Решение практических вопросов микроиндентирования на основе атомно-силовой микроскопии на эксплантах суставного хряща человека

Summary

Представлен пошаговый подход к выявлению и решению наиболее распространенных проблем, связанных с микровдавливаниями в атомно-силовой микроскопии. В качестве примера мы приводим возникающие проблемы на экплантах суставного хряща человека, характеризующихся различными степенями дегенерации, вызванной остеоартритом.

Abstract

Без сомнения, атомно-силовая микроскопия (АСМ) в настоящее время является одним из самых мощных и полезных методов для оценки микро- и даже наносигналов в биологической области. Однако, как и в случае с любым другим микроскопическим подходом, могут возникнуть методологические проблемы. В частности, характеристики образца, пробоподготовки, тип прибора и датчик для индентирования могут привести к появлению нежелательных артефактов. В этом протоколе мы иллюстрируем эти возникающие проблемы на здоровых, а также на костно-артритных эксплантатах суставного хряща. С этой целью мы сначала покажем с помощью пошагового подхода, как генерировать, классифицировать и визуально классифицировать диски суставного хряща ex vivo в соответствии с различными стадиями дегенерации с помощью большой 2D-мозаичной флуоресцентной визуализации всей ткани. Основное преимущество модели ex vivo заключается в том, что она включает в себя старые, естественные хрящи человека, что позволяет исследовать изменения, связанные с остеоартритом, от раннего начала до прогрессирования. Кроме того, представлены общие подводные камни при подготовке тканей, а также сама процедура АСМ вместе с последующим анализом данных. Мы показываем, как основные, но важные этапы, такие как подготовка и обработка образцов, характеристики топографических образцов, вызванные прогрессирующей дегенерацией, и взаимодействие образца с наконечником образца, могут повлиять на сбор данных. Мы также тщательно изучаем наиболее распространенные проблемы в АСМ и описываем, где это возможно, способы их преодоления. Знание этих ограничений имеет первостепенное значение для правильного сбора данных, интерпретации и, в конечном счете, включения полученных результатов в широкий научный контекст.

Introduction

В связи с постоянно уменьшающимися размерами электронных устройств и систем набирает обороты стремительное развитие микро- и нанотехнологий и оборудования. Одним из таких устройств является атомно-силовая микроскопия (АСМ), которая может сканировать биологические поверхности и извлекать топографическую или биомеханическую информацию как в нано-, так и в микрометровом масштабе ^1,2. Среди его обширных возможностей можно отметить, что этот прибор может работать как в микро-, так и в нано-инденторе для получения информации о механических свойствах различных биологических систем 3,4,5,6.

Protocol

Использовались мыщелки бедренной кости, собранные у пациентов, перенесших тотальное эндопротезирование коленного сустава в университетской клинике Тюбингена, Германия. В исследование были включены только образцы суставного хряща пациентов с дегенеративными и посттравматическими патологиями суставов. До начала исследования было получено одобрение ведомственного, институционального, а также местного этического комитета (Проект No 674/2016BO2). Перед участием было получено письменное информированное согласие от всех пациентов.

ПРИМЕЧАНИЕ: Блок-схема этапов эксперимента в хронологическом порядке приведена на рисунке 1

Results

Используя самодельное режущее устройство, мы смогли эксплантировать и получить небольшие (4 мм х 1 мм) хрящевые диски из свежих мыщелков человека, содержащих единый ячеистый пространственный паттерн³⁰ одиночных нитей (SS, рис. 2A), двойных нитей (DS), малых кластеров (SC), больших кластеров (BC; рис. 2А) и диффузные (рис. 2Б). Типичный эксплант хряща изображен на рисунке 3А. Выбо.......

Discussion

Являясь прогрессирующим и многофакторным заболеванием, ОА вызывает структурные и функциональные изменения в суставном хряще. На протяжении всего течения ОА нарушения механических свойств сопровождаются структурными и биохимическими изменениями на поверхности суставного хряща^27,31. Самыми ранними патологическими явлениями, возникающими при ОА, являются истощение протеогликанов в сочетании с нарушением коллагеновой сети^32,33,34

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Амфотерицин B	Merck KGaA, Дармштадт, Германия	1397-89-3
Атомно-силовой микроскоп (АСМ) головка	CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Берлин, Германия	JPK00518
Биосовместимый образец клея	Bruker Nano GmbH, Берлин, Германия	H000033
Calcein AM	Cayman, Анн-Арбор, Мичиган, США	14948	Проницаемое окрашивание клеточной мембраны, используемое для сортировки хрящевых дисков - вид сверху
Консоль	Bruker Nano GmbH, Берлин, Германия	SAA-SPH-5UM	Номинал частоты: 30 кГц, k: 0,2 Н/м, длина nom: 115μ м, ширина nom: 40μ м,  геометрия: прямоугольный, цилиндрический наконечник с 5&м; m аппарат
для стирования хряща с конечным радиусом	Самостоятельно изготовленный	n/a	Режущее пластиковое устройство, содержащее предопределенные целые элементы камеры CDD размером 4 мм x 1 мм
интегрированной в АСМ	The Imaging Source Europe GmbH, Бремен, Германия, DFK	31BF03
CDD камера, интегрированная в флуоресцентный микроскоп	Leica Biosystems, Вецлар, Германия	DFC3000G
Cryotome	Leica Biosystems, Вецлар, Германия	CM3050S
Программное обеспечение для обработки данных для AFM	Bruker Nano GmbH, Берлин, Германия	n/a	Версия 5.0.86,  можно бесплатно загрузить со следующего веб-сайта https://customers.jpk.com
модифицированном носителе Eagle's Medium (DMEM) от Dulbecco.	Gibco, Life Technologies, Дармштадт, Германия	41966052
Флуоресцентный микроскоп (Leica DMi8)	Leica Biosystems, Вецлар, Германия	11889113
Держатель консоли стеклянного блока	Bruker Nano GmbH, Берлин, Германия	SP-90-05	Очень длинный стеклянный блок с угловыми гранями, разработанный специально для использования с JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Инвертированный фазово-контрастный микроскоп (встроенный в АСМ)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Йена, Германия	L201306_03
среде L-15 Лейбовица без L-глутамина	Merck KGaA, Дармштадт, Германия	F1315
Предметные стекла для микроскопа	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США CLS294775X50
Монтажная среда С DAPI	ibidi GmbH, Grä felfing, Германия	50011	Монтажная среда с ядерным DAPI (4′,6-диамидино-2-фенилиндол) противоокрашивание, используемая для визуализации хрящевых дисков  вид сбоку
Пенициллин-стрептомицин	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	P4333
Нагреватель чашек Петри, связанный с AFM (нагреватель тарелок Петри)	Bruker Nano GmbH, Берлин, Германия	T-05-0117
Скальпель	Feather Medical Products, Осака, Япония	2023-01
Силиконовая юбка	Bruker Nano GmbH, Берлин, Германия	н/д	Защитная силиконовая мембрана (D55x0.25), которая размещена на основе блока стекла для предотвращения конденсации среды в головке AFM.
Статистическая программа - SPSS	IBM, Armonk, Нью-Йорк, США	SPSS Statistics 22	Vesion 280.0.0.0 (190)
Чашки для культуры тканей	TPP Techno Plastic Products AG, Трасадинген, Швейцария	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Нидерланды	SA6255012	Водорастворимая среда для встраивания