Микродиссекция глаза грызуна

Вскрытие глаза является важным методом в офтальмологических исследованиях и позволило исследователям получить доступ к сегментам глаза для целевых исследований. Ранее офтальмологи полагались на глазную ткань больных людей для своих исследований. Однако постепенно растущее число штаммов офтальмологических моделей грызунов¹ с годами уменьшило потребность в глазной ткани человека. Эти штаммы мышей позволили глубже понять глазные заболевания и вмешательства. Тем не менее, они также породили потребность в инновационных методах микродиссекции глаза. Малый размер и ограниченная область операции серьезно ограничивают эффективный доступ к подразделению глаза. Кроме того, из-за однородной клеточной сборки задних и передних глазных чашек трудно проводить целенаправленные вмешательства после рассечения. Современные методы микродиссекции лазера² и хирургической микродиссекции ^3,4 недостаточны для удовлетворения таких требований глазных исследований. Лазерная микродиссекция очень эффективна при анализе отдельных клеток, но конкретная ткань должна быть микрорассечена перед лазерной процедурой². Этот метод может изолировать небольшие области, представляющие интерес, из предварительно рассеченной ткани для молекулярного анализа. Таким образом, этот метод не подходит для подготовки цельных креплений или для изоляции окулярных слоев в осевой части для оптимальной визуализации.

Хирургический метод является наиболее широко используемым методом; Этот метод включает в себя иммобилизацию глаза через зрительный нерв⁵ с последующим вскрытием. Эта практика трудна и может повредить любую хрупкую ткань, так как сферический глаз продолжает двигаться во время рассечения. Несмотря на то, что он полезен для изоляции различных участков слоев сетчатки, этот метод не может разграничить пространственную ориентацию ткани при рассечении.

Во время диссекции сохранение присутствия прикрепленной мигательной мембраны или третьего века (рис. 1) представляет собой уникальные и значительные преимущества. В этом методе сначала глазное яблоко энуклеируется третьим веком. Затем третье веко используется для иммобилизации глаза⁶ (рис. 2А). Затем следует прокалывание глазного яблока через лимб роговицы и использование разреза в качестве точки входа (рис. 2B, C). Затем наглазники разделяют, разрезая по окружности спереди и сзади (рис. 2D-G). Рассекая заднюю чашку глаза, можно идентифицировать полупрозрачный слой нервной сетчатки и аккуратно отслаивать. Затем в полученных полусферических передних и задних чашечках делаются три или четыре равноудаленных разреза, которые позволяют этим чашечкам в форме цветка падать плашмя на предметное стекло (рис. 2H).

Третье веко способствует простому и эффективному обращению во время рассечения, тем самым обеспечивая минимальное повреждение тканей при доступе к различным глазным слоям и при производстве цельных креплений. Кроме того, наличие третьего века помогает обнаружить и изучить локализованные вмешательства во время визуализации.

Процедура в нашей лаборатории была выполнена на штамме мыши CBA / J или rd1 на P28 любого пола. Процедура может быть выполнена на любом штамме, возрасте или поле животного и не имеет смещения в соответствии с этими характеристиками.

Животные были закуплены из коммерческих источников (см. Таблицу материалов) и содержались в Центре мелких животных (SAF) в Национальном институте иммунологии (NII). Они содержались в индивидуальных вентилируемых клетках (IVC) и получали свободный доступ к подкисленной автоклавной воде и пище. Они поддерживались при температуре 21-23 °C и с циклом светлый/темный 14 ч / 10 ч.

Ниже приведен модифицированный хирургический метод микрорассечения мышиного глаза.

Эта процедура была одобрена Институциональным комитетом по этике животных Национального института иммунологии в Нью-Дели. Серийный номер официального утверждения - IAEC#480/18. Эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами Комитета по контролю и надзору за экспериментами на животных Министерства рыболовства, животноводства и молочного животноводства правительства Индии под наблюдением профессионального ветеринара SAF, NII.

1. Подготовка

1. Расширьте глаза грызунов, используя каплю 0,8% тропикамида и 5% офтальмологического раствора фенилэфрина в каждый глаз. Перед процедурой поместите животное в темное место на 30 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обезболивающее средство не требуется, так как животное усыпляется сразу после завершения 30 минут. Темная адаптация и расширение глаз животного позволяют наблюдателю проверить наличие глазных разрывов и повреждений перед процедурой. Кроме того, расширение полезно при работе с пигментированной тканью глазного яблока.
2. Усыпить животное путем внутрибрюшинного введения 5-кратной дозы анестезии. Типичная доза составляет 200 мкл PBS, содержащего 10 мг кетамина и 1 мг ксилазина.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Доза для эвтаназии животного составляет кетамин в дозе 400-500 мг / кг массы тела и ксилазин в дозе 50 мг / кг массы тела, вводимый внутрибрюшинно. Для типичной мыши весом 20 г доза будет составлять 200 мкл PBS, содержащего 10 мг кетамина (100 мкл исходного раствора 100 мг / мл кетамина) и 1 мг ксилазина (100 мкл исходного раствора 10 мг / мл ксилазина).
3. Подтвердите полное отсутствие реакции на раздражитель, исследуя педальный рефлекс. Отсутствие сердцебиения и дыхания также являются важными показателями.
4. Поместите мышь в боковое лежачее положение, чтобы обеспечить полный доступ к глазу.
5. Подготовьте к процедуре щипцы для наложения швов, изогнутые щипцы, микролезвие (размером 15°, 3 мм), пружинные микроножницы и угловые пружинные микроножницы.

2. Энуклеация глаза мыши вместе с третьим веком

1. Поместите мышь в боковое лежачее положение, чтобы обеспечить полный доступ к глазу. Откройте наружные веки щипцами, чтобы оптимально визуализировать третье веко.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Третье веко, также известное как мигательная мембрана, расположено по направлению к верхнему углу касательной носа (рис. 1А).
2. Определите третье веко как незначительный полупрозрачный выступ с пигментированной границей (рис. 1B).
3. Поместите изогнутые щипцы вокруг глазного яблока и зажмите, чтобы освободить глаз от посторонних прикреплений. Это сведет к минимуму кровотечение в глаз из окружающих тканей.
4. Замените изогнутые щипцы пружинными микроножницами и разрежьте вокруг глазного яблока с прикрепленным к нему третьим веком. Используйте небольшие непрерывные разрезы, чтобы освободить глазное яблоко от окружающих тканевых прикреплений.
5. Поместите изогнутые пружинные микроножницы под глазное яблоко, чтобы освободить глаз, перерезав зрительный нерв. Следите за тем, чтобы глазное яблоко полностью освободилось от глазницы.

3. Очистка от посторонних тканей

1. Поместите энуклеированный глаз от усыпленной мыши в чашку Петри с буфером с фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) при pH 7,4, при этом чашка Петри заполнена таким образом, чтобы глазное яблоко было погружено в PBS.
2. Обездвижить энуклеированное глазное яблоко мыши с прикрепленным третьим веком одной рукой с помощью щипцов.
3. Подвешивайте глазное яблоко в жидкой среде, чтобы обеспечить более эффективное обращение. Некоторые экстраокулярные мышцы или ткани начнут отплывать от глазного яблока. Удалите их, отрезав от глазного яблока с помощью пружинных микроножниц.
4. Разрежьте и удалите зрительный нерв от основания глазного яблока с помощью микроножниц, чтобы обеспечить лучшее отделение сетчатки для цельных препаратов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости удалять зрительный нерв для рассечения тканей.
5. Промойте глазное яблоко PBS и перенесите его в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 1 мл 4% параформальдегида (PFA), в течение как минимум 2 ч при 4 ° C для фиксации тканей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе процедуру можно приостановить, оставив ткань в PFA на срок до 12 часов при 4 °C. Однако для выделения живых клеток не следует выполнять этапы фиксации, а всю процедуру нужно выполнять без пауз.

4. Рассечение энуклеированного глаза для получения переднего и заднего наглазников

1. После фиксации PFA (если сбор живых клеток продолжается без фиксации глазного яблока), перенесите глазное яблоко в чашку Петри, содержащую PBS, и поместите его под препарирующий микроскоп для выполнения последующей процедуры.
2. Обездвижьте глазное яблоко, крепко удерживая третье веко щипцами для наложения швов Colibri.
3. Сделайте небольшой разрез на лимбе, проткнув его с помощью микролезвия. Лимб - это роговично-склеральное соединение. Делать надрез желательно напротив третьего века, тем самым делая точку доступа для пружинных микроножниц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование микролезвия размером 15° и 3 мм может обеспечить лучший контроль над глубиной этого разреза.
4. Затем, используя этот разрез в качестве отправной точки, с помощью микроножниц сделайте небольшие и непрерывные надрезы по окружности роговицы-склерального лимба. Сначала сделайте полукруг разрезов, начиная от точки разреза до третьего века. Затем завершите оставшийся полукруг надрезов с другой стороны. Наконец, сделайте разрез вокруг третьего века, чтобы отделить заднюю чашечку и переднюю чашку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от интересующего наглазника, мигательная мембрана может быть оставлена прикрепленной либо к переднему, либо к заднему наглазнику.
5. Извлеките хрусталик из задней чашки с помощью щипцов, чтобы получить заднюю чашечку, состоящую из слоев нервной сетчатки и пигментного эпителия сетчатки (RPE). Таким образом, хрусталик, задняя чашка и передняя чашка глаза разделены.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с нефиксированными тканями передняя и задняя чашечки теперь могут быть ферментативно переварены для получения одноклеточной суспензии роговицы или сетчатки.
6. Для фиксации тканей перенесите эти чашки в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 1 мл 4% PFA, в течение 12 часов при 4 ° C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После фиксации ткань может быть помещена в соответствующую среду, а криосекция или парафиновая секция могут быть выполнены для получения срезов роговицы или сетчатки.

5. Выделение нейронных слоев сетчатки и РПЭ

1. Повторно введите заднюю чашку в чашку Петри, содержащую буфер PBS, чтобы погрузить ткань.
2. Проверьте наличие невральной сетчатки. Это можно визуализировать в виде непрозрачного слоя на пигментированном слое РПЭ, который прикреплен по периферической окружности чашки.
3. Удерживайте третье веко щипцами, чтобы обездвижить заднюю чашечку, и отклеивайте нервную сетчатку, начиная с периферии, с помощью второй пары щипцов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется очень нежные и легкие движения руки, чтобы не повредить ткани. На выходе зрительного нерва изогнутые пружинные ножницы могут быть вставлены под нервную сетчатку, и можно сделать разрез, чтобы полностью освободить слои, если нервная сетчатка остается прикрепленной, как показано на рисунке 3. По желанию освободите или отсоедините сетчатку мягкими движениями с помощью мягкой щетки. Однако это было бы нецелесообразно делать, если собирают сетчатку для гистологии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Таким образом, получают нервную сетчатку и пигментированный слой RPE с третьим веком.

6. Сегментация слоев сетчатки и СИЗО для цельных креплений

1. Повторно введите переднюю и заднюю чашки в чашку Петри, содержащую буфер PBS, и поместите чашку под препарирующий микроскоп.
2. Иммобилизуйте переднюю чашку, удерживая третье веко.
3. Используйте угловые пружинные микроножницы, чтобы сделать разрез около 3/4 диаметра наглазника рядом с третьим веком, разрезая периферию перпендикулярно оптическому центру.
4. Удерживайте третье веко и сделайте надрез рядом с первым срезом.
5. Сделайте аналогичный разрез между вторым срезом и третьим веком.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Три или четыре таких равноудаленных разреза открывают полусферические чашечки в форме цветка, который падает плашмя и может быть легко установлен.
6. Иммобилизуйте заднюю чашку, удерживая третье веко.
7. Выполните те же действия, что и для разрезов (шаги 6.3-6.5) на передней чашке, чтобы сделать три или четыре равноудаленных разреза на задней чашке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для гистологии нервной сетчатки, выделенной на шаге 5, сделайте аналогичные разрезы, чтобы убедиться, что она падает плашмя на поверхность. Не делайте очень глубоких надрезов в центре чашки, так как это может привести к тому, что срезы листьев развалятся или легко отделятся.
8. Выполните окрашивание и смонтируйте ткани целиком для эффективной визуализации ^7,8.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие мигательной мембраны действует как постоянный физический индикатор носовой стороны наглазника в целых креплениях. Это помогает разграничить дорсальную/вентральную сторону наглазника, так как третье веко наглазника указывает на носовую/вентральную ориентацию.

Для изучения потенциального лимфатического ангиогенеза в ткани переднего / роговицы мышей rd1 был подготовлен целый массив ткани мыши/роговицы мышей в болезненном состоянии. Прикрепленная конъюнктивальная ткань от третьего века действовала как положительный контроль, так как в роговице отсутствуют лимфатические сосуды. Для исследования ткань роговицы рассекали вместе с конъюнктивой и фиксировали 4% ПФА с последующей пермеабилизацией и блокировкой. Затем ткань окрашивали первичным антителом против лимфатического эндотелиального маркера (LYVE1)9. Затем последовала инкубация с вторичным антителом, меченным Alexa Fluor 488 (зеленый). Репрезентативные изображения (рис. 4) были получены с помощью флуоресцентного микроскопа в 4x и 10x.

Для визуализации сосудистой сети сетчатки для морфологических, структурных и функциональных исследований сетчатки был получен целый массив нервнойсетчатки из заднего наглазника 7. Нервная сетчатка была тщательно очищена от слоя сосудистой оболочки и сделана надрезная часть, чтобы уложить ее плоско в цветочную структуру. Для визуализации сосудистой структуры сетчатки листок подвергали окрашиванию изолектином IB4-Alexa Fluor 488 в течение 1 ч при комнатной температуре и визуализировали при 2-кратном и 20-кратном увеличении (рис. 5).

Рисунок 1: Третье веко или мигательная перепонка мыши. (А) Третье веко расположено по направлению к верхнему углу касательной носа и (Б) часто имеет пигментированную границу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Этапы изоляции переднего и заднего наглазников от энуклеированного глазного яблока. (А) Третье веко используется для иммобилизации глаза, и (Б) разрез делается через лимб роговицы. (C) Запись делается после формирования разреза и разреза по окружности, как показано в (D-F). (G) Таким образом, передний и задний наглазники разделены. Полупрозрачный слой нервной сетчатки присутствует на задней чашке глаза, которая отслаивается. (H) Затем в чашечках делаются три равноудаленных разреза, чтобы они упали плашмя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Принципиальная схема, показывающая, как изогнутые пружинные ножницы могут быть вставлены под нервную сетчатку, чтобы освободить слои. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Цельное крепление передней чашечки. Ткань роговицы была микрорассечена, как описано, чтобы выявить лимфатические сосуды. Ткань окрашивали лимфатическим эндотелиальным маркером (LYVE1) и вторичным антителом, меченным Alexa Fluor 488 (зеленый). (A) Изображения с 4-кратным увеличением и (B) с 10-кратным увеличением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Вся гора нервной сетчатки. Изолектин IB4 окрашивает сосудистую сеть сетчатки, которую можно легко увидеть зеленым цветом. (A) Плоское крепление сетчатки, полученное из заднего наглазника, окрашивали изолектином IB4, помеченным Alexa Fluor 488 (2x). (B) 20-кратное увеличение сосудистой сети сетчатки, показывающее промежуточное сосудистое сплетение в сетчатке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Авторам раскрывать нечего.