Здесь мы описываем новое, простое и недорогое устройство для успешного выполнения анализов фотодинамической терапии in vitro (PDT) с использованием двумерной культуры клеток HeLa и вертепорфина в качестве фотосенсибилизатора.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Собственное устройство фотодинамической терапии на основе светодиодов для повышения цитотоксичности вертепорфина в 2D-модели клеточной культуры
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В этой статье описывается новое, простое и недорогое устройство для выполнения анализов фотодинамической терапии in vitro (PDT), названное PhotoACT. Устройство было построено с использованием набора обычных программируемых светодиодов (LED), модуля жидкокристаллического дисплея (LCD) и датчика освещенности, подключенного к плате коммерческого микроконтроллера. Коробчатая конструкция прототипа была выполнена из древесноволокнистых плит средней плотности (MDF). Внутренний отсек может одновременно выделять четыре многоязычные микропластины клеточной культуры.
В качестве доказательства концепции мы изучили цитотоксический эффект фотосенсибилизатора (PS) вертепорфина против клеточной линии HeLa в двумерной (2D) культуре. Клетки HeLa обрабатывали повышением концентрации вертепорфина в течение 24 ч. Лекарственно-содержащую надпосадочную среду выбрасывали, адгезивные клетки промывали фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) и добавляли безмедикаментозную среду. В этом исследовании влияние вертепорфина на клетки изучали либо без воздействия света, либо после воздействия света в течение 1 ч с использованием красно-зелено-синих (RGB) значений 255, 255 и 255 (средняя плавность 49,1 ± 0,6 Дж/см2). Через 24 ч жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализа 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ).
Экспериментальные результаты показали, что воздействие на клетки, обработанные вертепорфином, на свет от устройства усиливает цитотоксический эффект препарата через механизм, опосредованный активными формами кислорода (АФК). Кроме того, использование прототипа, описанного в этой работе, было подтверждено путем сравнения результатов с коммерческим устройством PDT. Таким образом, этот прототип фотодинамической терапии на основе светодиодов представляет собой хорошую альтернативу для исследований ФДТ in vitro .
Введение
Среди наиболее смертоносных неинфекционных заболеваний рак представляет собой ведущую глобальную причину преждевременной смерти. На его долю пришлось почти 10 миллионов смертей в 2020 году, что составляет примерно одну из шести смертей во всем мире1. Кроме того, явление множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) представляет собой огромную угрозу для общественного здравоохранения, поскольку утвержденные химиотерапевтические протоколы не достигают стадий ремиссии для этого клинического состояния2. Раковые клетки могут развивать устойчивость к химиотерапии через несколько механизмов; однако сверхэкспрессия некоторых АТ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации , относящейся ко всем материалам, реагентам и программному обеспечению, используемым в этом протоколе.
1. Конструкция устройства
- Пила пилой древесноволокнистых плит средней плотности (МДФ) толщиной 3 мм для получения кусков с размерами, указанными на рисунке 1А.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте векторный файл (Дополнительный файл 1) для резки с числовым программным управлением (ЧПУ). - Постройте две коробки со следующими размерами (длина х ширина х высота): 330 мм x 235 мм x 225 м....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Последнее устройство PDT, названное PhotoACT, включало темную камеру для выделения до четырех многолуночных микропластин, а его верхняя внутренняя поверхность была оснащена набором из 30 рассеянных светодиодов, запрограммированных на испускание различных спектров видимого света (рисунок 3 и дополнительный файл 6). Устройство было построено с использованием двух связанных коробок: внутренней коробки, спроектированной как темная камера для анализов PDT, и внешней коробки для п.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Окончательное устройство PhotoACT было удобно строить с коммерчески доступными недорогими компонентами общей стоимостью менее 50 долларов. Дополнительные преимущества включают в себя низкие требования к техническому обслуживанию, способность облучать несколько типов культуральных пластин, одновременное использование до четырех единиц на анализ, малый вес (2 кг) / размер (44 см3), который обеспечивает портативность, точное и воспроизводимое облучение (данные не показаны), а также удобный и простой интерфейс нас.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Благодарности
Мы благодарим Артура Энрике Гомеса де Оливейру и Лукаса Джулиана Круза Гомеса за помощь в съемочном процессе. Этот проект был поддержан Бразильским исследовательским советом (CNPq, номера грантов 400953/2016-1-404286/2021-6) и Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003). Это исследование было также частично профинансировано Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,5% трипсин-ЭДТА (10 раз) | Gibco | 15400054 | Реагент для диссоциации клеточной культуры млекопитающих |
| 3D-принтер | Flashforge | Finder модель | |
| 96-луночных планшетов Нестерильные | , полистирольные и высокосвязывающие поверхностные пластины с плоским дном, используемые для 2D-клеточной культуры | ||
| Датчик | |||
| TSL2561 модель с уровнями обнаружения 0,1-40.000+ люкс и интерфейсом I2C | |||
| Кнопки | |||
| Зуммер | |||
| Колбы | Стерильные, полистирольные, прямоугольные донные колбы с поверхностью, обработанной тканевой культурой (TC), скошенной горловиной и вентиляционной крышкой (размеры) | ||
| Центрифужные пробирки | Стерильные полипропиленовые пробирки емкостью 15/50 мл, используемые для разведения клеточной культуры на стадии посева анализа | ||
| CO2 Плата | |||
| ESP32 | |||
| DMEM (модифицированная орлиная среда Дульбекко) является широко используемой базальной средой для поддержки роста многих различных клеток млекопитающих. | |||
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | Диметилсульфоксид, ≥ 99,5% (GC), подходит для культуры растительных клеток |
| Фетальная бычья сыворотка | Gibco | 12657029 | FBS обеспечивает наилучшее соотношение цены и качества, обеспечивая постоянство роста клеток с течением времени и проходов. |
| Гентамицин (50 мг/мл) | Gibco | 15750060 | Водорастворимый антибиотический препарат, первоначально очищенный от гриба Микромоноспора пурпурная. Гентамицин действует, предотвращая загрязнение клеточной культуры |
| Гемоцитометр | Neubauer узорчатая камера, используемая для подсчета клеток на этапе посева анализа | ||
| Инвертированный лабораторный микроскоп | Leica | DM IL LED | |
| Laminar Flow Hood | Cabin предназначен для защиты рабочей среды от загрязнений путем поддержания постоянного, однонаправленного потока воздуха, отфильтрованного HEPA, над рабочим процессом площадь. Используется на нескольких этапах культивирования клеток и лечебных процедур | ||
| ЖК-дисплей | |||
| LED RGB WS2812 | модели 5050 RGB SMD со встроенным процессором. Лента с 30 светодиодами, длиной 1 метр и мощностью 9 Вт | ||
| МДФ ДВП | толщиной 3 мм ДВП средней плотности | ||
| Микроцентрифужные пробирки | стерильные, полипропиленовые пробирки с безопасной крышкой и емкостью 1,5/2,0 мл. Удобные инструменты для манипуляций с малыми объемами на этапе обработки анализа | ||
| Микропланшетный ридер | ThermoFischer | Multiskan FC Microplate Photometer предназначен для обнаружения широкого диапазона длин волн поглощения (340-850 нм). Оборудование использовалось для оценки жизнеспособности клеток после инкубации МТТ. | |
| Реактив МТТ | Инвитроген | М6494 | 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид. Используется для анализа жизнеспособности клеток |
| Операционная система | Real Time Engineers ltd. | FreeRTOS | |
| P10 микрипипетка | Неэлектронная, одноканальная, 1-10 μ Емкость | ||
| L P1000 микропипетка | Неэлектронная, одноканальная, 10-1000 мкм; Емкость L | ||
| P200 микропипетка | Неэлектронная, одноканальная, 20-200 мкм; L емкость | ||
| PDT Оборудование | LumaCare | Model LC-122 | |
| Фосфат-буферизированный физиологический раствор pH 7,4 | Gibco | 10010031 | Сбалансированная солевая формула, используемая для промывки клеток во время культивирования и процедур анализа Наконечники |
| потенциометра | |||
| Нестерильные | , универсальные подходящие, 10/200/1000 μ L максимальные объемы | ||
| Вертепорфин | Сигма-Олдрич | SML0534-5 мг | Вертепорфин, ≥ 94% (ВЭЖХ) |
Ссылки
- Ferlay, J., et al. International agency for research on cancer. Global Cancer Observatory: Cancer Today. 23 (7), https://gco.iarc.fr/today/home 323-326 (2018).
- Gottesman, M. M., Fojo, T., Bates, S. E. Multidrug resistance in cancer: role of Atp-dependent tran....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
