Характеристика патогенного штамма Escherichia coli , полученного из Oreochromis spp. Фермы с использованием секвенирования всего генома

Summary

Осуществимость стратегий секвенирования всего генома (WGS) с использованием настольных инструментов упростила опрос генома каждого микроба, имеющего отношение к общественному здравоохранению в лабораторных условиях. Описана методологическая адаптация рабочего процесса для бактериальных WGS и представлен конвейер биоинформатики для анализа.

Abstract

Аквакультура является одним из самых быстрорастущих секторов производства продуктов питания во всем мире, а выращивание тилапии (Oreochromis spp.) представляет собой основной культивируемый сорт пресноводных рыб. Поскольку практика аквакультуры восприимчива к микробному загрязнению, полученному из антропогенных источников, необходимо широкое использование антибиотиков, что приводит к тому, что системы аквакультуры становятся важным источником устойчивых к антибиотикам и патогенных бактерий, имеющих клиническое значение, таких как Escherichia coli (E. coli). Здесь устойчивость к противомикробным препаратам, вирулентность и мобиломные особенности патогенного штамма E. coli , извлеченного из внутреннего выращивания Oreochromis spp., были выяснены с помощью секвенирования всего генома (WGS) и анализа in silico . Было проведено тестирование чувствительности к противомикробным препаратам (AST) и WGS. Кроме того, филогенетическая группа, серотип, типирование многолокусных последовательностей (MLST), приобретенная устойчивость к противомикробным препаратам, вирулентность, содержание плазмиды и профагов были определены с использованием различных доступных веб-инструментов. Изолят E. coli проявлял только промежуточную восприимчивость к ампициллину и характеризовался как штамм ONT:H21-B1-ST40 путем типирования на основе WGS. Хотя был обнаружен только один ген, связанный с устойчивостью к противомикробным препаратам [mdf(A)], было идентифицировано несколько вирулентно-ассоциированных генов (VAG) из атипичного энтеропатогенного патотипа E. coli (aEPEC). Кроме того, был обнаружен груз плазмидных репликонов из крупных плазмидных групп и 18 профаго-ассоциированных областей. В заключение, характеристика WGS изолята aEPEC, извлеченного с рыбной фермы в Синалоа, Мексика, позволяет понять его патогенный потенциал и возможный риск для здоровья человека, связанный с потреблением сырых аквакультурных продуктов. Необходимо использовать методы секвенирования следующего поколения (NGS) для изучения микроорганизмов окружающей среды и принять единую систему здравоохранения, чтобы узнать, как возникают проблемы со здоровьем.

Introduction

Аквакультура является одним из самых быстрорастущих секторов производства продуктов питания во всем мире, и ее производственная практика предназначена для удовлетворения растущего спроса на продовольствие для потребления человеком. Мировое производство аквакультуры утроилось с 34 миллионов тонн в 1997 году до 112 тонн в 2017^году1. Основными группами видов, на которые приходилось почти 75% производства, были морские водоросли, карпы, двустворчатые моллюски, сом и тилапия (Oreochromis spp.) ¹. Однако появление заболеваний, вызванных микробными образованиями, неизбежно из-за интенсивного рыбоводства, что приводит к....

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм E. coli ACM5 был извлечен путем обработки и культивирования образца рыбы для определения фекальной кишечной палочки (FC)¹². Во время отбора проб рыбы у рыбы не было клинических признаков заболевания, бактериальной или грибковой инфекции, и преобладала средняя температура 22,3 ° C. После выделения изолят E. coli подвергали биохимическому тестированию и криоконсервировали в отваре для инфузии сердца мозга (BHI) с ДМСО (8% v/v) в качестве криопротекторного средства.

1. Реактивация замороженной культуры E. coli ACM5

1. Из замороженного бактериального бу....

Results

Антимикробную восприимчивость определяли методом дисковой диффузии и интерпретировали по критериям точки разрыва CLSI для 12 антибиотиков, охватывающих шесть различных классов противомикробных препаратов, то есть аминогликозиды, β-лактамы, фторхинолоны, нитрофураны, фениколы и антагонисты фолатных путей. E. coli ACM5 проявлял чувствительность ко всем антибиотикам, за исключением одного β-лактамного препарата. Были протестированы четыре β-лактамных препарата: ампициллин, карбенициллин, цефалотин и цефотаксим. Сре.......

Discussion

В этом исследовании представлена адаптация рабочего процесса бактериальной WGS с использованием настольного секвенсора и конвейера для геномной характеристики патогенного варианта E. coli . В зависимости от используемой платформы секвенирования время выполнения (TATs) для влажных лабораторных процедур (культивирование бактерий, экстракция гДНК, подготовка библиотеки и секвенирование) и анализа последовательностей может варьироваться, особенно если изучаются медленно растущие бактерии. Следуя протоколу для WGS, о.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accublock Mini цифровая сухая ванна	Labnet	D0100	Сухая ванна для инкубации пробирок
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	Магнитные шарики в растворе для очистки библиотек ДНК
DeNovix DS-11	DeNovix Inc.		УФ-ВИД спектрофотометр для проверки качества гДНК экстрагирован
ДНК LoBind Tubes	Eppendorf	0030108418	1,5 мл ПЦР пробирки для пула библиотек
ДНК DynaMag-2 Magnet	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	12321D	Магнитный микротрубчатый штатив используется при магнитных бусинах на основе очистки ДНК
Gram-negative Multibac I.D.	Диагностические исследования (Мексика)	PT-35	Стандартные коммерческие диски с антибиотиками для тестирования чувствительности к противомикробным препаратам
MiniSeq Mid Output Kit (300 циклов)	Illumina	FC-420-1004	Реагент cartdrige для секвенирования с парным концом (2x150)
Система MiniSeq System Instrument	Illumina	SY-420-1001	Настольный секвенсор, используемый для секвенирования нового поколения
Центрифуга	MiniSpinEppendorf	5452000816	Стандартная центрифуга для пробирок
Nextera XT Набор для подготовки библиотеки ДНК	Illumina	FC-131-1024	Реагенты для выполнения библиотек ДНК для секвенирования. Включает в себя Box 1 и Box 2 реагенты для 24 образцов
Nextera XT Index Kit v2	Illumina	FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004	Index set A, B, C, D
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001	Управление библиотекой ДНК для секвенирования
Прецизионная водяная баня	LabCare America	51221081	Шейкер для водяной бани, используемый для бактериальной культуры
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q33231	Реагенты для количественного анализа ДНК на основе флуоресценции
Флуориметр Qubit 2.0	Invitrogen, Флуориметр Thermo Fisher Scientific	Q32866	используется для флуоресцентного анализа
Пробирки для анализа кубитов	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q32856	0,5 мл ПЦР-пробирки для количественного анализа ДНК на основе флуоресценции
Термоамплификатор SimpliAmp	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific	A24811	Термоамплификатор используется для амплификации библиотеки ДНК
Spectronic GENESYS 10 Vis	Thermo	335900	Спектрофотометр используется для бактериальной суспензии в тестировании чувствительности к противомикробным
ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit	Zymo Research Inc.	D4300	Набор для экстракции геномной ДНК (50 приготовлений)