АСМ измерениях хрящевых эксплантов, и опишем, где это возможно, способы их минимизации или преодоления. К ним относятся топографические аспекты образцов и трудности их стабилизации в АСМ-совместимой среде, физические особенности поверхности ткани и, как следствие, трудности при проведении АСМ измерений на таких поверхностях. Также приведены примеры ошибочных кривых зависимости силы от расстояния с акцентом на условия, которые могут их вызвать. Также обсуждаются дополнительные ограничения, присущие геометрии консольного наконечника и использованию модели Герца для анализа данных.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использовались мыщелки бедренной кости, собранные у пациентов, перенесших тотальное эндопротезирование коленного сустава в университетской клинике Тюбингена, Германия. В исследование были включены только образцы суставного хряща пациентов с дегенеративными и посттравматическими патологиями суставов. До начала исследования было получено одобрение ведомственного, институционального, а также местного этического комитета (Проект No 674/2016BO2). Перед участием было получено письменное информированное согласие от всех пациентов.

ПРИМЕЧАНИЕ: Блок-схема этапов эксперимента в хронологическом порядке приведена на рисунке 1.

1. Обработка тканей и формирование хрящевых дисков

  1. Подготовка тканей
    1. После послеоперационной резекции поместите образцы хряща в контейнер, наполненный модифицированной средой Игла (DMEM) компании Dulbecco с добавлением 5% (v/v) пенициллина-стрептомицина. Убедитесь, что образцы полностью погружены в среду. Продолжительность между хирургической резекцией и дальнейшей обработкой хряща не должна превышать 24 ч. Убедитесь, что на протяжении всей обработки образцы полностью погружены в среду, чтобы избежать высыхания образца.
    2. Отрежьте хрящ от кости с помощью скальпеля.
  2. Генерация хрящевых дисков
    1. Создайте хрящевые диски диаметром 4 мм с помощью биопсийного пуансона.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно выделить и резектировать участки мыщелка, где толщина хрящевого слоя превышает 1 мм. Это может быть проблематично, особенно в зонах нагрузки, где хрящевой слой обычно теряет свою толщину из-за процессов износа или дегенерации.
    2. Поместите ранее сгенерированные хрящевые диски диаметром 4 мм на изготовленное по индивидуальному заказу режущее устройство, а затем закрепите и удерживайте хрящевые диски в стабильном положении с помощью шпателя. При размещении хрящевых дисков на режущем устройстве необходимо соблюдать осторожность. Расположите образцы так, чтобы самый верхний слой хряща (поверхностная зона суставного хряща) не был обращен к лезвию
    3. Разрежьте хрящевые диски лезвием бритвы. Таким образом, образуются образцы хряща в форме диска размером 4 мм x 1 мм. Чтобы предотвратить высыхание образца, выполняйте резку ткани как можно быстрее.
    4. Соберите каждый диск с помощью шпателя и поместите сформированные хрящевые диски в пробирки по 1,5 мл, содержащие 1 мл ДМЕМ с добавлением 5% (v/v) пенициллина-стрептомицина. Поместите примерно 15 дисков в одну пробирку.
  3. Криотомного секционирования хрящевых дисков (для перпендикулярных срезов)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг не является обязательным, и его можно использовать, если требуется визуализация распределения клеточного рисунка в хрящевых дисках сбоку. Он может быть использован в качестве метода верификации, так как распределение клеточного рисунка является 3D-особенностью суставного хряща26. Также можно использовать оптическое сечение и 3D-реконструкцию всего хрящевого диска с помощью конфокального микроскопа, устраняя, таким образом, необходимость секционирования образцов, как описано в протоколе.
    1. Накройте хрящевой диск водорастворимой средой для заделки и поместите его на его край на ручку криотома (поверхность диска перпендикулярна поверхности ручки). В криотомном устройстве закладная среда замерзает при низких температурах.
    2. Используя стандартный криотом, разрезают ткань сбоку на толщину 60 мкм до середины диска (т.е. когда криосекции достигают длины 4 мм) и собирают срезы. При перпендикулярном рассечении эксплантата диска можно визуализировать все зоны хряща (поверхностные, средние и глубокие).
    3. Соберите срезы на предметном стекле и удалите водорастворимую среду для заделки, трижды промыв фосфатно-солевым буфером (PBS).

2. Сортировка хрящевых дисков в зависимости от пространственной структуры клеток

  1. Окрашивание образцов хряща в форме диска
    1. Поместите по одному хрящевой диску (раздел 1.2) в каждую лунку 96-луночной пластины и добавьте 130 мкл проницаемого для клеток флуоресцентного красителя в разведении 1:1000 в каждую лунку.
    2. Визуально осмотрите всю пластину и убедитесь, что в каждую лунку помещен только один диск. Инкубируйте планшет в течение 30 мин в стандартном инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 °C.
  2. Окрашивание хрящевых срезов размером 60 мкм
    1. Аккуратно поместите срезы хрящевого диска (раздел 1.3) на предметные стекла микроскопа с помощью щипцов.
    2. Покройте хрящевые участки монтажной средой, содержащей ядерное противоокрашивание DAPI, и аккуратно поместите покровные стекла, подходящие для флуоресцентной микроскопии.
    3. Запечатайте края каждого покровного стекла обычным прозрачным лаком для ногтей и дайте высохнуть в течение 3 минут.
  3. Сортировка и визуализация хряща сверху вниз и сбоку
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый диск должен быть исследован под флуоресцентным микроскопом. Целью этого шага является сортировка дисков на основе их преобладающего клеточного рисунка (одинарные струны, двойные струны, маленькие кластеры, большие кластеры или диффузные).
    1. Поместите 96-луночный планшет на держатель планшета флуоресцентного микроскопа.
    2. Выберите подходящий флуоресцентный фильтр Em 495 нм/Ex 515 нм (для нисходящей визуализации хрящевых дисков, подготовленных в разделе 2.1.) или Em 358 нм/Ex 461 нм (для изображения сбоку хрящевых участков, подготовленных в разделе 2.2) и 10-кратный объектив.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование объектива 10x позволяет исследовать всю окружность диска, а образцы с неоднородным или неправильным окрашиванием могут быть исключены. Тем не менее, использование только нисходящего вида может привести к восприятию изменений в клеточной организации в результате анализа более глубоких слоев тканей, видимых для наблюдения сверху вниз при поверхностной эрозии. Например, восходящая струна, следующая за коллагеновыми аркадами, может восприниматься как одна клетка или рассеянные клетки (диффузный паттерн)26. В результате, обе стороны дисков должны быть осмотрены, чтобы обеспечить правильный выбор клеточного рисунка.
    3. Определите визуально клеточный рисунок, отображаемый в каждом хрящевом диске. Маловероятно, что диск будет иметь только один тип клеточного рисунка. Для той части диска, где расположение хондроцитов не соответствует интересующему образцу, образцы принимают только в том случае, если нежелательный рисунок находится на самой периферии, где не проводятся измерения АСМ (т.е. на расстоянии до 0,5 мм от границы диска), и следите, чтобы он не превышал 10% от общей поверхности диска27, 28. См.
  4. Получение изображений всего хрящевого диска
    1. Выберите 10-кратный объектив микроскопа и поместите его под предварительно выбранную лунку, содержащую отдельный хрящевой диск. Сосредоточьтесь на диске, чтобы увидеть клеточный рисунок.
    2. Выберите функцию навигатора, чтобы получить обзор всей скважины. Используйте левую кнопку мыши и перетащите, чтобы перейти в другую рабочую область. С помощью колесика мыши увеличивайте и уменьшайте масштаб.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе предварительный просмотр лунки со всем образцом можно увидеть, последовательно дважды щелкнув по каждой интересующей области.
    3. Выберите квадрат, охватывающий область интереса для сканирования; В этот момент все отдельные плитки, составляющие мозаику, станут видимыми.
    4. Отрегулируйте экспозицию/интенсивность света так, чтобы ячейки можно было четко визуализировать с фона. На этом этапе яркость/контрастность изображения была отрегулирована для всех плиток и больше не может быть настроена индивидуально для каждой плитки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку клетки у края диска часто излучают более высокий флуоресцентный сигнал, чем клетки в центре, необходимо адаптировать настройки экспозиции/интенсивности света.
      1. Чтобы оценить, подходит ли время экспозиции для конкретного канала, изучите распределение сигнала на гистограмме. Используя механизм автоматической экспозиции, входящий в программное обеспечение микроскопа, визуализируйте все клетки, находящиеся внутри диска.
    5. Выберите параметр программного обеспечения Focus Map Point, а затем выберите каждую отдельную плитку, щелкнув левой кнопкой мыши в ее центре.
    6. Выберите опцию Карта фокусировки. Отобразится окно со всеми ранее выбранными плитками. Дважды щелкните плитку в списке, чтобы отобразить ее и поместить в нужный фокус.
    7. Нажмите кнопку Set Z, чтобы сохранить фокальный план, и перейдите к следующей плитке. Настроив фокальный план для каждой отдельной плитки, начните получение изображения, нажав кнопку Начать сканирование.
      1. Если скан отображает более темные горизонтальные и/или вертикальные полосы, это может быть связано с неправильным и неравномерным освещением отдельных кадров. Устраните эту проблему с помощью параметра Связанное затенение , встроенного в программное обеспечение перед фактическим сканированием.
    8. Сохраняйте, экспортируйте и корректно комментируйте изображения.

3. Биомеханический подход к эксплантам хряща

  1. Подготовка образцов для АСМ измерений
    1. Зафиксируйте каждый предварительно выбранный хрящевой диск, содержащий ячеистый рисунок (раздел 2), в чашках Петри с помощью биосовместимого клея. Добавьте достаточное количество образца клея на верхнюю, нижнюю, левую и правую стороны диска.
    2. Залейте диски 2,5 мл среды L-15 Лейбовица без L-глютамина. Осторожно добавьте среду Лейбовица на образцы, чтобы избежать отрыва образца от поверхности из-за волн, создаваемых средой.
  2. Загрузка образцов в АСМ
    1. Поместите чашку Петри в держатель образца прибора АСМ и включите нагреватель чашки Петри на 37 °C. Дайте чашке для культуры тканей нагреться до желаемой температуры. Это сделано для исключения возможных артефактов, вызванных колебаниями температуры.
  3. Калибровка кантилевера АСМ
    1. Инициализируйте установку программного обеспечения, как описано ранее Danalache et al.29.
    2. Выберите подходящий консольный держатель стеклянного блока для измерения жидкости и аккуратно поместите его на головку АСМ. Механизм блокировки фиксирует стеклоблок в головке AFM. Убедитесь, что отражающая поверхность стеклоблока прямая и параллельна держателю AFM.
    3. Осторожно поместите консоль на поверхность держателя консоли из стеклянного блока. Сам кантилевер должен опираться на полированную оптическую плоскость, в центре стеклоблока.
    4. Осторожно поместите силиконовую юбку (силиконовую мембрану) на основание консольного держателя, чтобы предотвратить образование конденсата в головке AFM.
    5. Опустите консоль с шагом 100 мкм с помощью функции шагового двигателя до полного погружения в среду.
    6. Используйте сканер с параметрами приближения, описанными Danalache et al.29. Втяните кантилевер на 100 мкм, как только вы достигнете дна чашки Петри.
    7. Откалибруйте консоль, выполнив точные действия, и выполните параметры, описанные Danalache et al.29. В конце калибровки вертикальное отклонение сохраняется и отображается в ньютонах (Н) единицах силы, а не в вольтах (В) - единицах измерения исходной регистрации фотодиодным детектором. В приведенных здесь экспериментах после калибровки было получено заданное значение 4,47 нН.
    8. Используя функцию шагового двигателя, втяните консоль на 1 000 мкм.
  4. Определение желаемого места измерения хряща с помощью АСМ
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за толщины хрящевых дисков толщиной 1 мм консоль не видна в поле зрения при навигации по образцу.
    1. Используйте ПЗС-камеру микроскопа для идентификации консоли. Кантилевер АСМ должен располагаться в свободной от образцов области чашки Петри.
    2. Начните сканирование с кантилевера на чистом, свободном от образцов участке чашки Петри, используя те же параметры, что и Danalache et al.29.
    3. Далее отодвиньте консоль на 1,5 мм от нижней части пластины с помощью шагового двигателя. Этот шаг имеет решающее значение для того, чтобы избежать прямого столкновения между кантилевером и образцом.
    4. Переключитесь с яркого поля на флуоресцентный вид и визуально определите верхнюю часть диска.
    5. Сдвиньте держатель образца АСМ ровно на 2 мм к середине диска. Эта точка считается центром хрящевого диска.
    6. Запустите сканер и, как только поверхность хрящевого диска будет достигнута, втяните кантилевер на 100 мкм.
  5. Измерения кривой «сила-расстояние»
    1. Сосредоточьтесь на ячейках, расположенных в нужном месте измерения. Нажмите кнопку Run (Выполнить), чтобы начать измерения и построение кривых зависимости силы от расстояния в заданном положении.
    2. Получите пять кривых «сила-расстояние» на каждом участке измерения. Отодвиньте кантилевер на 500 мкм и переместите кантилевер к следующей точке измерения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ретракция кантилевера является важным шагом, так как поверхность хрящевого диска неоднородна и имеет неровности. Высокий бугорок на поверхности образца может привести к резкому столкновению, что приведет к нежелательному повреждению кончика кантилевера/образца. Мы рекомендуем выбрать не менее пяти различных точек измерения, разбросанных по поверхности диска, и получить не менее пяти кривых зависимости силы от расстояния в каждом месте.
    3. Проверьте кривые зависимости силы от расстояния и сохраните их.
  6. Оценка модулей Юнга с помощью модели аппроксимации Герца
    1. Откройте сгенерированные кривые зависимости силы от расстояния для анализа (файл .jpk) в программном обеспечении для анализа данных с помощью опции Open a Batch of Spectroscopy Curves .
    2. Выберите модель подгонки по Герцу, а затем выберите параметр Эластичная подгонка.
      1. Опция «Подгонка упругости» автоматически выполняет следующие вычисления для выбранной кривой «сила-расстояние»: вычисляет базовую линию и вычитает из нее всю кривую, чтобы удалить смещение базовой линии (базовая линия возвращается к нулю по оси Y); определяет точку контакта, определяя точку, в которой кривая «сила-расстояние» пересекает нулевую силовую линию (точка контакта устанавливается равной нулю по оси X); рассчитывает разделение зонда и образца (вычитается сигнал высоты пьезоприемника, учитывающий изгиб кантилевера); и автоматически подгоняет кривую сила-расстояние к выбранной модели. При желании каждый из этих этапов также можно выполнить самостоятельно.
    3. Адаптируйте, используя следующие параметры посадки: коэффициент Пуассона 0,5 и соответствующий радиус консольного наконечника.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании консоли со сферическим консольным наконечником следует использовать модель Hertz fit. Консоль, использованная в этом исследовании, имела сферический наконечник радиусом 5 мкм. Мы рекомендуем подгонять кривую «сила-расстояние» до тех пор, пока не будет достигнуто максимальное приложенное усилие (заданное значение).
    4. Визуально проверьте подгонку кривой «сила-расстояние», чтобы убедиться в правильности. Этот шаг должен быть выполнен для каждой из анализируемых кривых сила-расстояние.
  7. Определение глубины вдавливания
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от используемого инструмента анализа данных этот процесс может отличаться. Экспериментатор может легко прочитать глубину отступа, выполнив ряд шагов, которые включены в программу анализа данных.
    1. Откройте каждую из сгенерированных кривых «сила-расстояние» в программном обеспечении для анализа данных и выберите модель соответствия Герца в качестве процесса анализа.
    2. Примените параметр « Смещение базовой линии » для обнуления оси вертикального отклонения (оси Y) и выберите функцию «Смещение + наклон ».
    3. Используйте функцию Find Contact Point (Найти точку контакта) для автоматического определения точки контакта, которая автоматически приводится к x-координате, равной нулю.
    4. Вычтите расстояние, учитывающее исключительно отклонение кантилевера, из исходной высоты пьезокопа во время вдавливания с помощью функции Vertical Tip Position .
    5. Выберите параметр «Эластичная подгонка », чтобы отобразить обработанную кривую зависимости силы от расстояния, и выберите область графика таким образом, чтобы она совпадала с наименьшим отрицательным значением на оси вертикального положения зонда (ось x).
    6. Прочтите и задокументируйте отступ из поля X Min на вкладке параметров. Сохраните и задокументируйте результаты.

4. Статистический анализ

  1. Откройте статистическую программу. Выберите Новый набор данных в раскрывающемся меню.
  2. Откройте вкладку Variable View после выбора файла DataSet . Определите числовые переменные для каждой категории клеточных паттернов: одиночные строки = SS, двойные строки = DS, малые кластеры = SC, большие кластеры = BC, диффузные и модули Юнга.
  3. На вкладке представления данных введите измеренные данные модулей Юнга для каждой из соответствующих категорий клеточных шаблонов. Проанализируйте распределение данных, выбрав Анализ в строке меню, а затем Исследовательский анализ данных.
  4. Выберите Модули Юнга в качестве зависимой переменной и Клеточный паттерн в качестве списка факторов. Ящичковая диаграмма, используемая для раздела результатов, отображается среди результатов в выходном файле.
  5. Чтобы выполнить статистический анализ, выберите «Зависимые выборки » в разделе «Непараметрический тест» на вкладке «Анализ» в строке меню. Выберите модули Юнга в качестве тестовых полей и клеточный паттерн в качестве групп на вкладке полей. Нажмите кнопку Выполнить.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты отображаются в выходном файле. Для статистического анализа проводится критерий Фридмана.
  6. Включите p-значения непараметрического теста в ящичковую диаграмму, созданную на шаге 4.4. Сохраните результаты, щелкнув Файл в строке меню и выбрав Сохранить.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя самодельное режущее устройство, мы смогли эксплантировать и получить небольшие (4 мм х 1 мм) хрящевые диски из свежих мыщелков человека, содержащих единый ячеистый пространственный паттерн30 одиночных нитей (SS, рис. 2A), двойных нитей (DS), малых кластеров (SC), больших кластеров (BC; рис. 2А) и диффузные (рис. 2Б). Типичный эксплант хряща изображен на рисунке 3А. Выбо...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Являясь прогрессирующим и многофакторным заболеванием, ОА вызывает структурные и функциональные изменения в суставном хряще. На протяжении всего течения ОА нарушения механических свойств сопровождаются структурными и биохимическими изменениями на поверхности суставного хряща27,31. Самыми ранними патологическими явлениями, возникающими при ОА, являются истощение протеогликанов в сочетании с нарушением коллагеновой сети32,33,34

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Благодарим хирургов-ортопедов отделения ортопедической хирургии Университетской клиники Тюбингена за предоставленные образцы тканей.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Амфотерицин BMerck KGaA, Дармштадт, Германия1397-89-3
Атомно-силовой микроскоп (АСМ) головка CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Берлин, ГерманияJPK00518
Биосовместимый образец клея Bruker Nano GmbH, Берлин, ГерманияH000033
Calcein AMCayman, Анн-Арбор, Мичиган, США14948Проницаемое окрашивание клеточной мембраны, используемое для сортировки хрящевых дисков - вид сверху
КонсольBruker Nano GmbH, Берлин, ГерманияSAA-SPH-5UMНоминал частоты: 30 кГц, k: 0,2 Н/м, длина nom: 115μ м, ширина nom: 40μ м,  геометрия: прямоугольный, цилиндрический наконечник с 5&м; m аппарат
для стирования хряща с конечным радиусом Самостоятельно изготовленный n/aРежущее пластиковое устройство, содержащее предопределенные целые элементы камеры CDD размером 4 мм x 1 мм
интегрированной в АСМThe Imaging Source Europe GmbH, Бремен, Германия, DFK31BF03
CDD камера, интегрированная в флуоресцентный микроскопLeica Biosystems, Вецлар, ГерманияDFC3000G
CryotomeLeica Biosystems, Вецлар, ГерманияCM3050S 
Программное обеспечение для обработки данных для AFMBruker Nano GmbH, Берлин, Германияn/aВерсия 5.0.86,  можно бесплатно загрузить со следующего веб-сайта https://customers.jpk.com
модифицированном носителе Eagle's Medium (DMEM) от Dulbecco.Gibco, Life Technologies, Дармштадт, Германия41966052
Флуоресцентный микроскоп (Leica DMi8)Leica Biosystems, Вецлар, Германия11889113
Держатель консоли стеклянного блокаBruker Nano GmbH, Берлин, ГерманияSP-90-05Очень длинный стеклянный блок с угловыми гранями, разработанный специально для использования с JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Инвертированный фазово-контрастный микроскоп (встроенный в АСМ)AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Йена, ГерманияL201306_03
среде L-15 Лейбовица без L-глутамина Merck KGaA, Дармштадт, ГерманияF1315
Предметные стекла для микроскопаSigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США CLS294775X50
Монтажная среда С DAPIibidi GmbH, Grä felfing, Германия50011Монтажная среда с ядерным DAPI (4′,6-диамидино-2-фенилиндол) противоокрашивание, используемая для визуализации хрящевых дисков  вид сбоку
Пенициллин-стрептомицинSigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАP4333
Нагреватель чашек Петри, связанный с AFM (нагреватель тарелок Петри)Bruker Nano GmbH, Берлин, ГерманияT-05-0117
СкальпельFeather Medical Products, Осака, Япония2023-01
Силиконовая юбкаBruker Nano GmbH, Берлин, Германиян/дЗащитная силиконовая мембрана (D55x0.25), которая размещена на основе блока стекла для предотвращения конденсации среды в головке AFM.
Статистическая программа - SPSSIBM, Armonk, Нью-Йорк, СШАSPSS Statistics 22Vesion 280.0.0.0 (190)
Чашки для культуры тканей TPP Techno Plastic Products AG, Трасадинген, ШвейцарияTPP93040
Tissue-tek O.C.T. CompoundSakura Finetek, Alphen aan den Rijn, НидерландыSA6255012Водорастворимая среда для встраивания 
,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. Atomic force microscopy of biological samples. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (6), 618-634 (2010).
  2. Deng, X., et al. Application of atomic force microscopy in cancer research. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 102(2018).
  3. Radmacher, M. Studying the mechanics of cellular processes by atomic force microscopy. Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).
  4. Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysical Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
  5. Rabinovich, Y., et al. Atomic force microscopy measurement of the elastic properties of the kidney epithelial cells. Journal of Colloid and Interface Science. 285 (1), 125-135 (2005).
  6. Dufrêne, Y. F. Using nanotechniques to explore microbial surfaces. Nature Reviews Microbiology. 2 (6), 451-460 (2004).
  7. Cykowska, A., Danalache, M., Bonnaire, F. C., Feierabend, M., Hofmann, U. K. Detecting early osteoarthritis through changes in biomechanical properties - A review of recent advances in indentation technologies in a clinical arthroscopic setup. Journal of Biomechanics. 132, 110955(2022).
  8. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  9. Fuchs, J., Kuhnert, R., Scheidt-Nave, C. 12-Monats-Prävalenz von Arthrose in Deutschland. Journal of Health Monitoring. 2, 55-60 (2017).
  10. Felson, D. T. Osteoarthritis of the knee. New England Journal of Medicine. 354 (8), 841-848 (2006).
  11. Ganz, R., Leunig, M., Leunig-Ganz, K., Harris, W. H. The etiology of osteoarthritis of the hip. Clinical Orthopaedics and Related Research. 466 (2), 264-272 (2008).
  12. Saxby, D. J., Lloyd, D. G. Osteoarthritis year in review 2016: Mechanics. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (2), 190-198 (2017).
  13. Buckwalter, J. A., Mankin, H. J. Articular cartilage: Degeneration and osteoarthritis, repair, regeneration, and transplantation. Instructional Course Lectures. 47, 487-504 (1998).
  14. Braun, H. J., Gold, G. E. Diagnosis of osteoarthritis: Imaging. Bone. 51 (2), 278-288 (2012).
  15. Guermazi, A., Roemer, F. W., Burstein, D., Hayashi, D. Why radiography should no longer be considered a surrogate outcome measure for longitudinal assessment of cartilage in knee osteoarthritis. Arthritis Research & Therapy. 13 (6), 247(2011).
  16. Guermazi, A., et al. Different thresholds for detecting osteophytes and joint space narrowing exist between the site investigators and the centralized reader in a multicenter knee osteoarthritis study--Data from the Osteoarthritis Initiative. Skeletal Radiology. 41 (2), 179-186 (2012).
  17. Bedson, J., Croft, P. R. The discordance between clinical and radiographic knee osteoarthritis: A systematic search and summary of the literature. BMC Musculoskeletal Disorders. 9 (1), 116(2008).
  18. Dashefsky, J. H. Arthroscopic measurement of chondromalacia of patella cartilage using a microminiature pressure transducer. Arthroscopy. 3 (2), 80-85 (1987).
  19. Berkenblit, S. I., Frank, E. H., Salant, E. P., Grodzinsky, A. J. Nondestructive detection of cartilage degeneration using electromechanical surface spectroscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 116 (4), 384-392 (1994).
  20. Appleyard, R. C., Swain, M. V., Khanna, S., Murrell, G. A. The accuracy and reliability of a novel handheld dynamic indentation probe for analysing articular cartilage. Physics in Medicine and Biology. 46 (2), 541-550 (2001).
  21. Hsieh, C. H., et al. Surface ultrastructure and mechanical property of human chondrocyte revealed by atomic force microscopy. Osteoarthritis and Cartilage. 16 (4), 480-488 (2008).
  22. Stolz, M., et al. Early detection of aging cartilage and osteoarthritis in mice and patient samples using atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 4 (3), 186-192 (2009).
  23. Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
  24. Tschaikowsky, M., et al. Hybrid fluorescence-AFM explores articular surface degeneration in early osteoarthritis across length scales. Acta Biomaterialia. 126, 315-325 (2021).
  25. Eaton, P., Batziou, K. Artifacts and Practical Issues in Atomic Force Microscopy. Atomic Force Microscopy: Methods and Protocols. Santos, N. C., Carvalho, F. A. , Springer. New York, NY. 3-28 (2019).
  26. Danalache, M., et al. Exploration of changes in spatial chondrocyte organisation in human osteoarthritic cartilage by means of 3D imaging. Scientific Reports. 11, 9783(2021).
  27. Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
  28. Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 38 (10), 2170-2180 (2020).
  29. Danalache, M., Tiwari, A., Sigwart, V., Hofmann, U. K. Application of atomic force microscopy to detect early osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (159), e61041(2020).
  30. Rolauffs, B., et al. Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis. Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).
  31. Wilusz, R. E., DeFrate, L. E., Guilak, F. Immunofluorescence-guided atomic force microscopy to measure the micromechanical properties of the pericellular matrix of porcine articular cartilage. Journal of The Royal Society Interface. 9 (76), 2997-3007 (2012).
  32. Guilak, F., Ratcliffe, A., Lane, N., Rosenwasser, M. P., Mow, V. C. Mechanical and biochemical changes in the superficial zone of articular cartilage in canine experimental osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 12 (4), 474-484 (1994).
  33. Billinghurst, R. C., et al. Enhanced cleavage of type II collagen by collagenases in osteoarthritic articular cartilage. The Journal of Clinical Investigation. 99 (7), 1534-1545 (1997).
  34. Wu, P. J., et al. Detection of proteoglycan loss from articular cartilage using Brillouin microscopy, with applications to osteoarthritis. Biomedical Optics Express. 10 (5), 2457-2466 (2019).
  35. Loparic, M., et al. Micro- and nanomechanical analysis of articular cartilage by indentation-type atomic force microscopy: Validation with a gel-microfiber composite. Biophysical Journal. 98 (11), 2731-2740 (2010).
  36. Moshtagh, P. R., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. The elastic modulus of articular cartilage at nano-scale and micro-scale measured using indentation type atomic force microscopy. Osteoarthritis and Cartilage. 22, 359-360 (2014).
  37. Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 19, 109409(2019).
  38. Houtman, E., et al. Human osteochondral explants: Reliable biomimetic models to investigate disease mechanisms and develop personalized treatments for osteoarthritis. Rheumatology and Therapy. 8 (1), 499-515 (2021).
  39. Anderson, J. R., Phelan, M. M., Foddy, L., Clegg, P. D., Peffers, M. J. Ex vivo equine cartilage explant osteoarthritis model: A metabolomics and proteomics study. Journal of Proteome Research. 19 (9), 3652-3667 (2020).
  40. Chen, C. T., Torzilli, P. A. In vitro cartilage explant injury models. Post-Traumatic Arthritis: Pathogenesis, Diagnosis and Management. Olson, S. A., Gauilak, F. , Springer. New York, NY. 29-40 (2015).
  41. Thudium, C. S., Engstrom, A., Groen, S. S., Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. -C. An ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants. Journal of Visualized Experiments. (153), e59467(2019).
  42. Rolauffs, B., Williams, J., Grodzinsky, A., E Kuettner, K., Cole, A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
  43. Deveza, L. A., Loeser, R. F. Is osteoarthritis one disease or a collection of many. Rheumatology. 57, 34-42 (2018).
  44. Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86 (5), 3269-3283 (2004).
  45. Sicard, D., Fredenburgh, L. E., Tschumperlin, D. J. Measured pulmonary arterial tissue stiffness is highly sensitive to AFM indenter dimensions. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 74, 118-127 (2017).
  46. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).
  47. Gavara, N. Combined strategies for optimal detection of the contact point in AFM force-indentation curves obtained on thin samples and adherent cells. Scientific Reports. 6, 21267(2016).
  48. Mow, V. C., Kuei, S. C., Lai, W. M., Armstrong, C. G. Biphasic creep and stress relaxation of articular cartilage in compression? Theory and experiments. Journal of Biomechanical Engineering. 102 (1), 73-84 (1980).
  49. Armstrong, C. G., Lai, W. M., Mow, V. C. An analysis of the unconfined compression of articular cartilage. Journal of Biomechanical Engineering. 106 (2), 165-173 (1984).
  50. Deng, L., et al. Fast and slow dynamics of the cytoskeleton. Nature Materials. 5 (8), 636-640 (2006).
  51. Fischer-Friedrich, E., et al. Rheology of the active cell cortex in mitosis. Biophysical Journal. 111 (3), 589-600 (2016).
  52. Gould, T. E., Jesunathadas, M., Nazarenko, S., Piland, S. G. Chapter 6 - Mouth Protection in Sports. Materials in Sports Equipment (Second Edition). Subic, A. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 199-231 (2019).
  53. Kontomaris, S. V., Malamou, A. Hertz model or Oliver & Pharr analysis? Tutorial regarding AFM nanoindentation experiments on biological samples. Materials Research Express. 7 (3), 033001(2020).
  54. Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. If cell mechanics can be described by elastic modulus: study of different models and probes used in indentation experiments. Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).
  55. Wu, C. -E., Lin, K. -H., Juang, J. -Y. Hertzian load-displacement relation holds for spherical indentation on soft elastic solids undergoing large deformations. Tribology International. 97, 71-76 (2016).
  56. Westbrook, J. H., Conrad, H. The Science of Hardness Testing and its Research Applications. , American Society for Metal. Metals Park, Ohio. (1973).
  57. Pritzker, K. P. H., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: Grading and staging. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
  58. Stylianou, A., Kontomaris, S. V., Grant, C., Alexandratou, E. Atomic force microscopy on biological materials related to pathological conditions. Scanning. 2019, 8452851(2019).
  59. Sokolov, I. Atomic force microscopy in cancer cell research. Cancer Nanotechnology. 1, 1-17 (2007).
  60. Emad, A., et al. Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 74 (3), 1564-1578 (1998).
  61. Crick, S. L., Yin, F. C. Assessing micromechanical properties of cells with atomic force microscopy: Importance of the contact point. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 6 (3), 199-210 (2007).
  62. Shoelson, B., Dimitriadis, E. K., Cai, H., Kachar, B., Chadwick, R. S. Evidence and implications of inhomogeneity in tectorial membrane elasticity. Biophysical Journal. 87 (4), 2768-2777 (2004).
  63. Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
  64. Rudoy, D., Yuen, S. G., Howe, R. D., Wolfe, P. J. Bayesian change-point analysis for atomic force microscopy and soft material indentation. Journal of the Royal Statistical Society: Series C (Applied Statistics). 59 (4), 573-593 (2010).
  65. Benítez, R., Moreno-Flores, S., Bolós, V. J., Toca-Herrera, J. L. A new automatic contact point detection algorithm for AFM force curves. Microscopy Research and Technique. 76 (8), 870-876 (2013).
  66. Timashev, P. S., et al. Cleaning of cantilevers for atomic force microscopy in supercritical carbon dioxide. Russian Journal of Physical Chemistry B. 8 (8), 1081-1086 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Atomic Force MicroscopyMicro IndentationArticular Cartilage ExplantsOsteoarthritis ProgressionCartilage Mechanical PropertiesFluorescence ImagingYoung s ModulusForce Distance CurvesSample PreparationCantilever Calibration

Related Articles