Микрокосмы компоста как микробно разнообразные, естественные среды для исследования микробиома в Caenorhabditis elegans

Нематода Caenorhabditis elegans становится полезной моделью для изучения взаимодействий между хозяевами и их кишечными микробиомами ^1,2. Как модель, он предлагает несколько преимуществ. Во-первых, животные, свободные от микробов или гнотобиотические животные, легко получить и содержать; отбеливатель может быть использован для уничтожения гравидных червей и связанных с ними микробов, оставляя их устойчивые к отбеливанию яйца невредимыми для роста в качестве синхронизированных по возрасту популяций, которые могут быть колонизированы бактериями, представляющими интерес ^3,4. Кроме того, при выращивании в присутствии бактерий C. elegans, бактеривора, проглатывает встречающиеся бактерии, при этом восприимчивые виды перевариваются или выводятся, в то время как устойчивые и стойкие виды стабильно колонизируют кишечник червя. Кроме того, C. elegans в основном гермафродитны, производя популяции генетически идентичного потомства, что уменьшает смешение генетических вариаций. В сочетании с наличием мутантных и трансгенных штаммов червей, работа с C. elegans предлагает исследователям гнотобиотическую и генетически поддающуюся обработке модель для исследования молекулярных основ взаимодействий хозяин-микроб 5,6,7,8.

В то время как эксперименты с хорошо охарактеризованными бактериями могут облегчить анализ молекулярных механизмов, выявление и изучение бактерий, с которыми черви взаимодействуют в природе, имеет важное значение для изучения разнообразия таких механизмов, разгадки естественного контекста для их функции и понимания селективных сил, которые сформировали их эволюцию. За пределами лаборатории C. elegans встречается во всем мире во влажном умеренном климате, где, как полагают, популяции подвергаются жизненному циклу «бума и спада», характеризующемуся быстрым ростом населения, когда ресурсы в изобилии, с последующим переходом развития к новаторским, стрессоустойчивым дауэрам, когда ресурсы истощаются⁹. Несмотря на то, что популяции C. elegans считаются почвенной нематодой, размножающиеся в дикой природе, чаще всего питаются разлагающимся органическим материалом, таким как гниющие цветы или фрукты, где бактериальные популяции многочисленны и разнообразны.

Исследования кишечного микробиома у нематод, выделенных из дикой природы, выявили разнообразные, но характерные бактериальные сообщества^10,11, состав которых был дополнительно подтвержден исследованиями, проведенными с червями, выращенными в естественно-подобных микромировых средах^12,13. Вместе такие исследования позволили очертить основной микробиом кишечника червя². В то время как выборка популяций C. elegans в дикой природе представляет собой наиболее непосредственное исследование естественных взаимодействий червей и микробов, она не осуществима везде и в любое время, поскольку она ограничена регионами и сезонами с достаточным количеством осадков^10,11. В качестве альтернативы, вместо выделения червей из их естественной среды обитания, эксперименты с использованием микрокосм приносят естественную среду обитания в лабораторию ^{6,8,12,13,14,15}. Микромировые среды получают из почвы, компостированной различными фруктами или овощами, что позволяет дополнительно диверсифицировать исходное почвенное сообщество. Они предлагают поддающиеся обработке экспериментальные методы, которые сочетают микробное разнообразие и трехмерную дикую почвенную среду с экспериментальными преимуществами контролируемой лабораторной установки и генетически определенных штаммов червей. В приведенном ниже протоколе подробно описываются этапы, связанные с работой с компостными микрокосмами, демонстрируя их использование в понимании сборки характерного микробиома кишечника червя из различных сред.

1. Приготовление компоста

1. Получите компост или садовую почву из любого удобного источника и храните внутри лаборатории в стандартном кухонном пластиковом контейнере с отверстиями, вырезанными в крышке, чтобы впустить воздух. Заткните отверстия ватой, чтобы не допустить плодовых мух и других беспозвоночных (рисунок 1А).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пятьсот граммов почвы (помещаются в контейнер объемом 1,5 галлона, размеры: 30 см х 20 см х 10 см) обеспечат достаточно материала для 12 микрокосм.
2. Обогатите компост или почву измельченным продуктом или смесью различных продуктов в массовом соотношении продукта к почве 1:2.
3. Инкубировать в течение 7-14 дней при 20-25 °C, смешивая один раз в день и добавляя среду M9 по мере необходимости для поддержания влаги, не делая ее грязной.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Почвы, не обогащенные продуктами, обычно не поддерживают рост C. elegans , но какой конкретный продукт использовать, зависит от исследователя, со многими типами и смесями, способными поддерживать рост червей. Обогащение различными продуктами будет способствовать диверсификации бактериального сообщества различными способами, позволяя изучать сборку кишечного микробиома из разных отправных точек (см. раздел обсуждения).

2. Приготовление микрокосм компоста

1. Для каждого микромира добавьте 10 г обогащенного компоста в стеклянный стакан объемом 30 мл, покрытый оловянной фольгой и автоклавом (рисунок 1B).
2. Чтобы приготовить микробный экстракт для пополнения автоклавного компоста, начните с добавления 30 г того же компоста, который использовался на этапе 2.1, в каждый из трех пробирок по 50 мл и заполните М9. Вихрь в течение 1 мин (рисунок 1С).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно обеспечить достаточное количество бактерий для девяти микрокосм, каждая из которых поддерживает развитие сотен нематод.
3. Центрифугируют пробирки по 560 × г в течение 5 мин при комнатной температуре (RT).
4. Обращая внимание на то, чтобы не потревожить гранулу, удалите супернатанты серологической пипеткой и соедините в новую трубку объемом 50 мл.
5. Сконцентрируйте бактериальный экстракт путем центрифугирования на максимальной скорости (2000 × г) в течение 15 мин при RT. Повторно суспендируйте гранулы в достаточном количестве M9, чтобы иметь 200 мкл на каждый микрокосм и еще 200 мкл, чтобы добавить к пластине, которая будет служить видимым прокси развития червей внутри микрокосм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Например, для девяти микрокосм повторно суспендировать микробную гранулу в 2 мл M9.
6. Добавьте 200 мкл концентрированного микробного экстракта в каждый стакан автоклавного компоста, а также в пластину NGM, которая будет служить видимой прокси-пластиной.
7. Инкубировать микрокосмы и прокси-пластину в течение 24 ч при 20-25 °С перед добавлением червей.

3. Выращивание червей в компостных микрокосмах

1. Добавьте 500-1000 яиц или личинок L1³ к каждому микрокосму и к прокси-пластине (шаг 2.7), чтобы начать эксперимент (рисунок 1D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В экспериментах, описанных здесь, используются черви дикого типа N2. Тем не менее, другие штаммы C. elegans (и, возможно, другие нематоды) могут быть использованы.
2. Поднимите червей до зрелого возраста при 20 °C (обычно 3 дня).

Рисунок 1: Подготовка микрокосмов компоста, выращивание червей и сбор урожая. (А) Обогатите местную почву или компост продуктами и инкубируйте в течение 2 недель. Смешайте (B) автоклавную обогащенную почву с (C) микробным экстрактом и (D) инкубируйте в течение не менее 24 ч, прежде чем добавлять синхронизированных червей L1s в микрокосмы, чтобы начать эксперимент. (Е, Ф) Когда будете готовы к сбору урожая, добавьте компост из микромира в цилиндр поддержки воронки Baermann и накройте M9. (G) Через 15 мин выпустите фильтрат в пробирку объемом 50 мл. Аббревиатура: суп. = сверхнатант. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Подготовка воронки Baermann для заготовки червей

1. Соберите воронку Baermann, прикрепив 5-8 см жесткой резиновой трубки к концу пластиковой воронки.
2. Сдвиньте зажим на трубку и зажмите его.
3. Поместите в воронку цилиндрическую трубу из ПВХ длиной 7 см, диаметром 5 см с приклеенной на ее дне нейлоновой сеткой 1 мм (рисунок 1Е). Выровняйте цилиндр двумя листами папиросной бумаги.
4. Поместите воронку Baermann в колбу (рисунок 1F).

5. Сбор червей из микрокосмов и сбор соответствующих образцов почвы

1. Добавьте 20 мл M9 в микромир, в котором были подняты черви, перемешайте смесь, а затем вылейте смесь из стакана в цилиндр с папиросной бумагой в воронке Baermann. Добавьте еще M9, чтобы полностью погрузить компост в воронку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Популяции C. elegans (N2) достигают зрелого возраста в компостных микрокосмах с той же скоростью, что и на стандартных агаровых пластинах, засеянных кишечной палочкой. Для дальнейшей точности в сборе червей на определенной стадии развития обратитесь к прокси-пластине из шага 3.3.
2. Через 30 мин отстегните зажим, чтобы освободить фильтрат, содержащий собранных червей, в трубку объемом 50 мл (рисунок 1G).
3. Добавьте больше M9 в цилиндр и повторите для второго раунда, чтобы собрать больше червей, и еще раз, если требуются дополнительные черви.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При повторении раундов сбора урожая будьте осторожны, чтобы не поставить под угрозу целостность папиросной бумаги, которая может позволить частицам почвы пройти. Максимум четыре раунда сбора урожая должны изолировать не менее 50% червей, первоначально добавленных в микромир, без ущерба для целостности папиросной бумаги.
4. Концентрировать червей путем центрифугирования при 560 × г в течение 2 мин (RT). Удалите 35 мл супернатанта серологической пипеткой.
5. Переложите оставшиеся 15 мл в трубку объемом 15 мл и снова центрифугу при 560 × г в течение 1 мин для дальнейшей концентрации червей. Удалите 14 мл супернатанта серологической пипеткой.
6. Параллельно соберите 1 г оставшейся почвы микромира в трубку объемом 1,5 мл. Немедленно обработайте образцы почвы, содержащие экологическое бактериальное сообщество, или храните их при -20 °C для последующей экстракции нуклеиновых кислот, как описано ниже для образцов червей.

6. Промывка и поверхностная стерилизация заготовленных червей

1. Переложите 1 мл концентрированных, собранных червей со стадии 5,5 на трубку объемом 1,5 мл с помощью стеклянной пипетки. Инкубировать в течение 2 мин, чтобы черви осели на дне трубки. Удалите супернатант, оставив дно 100 мкл нетронутым.
2. Промывайте 6x с 1,5 мл M9 + T (0,025% Triton-X в M9), позволяя червям каждый раз оседать на дне.
3. Перенесите промытых червей в объеме 100 мкл в новую трубку объемом 1,5 мл с помощью стеклянной пипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе протокола должно было пройти примерно 30 минут с момента первой стирки (шаг 6.2). Позволяя червям оставаться без пищи в течение не менее 1 ч до добавления левамизола, рекомендуется обеспечить выведение преходящих бактерий и полное переваривание пищевых бактерий.
4. Добавьте 100 мкл 25 мМ гидрохлорида левамизола, чтобы парализовать червей. Инкубировать в течение 5 мин на РТ.
5. Добавить 200 мкл 4% раствора отбеливателя. Инкубировать в течение 2 мин.
6. Удалите супернатант, оставив самое нижнее 150 мкл нетронутым, и вымойте 3x с M9 + T, как указано выше.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму загрязнение образцов, рекомендуется использовать фильтрованный M9 + T (через фильтр 0,2 мкм) и носить перчатки с этого момента.
7. После промывки возьмите 50 мкл из оставшихся 150 мкл от последней промывки и пластины на пластине LB, инкубируя при 25 °C в течение 48 ч, чтобы подтвердить эффективное удаление внешних бактерий.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдение до 30 колоний в последней промывке (представляющих 60 внешних бактериальных клеток, в общей сложности оставшихся в образце) разрешено и, как ожидается, будет иметь лишь незначительный вклад в анализируемый состав микробиома, учитывая тысячи бактерий, которые обычно колонизируют каждого взрослого червя¹⁵. Когда наблюдается больше, целостность образца может быть нарушена.
8. Немедленно используйте поверхностно-стерилизованных червей (например, для извлечения живых бактерий для культивирования [количество КОЕ]) или храните при -20 °C для последующей экстракции нуклеиновых кислот.

7. Извлечение ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги описывают экстракцию ДНК собранных червей с использованием коммерческого набора, предназначенного для извлечения микробной ДНК из почвы (см. Таблицу материалов), с модификациями, описанными ниже, чтобы облегчить извлечение микробной ДНК из червей.

1. Перенесите образец, содержащий поверхностно-стерилизованных червей (при необходимости размораживающий при RT), в трубки, предусмотренные комплектом, заменив предоставленные стеклянные шарики шариками диаметром циркония диаметром примерно 30-50 1 мм (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдаемые выходы ДНК выше с шариками циркония, чем со стеклянными бусинами, предоставляемыми набором. Хотя причина этого наблюдения остается неопределенной, шарики циркония могут более эффективно разрушать кутикулу нематоды, высвобождая больше бактерий.
2. Для образцов компоста добавьте примерно 250 мг собранной почвы в трубки комплекта без замены стеклянных шариков.
3. После добавления буферного раствора, предусмотренного комплектом, ко всем образцам гомогенизируют с помощью силового гомогенизатора на RT (см. Таблицу материалов) в течение двух раундов по 2000 об/мин в течение 30 с каждый, делая паузу на 30 с между ними.
4. Завершите оставшиеся этапы очистки ДНК в соответствии с протоколом набора. Элюируют образцы червей не более чем в 50 мкл элюционного буфера, чтобы обеспечить концентрации ДНК, которые достаточно высоки для секвенирования.

Чтобы изучить способность диверсифицировать сообщество почвенных микрокосмов, мы сравнили микробные сообщества в компостных микрокосмах, полученных путем обогащения одной и той же исходной почвы, компоста промышленного класса, доступного из города Беркли, штат Калифорния, различными продуктами: яблоками, болгарским перцем, апельсинами или картофелем (каждый набор в трех экземплярах). Мы также сравнили микробные сообщества каждой компостной среды с кишечным микробиомом диких C. elegans , выращенных в соответствующем микромире. Анализ проводился с образцами ДНК, извлеченными примерно из 500 поверхностно стерилизованных взрослых на микрокосм и из образцов компоста 250 мг соответствующих микрокосм.

Характеристика экологических микробиомов почвы и кишечника червей основывалась на секвенировании следующего поколения области V4 бактериального гена 16S рРНК. Подготовка библиотеки секвенирования осуществлялась с использованием стандартных комплектов и выполнялась в соответствии с инструкциями производителей, при этом секвенирование выполнялось на коммерческом секвенсоре (см. Таблицу материалов). Демультиплексированные последовательности обрабатывали с использованием DADA2, присваивали таксономию на основе справочной базы данных SILVA v132 и анализировали с помощью phyloseq 16,17,18 (см. Дополнительный файл 1, Дополнительный рисунок S1, Дополнительный рисунок S2, Дополнительный рисунок S3, Дополнительная таблица S1 и Дополнительная таблица S2 для подробного описания последовательности и анализа; полный вычислительный конвейер доступен в GitHub [https://github.com/kennytrang/CompostMicrocosms]). Необработанные данные доступны в архиве чтения последовательностей NCBI (идентификатор биопроекта PRJNA856419).

В среднем на выборку было получено 73 220 последовательностей. Эти последовательности представляют собой 15 027 вариантов последовательности ампликонов (ASV), охватывающих 27 типов и 216 семейств, включая семейства, считающиеся частью основного микробиома кишечника C. elegans 13, такие как Rhizobiaceae, Burkholderiaceae и Bacillaceae. Enterobacteriaceae и Pseudomonadaceae, которые ранее были признаны доминирующими членами, на этот раз были меньшинством, но все еще были обогащены (в 2-10 раз) по сравнению с их соответствующими почвенными средами. Сравнения, основанные как на невзвешенных, так и на взвешенных расстояниях UniFrac19,20, продемонстрировали хорошую воспроизводимость среди трипликатов микромира, обогащенных одним и тем же продуктом, о чем свидетельствует тесная кластеризация. Напротив, экологические почвенные микробиомы, обогащенные различными продуктами, сгруппированными вдали друг от друга, демонстрируя способность диверсифицировать исходное микробное сообщество путем добавления различных продуктов (рисунок 2).

При сравнении микробиомов кишечника червей и экологических сообществ анализ основных координат (PCoA) с невзвешенными или взвешенными расстояниями UniFrac показал отчетливую кластеризацию микробиомов кишечника червей вдали от их соответствующих сред для каждого типа микромира (рисунок 2). В то время как PCoA, основанный на невзвешенных расстояниях UniFrac, не проводил различий между микробиомами почвы и червей (рисунок 2A), кластеризация на основе взвешенных расстояний выявила четкое разделение микробиомов кишечника червя и компоста (рисунок 2B). Эти результаты поддерживают процесс, в котором фильтрация хозяина работает на экологическую доступность для формирования кишечного микробиома, который не полностью отличается от своего экологического источника в отношении присутствия таксонов, но модулирует их численность, обогащая подмножество доступных таксонов, что в конечном итоге приводит к основному микробиому кишечника червя, разделяемому между червями, выращенными в разных средах.

Рисунок 2: Микробиомы кишечника червей группируются вдали от их соответствующих пищевых разнообразных микробных сред. Состав микробиома определяли с помощью секвенирования 16S, и сообщества из микрокосм, обогащенных назначенным продуктом, или из червей, выращенных в них, группировали с использованием PCoA на основе (A) невзвешенных или (B) взвешенных расстояний UniFrac. Показаны оси, которые объясняют наибольшие различия в составе сообщества между образцами (N = 3 для каждого типа микромира). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: Секвенирование и анализ данных нового поколения. Здесь представлены шаги по подготовке библиотеки, лабораторному секвенированию и анализу данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S1: Пример графика контроля качества для обратного считывания из одного образца. Ось X (цикл) показывает положение нуклеотида вдоль считываемой последовательности. Левая ось Y показывает показатель качества. Тепловая карта в оттенках серого представляет частоту показателя качества в каждой нуклеотидной позиции; зеленая линия изображает медианный показатель качества в каждой нуклеотидной позиции; верхняя оранжевая линия изображает квартили распределения показателей качества; нижняя красная линия изображает процент показаний последовательности, которые расширили это положение нуклеотида (правая ось Y, здесь 100%). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S2: Частота ошибок для различных образцов. Частота ошибок в различных выборках (черные точки) должна уменьшаться с увеличением показателя качества для каждой возможной замены пары оснований, отражающей ожидаемую тенденцию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S3: Пример PCoA на основе взвешенных расстояний UniFrac. Названия групп, показанные в легенде, представляют продукт, используемый для обогащения компоста, используемого в различных микрокосмах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица S1: Последовательная фильтрация последовательностей. a Количество последовательностей, считываемых перед фильтрацией. b-d Каждый столбец представляет количество показаний последовательностей, оставшихся после этапа фильтрации: фильтрация считываний низкого качества (шаг 2.5), алгоритм шумоподавления, выполняемый dada() (шаг 2.8), слияние прямого и обратного считывания (шаг 2.9) и удаление химер (шаг 2.11). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица S2: Таблица метаданных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Авторы не имеют конфликта интересов, чтобы заявить, что имеют отношение к содержанию данной статьи.