Методическая статья

Модифицированная методика поперечного сужения аорты у мышей

DOI:

10.3791/64386

⸱

18 августа 2022 г.

 ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Internal Medicine, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Hubei Key Laboratory of Genetics and Molecular Mechanism of Cardiological Disorders, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящем протоколе описана модифицированная и упрощенная методика с минимально инвазивной процедурой поперечного сужения аорты (TAC) с использованием самодельного ретрактора. Эта процедура может проводиться без аппарата искусственной вентиляции легких или микроскопа и приводит к перегрузке давлением, что в конечном итоге приводит к гипертрофии сердца или сердечной недостаточности.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поперечное сужение аорты (TAC) является часто используемой операцией в исследованиях сердечной недостаточности и гипертрофии сердца, основанной на формировании перегрузки давлением на мышиных моделях. Основная задача этой процедуры состоит в том, чтобы четко визуализировать поперечную дугу аорты и точно перевязать целевой сосуд. Классические подходы выполняют частичную торакотомию, чтобы обнажить поперечную дугу аорты. Тем не менее, это модель с открытой грудной клеткой, которая вызывает довольно большую хирургическую травму и требует аппарата искусственной вентиляции легких во время операции. Чтобы предотвратить ненужную травму и упростить операционную процедуру, к дуге аорты подходят через проксимальную часть грудины, достигая и связывая целевой сосуд с помощью небольшого самодельного ретрактора, содержащего ловушку. Эта процедура может проводиться без входа в полость плевры и не требует аппарата искусственной вентиляции легких или микрохирургической операции, что оставляет мышей с физиологическими паттернами дыхания, упрощает процедуру и значительно сокращает время операции. Благодаря менее инвазивному подходу и меньшему времени операции мыши могут подвергаться меньшему количеству стрессовых реакций и быстро восстанавливаться.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сердечная недостаточность является сложным клиническим симптомом, возникающим в результате нарушения структуры и функции наполнения желудочков или выброса крови1. Стадия заболевания в основном определяется с помощью классификации функций Нью-Йоркской кардиологической ассоциации, основанной на тяжести симптомов и физической активности2. У пациентов с фракцией выброса более 50% структурные и/или функциональные нарушения повышали уровень натрийуретических пептидов для подтверждения диагноза сердечной недостаточности с сохраненной фракцией выброса (HFpEF)2. Ишемическая болезнь сердца является основной причиной множественной этиологии сердечной недостаточности. Таким образом, модель инфаркта миокарда (например, постоянная перевязка коронарных артерий) часто используется для изучения патофизиологии после гипоперфузии сердца или ишемии-реперфузионного повреждения 3,4. Помимо острого повреждения миокарда, другие факторы риска, такие как гипертония, диабет, ожирение и семейный анамнез кардиомиопатии, также способствуют развитию сердечной недостаточности. После того, как пациенты проходят стадию А (с риском сердечной недостаточности) и переходят в стадию В (предсердечная недостаточность), происходит структурная модификация1. Например, у пациентов с артериальной гипертензией сначала проходит адаптивная гипертрофия левого желудочка, а затем постепенно развивается дезадаптивная гипертрофия сердца и переход к сердечной недостаточности через патологическое ремоделирование5.

Как терминальная стадия различных сердечно-сосудистых заболеваний, хроническая сердечная недостаточность изучается на протяжении десятилетий6. Несколько моделей мышей широко использовались в исследованиях сердечной недостаточности, включая инфузию лекарств (ангиотензин II), метаболические нарушения (диабет или высококалорийная диета) и сужение аорты7. Среди этих моделей перфузия ангиотензина II сопровождается различными побочными эффектами со стороны органов, таких как почка7. Индуцирование метаболических нарушений обычно требует довольно длительного периода времени. Считается, что сужение восходящей аорты имеет ограниченное отношение к заболеваниям человека7.

TAC является надежной моделью, которая увеличивает постнагрузку и вызывает гипертрофию сердца, а также сердечную недостаточность8. Модель TAC с открытой грудной клеткой была впервые описана Rockman et al. и использовалась во многих лабораториях по всему миру9. Однако эта классическая процедура TAC наносит довольно большую травму мышам и изменяет их нормальное поведение, что может занять длительное время восстановления и нарушить дальнейшее лечение10. Другие модифицированные процедуры TAC с закрытой грудной клеткой уменьшили некоторые инвазивные шаги, но потребовали микрохирургических навыков или искусственной вентиляции легких10,11.

В настоящем протоколе подробно описан пошаговый метод с минимально инвазивным доступом к дуге аорты с использованием самодельного ретрактора через срединный разрез верхнего края грудины диаметром 3 мм. Эта модель не требует микрохирургических навыков, искусственной вентиляции легких или разрезания ребер, что обеспечивает быстрый, ограниченный хирургической травмой, несложный и недорогой способ выполнения операции TAC.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Текущий протокол одобрен комитетом по этике больницы Тунцзи, Медицинского колледжа Тунцзи, Хуачжунского университета науки и технологий, Ухань, Китай. Эта процедура проводится на взрослых самцах мышей C57/BL6 (> возрасте 10 недель). Перед операцией все хирургические инструменты были стерилизованы путем автоклавирования.

1. Подготовка хирургического инструмента

  1. Подготовьте шприц объемом 5 мл и отщипните кончик иглы иглодержателем, чтобы затупить его.
  2. Подготовьте иглу 27 г и затупите ее иглодержателем. Отрезание кончика иглы офтальмологическими ножницами является альтернативным способом затупления иглы.
  3. Согните кончик иглы 27 G на 90°.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта игла будет использоваться в качестве прокладки для привязки к аорте для сужения сосудов.
  4. Используйте коммерчески приобретенную железную проволоку (медицинскую, диаметром 0,5 мм, см. Таблицу материалов) и обвивайте иглу (рис. 1А). Сформируйте небольшую петлю или петлю на затупленном кончике иглы (рис. 1B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот многоразовый инструмент действует как специальный самодельный ретрактор и позволяет накладывать шелковый шов под аорту на последних этапах.
  5. Перед операцией автоклавируйте все хирургические инструменты (включая специальный ретрактор, сделанный выше), чтобы стерилизовать их.

2. Подготовка животных

  1. Обезболивают мышей внутрибрюшинной инъекцией раствора пентобарбитала натрия (50 мг/кг, см. Таблицу материалов) в зависимости от массы тела. Подкожно вводят 100 мкл 0,5% лидокаина локально в операционную область.
  2. Убедитесь, что мышь полностью обезболивается, ущипнув палец мыши кончиком щипцов.
  3. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
  4. Удалите волосы с горла и верхней части груди с помощью крема для депиляции или машинки для стрижки.
  5. Продезинфицируйте оголенный участок тремя чередующимися скрабами йода и 70% этанола концентрическими кругами, движущимися наружу.
  6. Поместите мышь в положении лежа на спине на грелку, покрытую стерильной простыней, так, чтобы ее голова была направлена к оператору. Зафиксируйте конечности лейкопластырем и резцами швом 4-0 (рисунок 2А).
  7. Вставьте ректальный зонд (см. Таблицу материалов) для контроля температуры тела во время операции. Поддерживайте температуру тела на уровне 37 °C в течение всей операции.
  8. Наденьте пару стерильных перчаток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После надевания стерильных перчаток не прикасайтесь к другим нестерилизованным участкам или предметам.
  9. Вырежьте отверстие (1-1,5 см в диаметре) в новой одноразовой стерильной драпировке стерилизованными офтальмологическими ножницами. Наденьте стерильную драпировку на мышь и убедитесь, что через отверстие видно непокрытое операционное поле.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг позволяет оператору не прикасаться к другим нестерилизованным участкам, что помогает поддерживать стерильные условия во время операции.

3. Сужение поперечной аорты

  1. Сделайте вертикальный разрез кожи 1,5 см на уровне надгрудинной выемки (рис. 2Б) лезвием скальпеля. Расширьте разрез кожи до уровня стернального угла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Надгрудинная насечка - это выемка, расположенная на верхнем крае манубриума грудины. Это символ поверхности, который можно обнаружить при удалении волос мыши (рис. 2B). Стернальный угол - это стык между manubrium sterni и corpora sterni. Когда грудина обнажена, она представляет собой горизонтальную белую линию на грудине на том же уровне коста секунда (рис. 2C).
  2. Осторожно отделите кожу и поверхностную фасцию и обнажив трахею и проксимальный отдел грудины. Аккуратно сделайте продольный срединный разрез на грудине 3-4 мм, начиная от верхнего края к стернальному углу (рис. 2D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разрез не должен превышать стернальный угол, так как существует риск возникновения острого пневмоторакса у мыши.
  3. Аккуратно приподнимите щипцами грудину и тимус и дугу аорты под ней. Осторожно используйте прямые щипцы и тупо рассекайте целевой сосуд и ткани вокруг него.
  4. Удерживайте ранее самодельный втягивающий шкаф (шаг 1.4), который содержал проволочную петлю на конце правой руки пользователя.
  5. Осторожно проведите петлю самодельного ретрактора под аортой между левой общей сонной артерией и началом правой безымянной артерии (рис. 2Е).
  6. Передайте самодельный ретрактор в левую руку, чтобы освободить правую руку для других инструментов.
  7. С микроскопическим пинцетом в правой руке пропустите шелковый шов 7-0 через петлю малого барабана на конце и вытащите втягивающее устройство. Это позволит оставить шелковый шов вокруг артерии для дальнейшей перевязки (рис. 2F).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны и не слишком сильно оттягивайте дугу аорты от исходного положения.
  8. Поместите иглу 27 G параллельно аорте и завяжите шов вокруг иглы и аорты (рис. 2G, H).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фиктивная процедура должна быть такой же, за исключением того, что перевязка аорты не проводится.
  9. Держитесь за иглу 27 G с помощью глазных щипцов и других щипцов, удерживающих узел, привязанный к игле 27 G и аорте. Быстро, но аккуратно вытащите иглу 27 G из перевязки (рис. 2Н).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Узел не должен быть слишком тугим, иначе вытащить иглу будет непросто. Будьте осторожны при вытаскивании иглы в случае разрыва аорты.
  10. Наложите шов на кожу синтетическим монофиламентным швом 4-0 по прерывистому шовному рисунку (рис. 2I).

4. Послеоперационный уход

  1. Положите мышь на теплую подушечку (см. Таблицу материалов) и подождите, пока она оживет. Как правило, мышь оживает примерно через 60 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Животное нельзя оставлять без присмотра до тех пор, пока оно не восстановит сознание, достаточное для основного лежачего положения грудины.
  2. Подкожно вводят 0,5 мл теплого физиологического раствора и контролируют гомеостаз жидкости животных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг предотвращает обезвоживание животных и гиповолемическое кровообращение.
  3. Наносите эритромициновую мазь на раневую поверхность каждый день в течение 3 дней.
  4. Для послеоперационного лечения боли парентерально вводят 1 мг / л местного анестетика бупренорфина в место разреза (см. Таблицу материалов).
  5. После операции следите за мышью на наличие признаков инфекции и нарушений (недоедание, сгорбленная осанка и взъерошенная шерсть).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Животные, перенесшие операцию, не возвращаются в компанию других животных до полного выздоровления.

5. Ультразвуковая визуализация

  1. Подтвердить успешную перевязку поперечной аорты можно путем расчета скорости кровотока с помощью ультразвуковой системы визуализации через12,13 (24 МГц, см. Таблицу материалов) через 28 дней после операции.
    1. Обезболивайте животное 4,5% изофлураном в 20% воздухе, обогащенном кислородом, и поддерживайте 0,5% изофлураном в 20% воздухе, обогащенном кислородом.
    2. Поместите мышь в положение лежа на спине и зафиксируйте ее конечности на электроде с помощью скотча.
    3. Используя крем для депиляции, удалите волосы на груди и нанесите ультразвуковой связующий агент на грудь.
    4. Наклоните платформу влево как можно дальше. Удерживая зонд в вертикальном положении, постепенно опускайте его вдоль правой парастернальной линии на груди так, чтобы выемка была направлена на подбородок животного.
    5. В режиме B инструмента отрегулируйте оси X и Y до тех пор, пока дуга аорты и место сужения не станут четко видны.
    6. Нажмите кнопку «Допплер пульсовой волны», чтобы переключиться в режим пульсовой волны .
    7. Отрегулируйте пунктирное поле объема образца курсора дистальнее суженного участка и найдите стенотическую струю с наибольшей скоростью.
    8. Нажмите кнопку « Допплер пульсовой волны » еще раз, чтобы получить форму волны аортального потока и измерить пиковую скорость. Рассчитайте скорость кровотока в соответствии с пиком волновых паттернов (рис. 3A, B).
    9. Переведите тепловизор в режим B. Поставьте платформу в горизонтальное положение. Поверните зонд на 30° влево от парастернальной линии.
    10. Отрегулируйте оси X и Y, чтобы получить вид короткой оси. Нажмите режим M, чтобы отобразить линию индикатора, и нажмите Cine Store, чтобы сохранить изображение для последующего измерения толщины стенки сердца, размера камеры и фракции выброса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Формула для расчета фракции выброса: 100% * ((LV Vol;d - LV Vol;s) / LV Vol;d). Формула для расчета сердечного выброса: Ударный объем * Частота сердечных сокращений (на первом нарисованном кадре) / 1000. Большинство показателей, таких как фракция выброса и сердечный выброс, могут быть измерены автоматически с помощью программного обеспечения системы ультразвуковой визуализации. LV Vol;d: диастолический объем левого желудочка. LV Vol;s: систолический объем левого желудочка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После успешной операции TAC перегрузка давлением была обнаружена с помощью системы ультразвуковой визуализации. Через четыре недели после операции у мышей снижается функция сердца. В настоящем исследовании эффективность хирургии TAC была подтверждена с помощью фракции выброса (EF), фракционного укорочения (FS), массы левого желудочка (массы LV) и внутреннего диаметра левого желудочка (LVID) у мышей, перенесших операцию TAC через 4 недели. EF был значительно снижен у мышей с TAC через 4 недели по сравнению с фикт...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Индукция устойчивой перегрузки давлением может постепенно вызвать сердечную гипертрофию и сердечную недостаточность. Эта модель использовалась во многих лабораториях по всему миру14,15,16. Протокол обеспечил улучшенный метод TAC, который не требует микрохирургических навыков или искусственной вентиляции легких.

Важнейшим этапом в этом протоколе является наложение шелкового шва под дугой аорты. Когда п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявили об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа финансируется Национальным фондом естественных наук Китая (NSFC 81822002). Мы благодарим всех членов, которые приняли участие в этой работе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4-0 нерассасывающийся шовный материалJinhuanHM403Используется для наложения швов
на кожу 5 мл шприцHaifuda Technology Co., Ltd.BD-309628Используется для изготовления ловушки, содержащей ретрактор
7-0 нерассасывающийся шовJinhuanHM701Используется для перевязки аорты
Монитор температуры животныхKaerwenFT3400Используется для контроля температуры тела
Бупренорфин SigmaB-044Используется для лечения послеоперационной боли
Крем для депиляции VeetN/AИспользуется для удаления волос на теле в области операции
ГрелкаXiaochuangxinN/AИспользуется для поддержания температуры тела
IbuprofenMCEHY-78131Используется для лечения послеоперационной боли
Железная проволока (0,5 мм)Qing YuanЖелезная проволока #26Используется для изготовления силка, содержащего ретрактор
Микроскопический пинцетRWDF12006-10Используется для проникновения и разделения тканей до открытого операционного пространства
ИглодержательRWDF12005-10Используется для отщипывания кончика измерительной иглы и его затупления
Офтальмологический щипецRWDF14012-10 Используется для удержания кожи и других тканей
Офтальмологические ножницыRWDS11001-08Используются для нанесения разреза на мышь
Пентобарбитал натрияSigmaP3761Используются для анестезии мышей
Стерильный операционный коврикHale & Hearty211002Используются для размещения животного во время операции
Ультразвуковая система визуализацииFujifilm visualsonicsvevo1100Используется для измерения скорости кровотока, толщины стенки левого желудочка и фракции выброса, https://www.visualsonics.com/product/imaging-systems/vevo-1100

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heidenreich, P. A., et al. AHA/ACC/HFSA Guideline for the Management of Heart Failure: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Joint Committee on Clinical Practice Guidelines. Circulation. 145 (18), 895(2022).
  2. McDonagh, T. A., et al. ESC Guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure. European Heart Journal. 42 (36), 3599(2021).
  3. Lv, B., et al. Induction of myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury in mice. Journal of Visualized Experiments. (179), e63257(2022).
  4. Curaj, A., Simsekyilmaz, S., Staudt, M., Liehn, E. Minimal invasive surgical procedure of inducing myocardial infarction in mice. Journal of Visualized Experiments. (99), e52197(2015).
  5. Nakamura, M., Sadoshima, J. Mechanisms of physiological and pathological cardiac hypertrophy. Nature Reviews Cardiology. 15 (7), 387-407 (2018).
  6. Wang, H., et al. Bibliometric analysis on the progress of chronic heart failure. Current Problems in Cardiology. 47 (9), 101213(2022).
  7. Riehle, C., Bauersachs, J. Small animal models of heart failure. Cardiovascular Research. 115 (13), 1838-1849 (2019).
  8. Melleby, A. O., et al. A novel method for high precision aortic constriction that allows for generation of specific cardiac phenotypes in mice. Cardiovascular Research. 114 (12), 1680-1690 (2018).
  9. Rockman, H. A., Wachhorst, S. P., Mao, L., Ross, J. ANG II receptor blockade prevents ventricular hypertrophy and ANF gene expression with pressure overload in mice. The American Journal of Physiology. 266, 2468-2475 (1994).
  10. Eichhorn, L., et al. A closed-chest model to induce transverse aortic constriction in mice. Journal of Visualized Experiments. (134), e57397(2018).
  11. Tavakoli, R., Nemska, S., Jamshidi, P., Gassmann, M., Frossard, N. Technique of minimally invasive transverse aortic constriction in mice for induction of left ventricular hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (127), e56231(2017).
  12. Lang, R. M., et al. Recommendations for cardiac chamber quantification by echocardiography in adults: an update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging. Journal of the American Society of Echocardiography. 28 (1), 1-39 (2015).
  13. Li, L., et al. Assessment of cardiac morphological and functional changes in mouse model of transverse aortic constriction by echocardiographic imaging. Journal of Visualized Experiments. (112), e54101(2016).
  14. Wang, X., et al. ATF4 protects the heart from failure by antagonizing oxidative stress. Circulation Research. 131 (1), 91-105 (2022).
  15. Li, J., et al. GCN5-mediated regulation of pathological cardiac hypertrophy via activation of the TAK1-JNK/p38 signaling pathway. Cell Death & Disease. 13 (4), 421(2022).
  16. Syed, A. M., et al. Up-regulation of Nrf2/HO-1 and inhibition of TGF-beta1/Smad2/3 signaling axis by daphnetin alleviates transverse aortic constriction-induced cardiac remodeling in mice. Free Radical Biology and Medicine. 186, 17-30 (2022).
  17. Zaw, A. M., Williams, C. M., Law, H. K., Chow, B. K. Minimally invasive transverse aortic constriction in mice. Journal of Visualized Experiments. (121), e55293(2017).
  18. Lao, Y., et al. Operating transverse aortic constriction with absorbable suture to obtain transient myocardial hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (163), e61686(2020).
  19. Veldhuizen, R. A., Slutsky, A. S., Joseph, M., McCaig, L. Effects of mechanical ventilation of isolated mouse lungs on surfactant and inflammatory cytokines. European Respiratory Journal. 17 (3), 488-494 (2001).
  20. Withaar, C., Lam, C. S. P., Schiattarella, G. G., de Boer, R. A., Meems, L. M. G. Heart failure with preserved ejection fraction in humans and mice: embracing clinical complexity in mouse models. European Heart Journal. 42 (43), 4420-4430 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи