Методическая статья

Визуализация стареющей улитки с помощью флуоресцентной микроскопии со световым листом

DOI:

10.3791/64420

⸱

28 сентября 2022 г.

 , 
1Department of Otolaryngology, University of Minnesota

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Был разработан световой микроскоп для визуализации и оцифровки всей улитки.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Глухота является наиболее распространенным сенсорным нарушением, затрагивающим примерно 5% или 430 миллионов человек во всем мире по данным Всемирной организации здравоохранения1. Старение или пресбиакузис является основной причиной нейросенсорной тугоухости и характеризуется повреждением волосковых клеток, спиральных ганглиозных нейронов (SGN) и vascularis. Эти структуры находятся в улитке, которая имеет сложную спиралевидную анатомию мембранных тканей, взвешенных в жидкости и окруженных костью. Эти свойства делают технически сложным исследование и количественную оценку гистопатологических изменений. Чтобы удовлетворить эту потребность, мы разработали световой микроскоп (TSLIM), который может визуализировать и оцифровывать всю улитку, чтобы облегчить изучение структурно-функциональных взаимосвязей во внутреннем ухе. Правильно выровненные последовательные срезы всей улитки приводят к стеку изображений для трехмерного (3D) объемного рендеринга и сегментации отдельных структур для 3D-визуализации и количественного анализа (т. е. длины, ширины, поверхности, объема и количества). Улитки требуют минимальных этапов обработки (фиксация, декальцинация, обезвоживание, окрашивание и оптическая очистка), все из которых совместимы с последующей визуализацией с высоким разрешением с помощью сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии. Поскольку все ткани присутствуют в штабелях, каждая структура может быть оценена индивидуально или относительно других структур. Кроме того, поскольку для визуализации используются флуоресцентные зонды, иммуногистохимия и связывание лигандов могут быть использованы для идентификации конкретных структур и их 3D-объема или распределения в улитке. Здесь мы использовали TSLIM для изучения улиток старых мышей, чтобы количественно оценить потерю волосковых клеток и спиральных ганглиозных нейронов. Кроме того, расширенный анализ (например, кластерный анализ) был использован для визуализации локальных сокращений спиральных ганглиозных нейронов в канале Розенталя вдоль его 3D-объема. Эти подходы демонстрируют способность микроскопии TSLIM количественно оценивать структурно-функциональные взаимосвязи внутри улитки и между ними.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Улитка является периферическим органом чувств для слуха у млекопитающих. Он имеет сложную спиральную анатомию повторяющихся сенсорных и поддерживающих клеток, которые анатомически специализированы для обнаружения звуковых колебаний и передачи их в мозг для восприятия слуха. Основными сенсорными элементами являются внутренние и внешние волосковые клетки и их иннервирующие нервные волокна, клеточные тела которых составляют спиральный ганглий, который находится в канале Розенталя (рис. 1). Эти сенсорные и нейронные структуры тонотопически расположены таким образом, что высокочастотные звуки преобразуются в кохлеарной базе, а низкочастотные звуки преобразуются в вершинеулитки 2. Анатомическая карта распределения этих сенсорных клеток по длине спирали опорной базилярной мембраны называется цитокохлеограммой3 и может быть сопоставлена с потерей слуха в зависимости от частоты, как показано на аудиограмме.

Перепончатый лабиринт улитки, окруженный плотной костью, делает технически сложным исследование более одной улитковой структуры одновременно. Таким образом, обоснование разработки светового микроскопа заключается в том, чтобы получить хорошо выровненные серийные срезы всей улитки, чтобы все кохлеарные структуры можно было исследовать относительно друг друга в 3D-реконструкциях. Voie et al.4 и Voie and Spelman5 разработали первый световой микроскоп, называемый ортогональным флуоресцентным оптическим микроскопом (OPFOS), для оптического сечения всей улитки. Однако этот микроскоп никогда не был коммерчески разработан; Итак, наша цель состояла в том, чтобы построить микроскоп с легким листом, называемый тонколистовым лазерным микроскопом для визуализации (TSLIM; Рисунок 2). Ранее были опубликованы детали проектирования и конструкции TSLIM8. TSLIM внесла несколько улучшений по сравнению с OPFOS, включая использование цифровой камеры при слабом освещении по сравнению с ПЗС-камерой для сбора изображений, оптически закодированные микропозиционеры для точного и воспроизводимого движения образца через световой лист, использование коммерчески доступной, оптически прозрачной камеры для образцов и окрашивание родамина в этанол, а не в очищающий раствор для предотвращения осаждения пятен в ткани. Коммерческие разработки световых микроскопов, таких как SPIM6 , были сосредоточены на визуализации с высоким разрешением живых, небольших прозрачных образцов, но не подходят для цельной кохлеарной визуализации, поскольку им не хватает достаточного рабочего расстояния. Обзор развития других световых микроскопов был опубликован Santi7. Основное преимущество TSLIM перед другими гистологическими методами исследования улитки заключается в оптическом разрезе тканей для 3D-реконструкции с сохранением целостности образца, чтобы его можно было использовать другими гистологическими методами. Еще одно преимущество визуализации TSLIM заключается в том, что только тонкий световой лист, созданный лазером, подвергается воздействию на ткань по сравнению с воздействием лазера на всю толщину ткани, как в конфокальной микроскопии. Очистка тканей для минимизации рассеяния света и тот факт, что только небольшая часть ткани подвергается воздействию лазера, приводит к минимальному выцветанию флуорохрома (фотообесцвечиванию) при лазерной визуализации светового листа. Однако процесс фиксации, обезвоживания и очищения изменяет морфологию кохлеарных структур и приводит к усадке тканей по сравнению с живой тканью. Фактическая величина происходящей усадки тканей не определялась.

TSLIM был разработан Шейном Джонсоном и восемью немецкими студентами-оптиками (см. Благодарности). Детали конструкции TSLIM были предоставлены Santi et al.8 , а сканирующая версия (sTSLIM) - Schröter et al.9. TSLIM функционирует как неразрушающий микротома для оптического среза образцов и как микроскоп для сбора 2D-серийных срезов по всей ширине и толщине улитки. TSLIM может отображать как маленькие (мм), так и большие (см), толстые образцы. Линзы устанавливаются на воздухе, что позволяет работать на больших рабочих расстояниях с объективами сбора 1x и 2x на диссекционном микроскопе. Диссекционный микроскоп также имеет зум-оптику, которая позволяет TSLIM разрешать субклеточные и синаптические структуры на клетках. TSLIM оснащен как синим (473 нм), так и зеленым (532 нм) лазером для подсветки, что позволяет использовать различные флуоресцентные зонды для визуализации. Целью TSLIM является создание хорошо выровненных 2D-оптических срезов через целую улитку для полной цифровой реконструкции тканей улитки. Поскольку это флуоресцентный метод, лиганды и иммуногистохимия также могут быть использованы для идентификации специфических кохлеарных структур.

Первоначально цилиндрическая линза использовалась для создания двух противоположных гауссовских световых листов, но она произвела артефакты поглощения. Благодаря работе Келлера и др.10 неподвижная цилиндрическая линза была заменена сканирующим гальванометрическим зеркалом для получения светового листа9. Кроме того, поскольку центр светового листа является самым тонким в талии луча, 2D-изображения sTSLIM создаются путем сбора композитных столбцов данных по оси X по ширине образца (рис. 3). Этот метод был впервые описан Buytaert и Dircks11. Специальное программное обеспечение TSLIM для управления и сбора изображений было разработано с использованием графической программы для управления прибором. Световой лист проходит через образец и освещает флуоресцентную плоскость внутри ткани. Эта флуоресцентная плоскость проецируется ортогонально через прозрачный образец и собирается с помощью диссекционного микроскопа. Оптически кодированные микропозиционеры позволяют сканировать через талию луча по оси X для сбора одного составного 2D-изображения, а затем микропозиционер по оси Z перемещает образец в более глубокую плоскость внутри ткани для получения стопки последовательных срезированных 2D-изображений (видео 1, рис. 4). Стопка поступательных изображений собирается по всей ширине, толщине и длине улитки, и сшивание изображений не требуется (Видео 2). Стек изображений переносится на другой компьютер и загружается в программу 3D-рендеринга для 3D-реконструкции и количественной оценки. Стопки изображений содержат всю цифровую информацию о морфологии улитки с разрешением микроскопа. Однако, если требуется более высокое разрешение, интактная улитка может быть дополнительно обработана деструктивными гистологическими методами, такими как микротомное сечение, сканирование и просвечивающая электронная микроскопия.

Программа 3D-рендеринга используется для сегментации различных кохлеарных структур для 3D-рендеринга и количественного анализа. Для сегментации каждая структура в каждом 2D-изображении стека прослеживается с помощью разного цвета с помощью графического планшета и пера (рис. 5). На сегодняшний день сегментировано 20 различных кохлеарных структур (рис. 6). После сегментации можно выполнить различные 3D-анализы. Например, программное обеспечение для 3D-рендеринга может виртуально резецировать улитку в любой плоскости вдоль центроида структуры. На видео 3 показано сечение по касательной к кортиевому органу, которое выявляет волосковые клетки по длине базилярной мембраны. Этот процесс сначала требует ручной сегментации интересующей структуры. Затем центроид структуры рассчитывается на основе наименьшего квадратного соответствия сплайн-точек, расположенных вдоль центра структуры от ее основания до вершины, что позволяет приблизить длину структуры (видео 4). Аналогичный процесс, называемый скелетонизацией, может быть использован для визуализации радиальной ширины конструкции по всей ее длине с помощью цветовой карты (Видео 4). Общий объем каждой структуры рассчитывается программой после сегментации, но относительные расстояния также могут быть количественно определены и визуализированы с помощью цветовых карт в программном обеспечении для 3D-рендеринга (рис. 7). Сегментированные структуры также могут быть экспортированы для получения увеличенных изображений твердопластичных моделей (рис. 8). Кроме того, полуавтоматический подсчет ячеек также может быть выполнен с помощью программного обеспечения для 3D-рендеринга (рис. 9). Иммуногистохимия и связывание лигандов могут быть использованы для окрашивания специфических кохлеарных структур, и эти структуры могут быть выделены из других кохлеарных структур для морфометрической оценки, такой как получение цитокохлеограммы (рис. 10). Длина, ширина, поверхность, объем и количество всех кохлеарных структур могут быть определены с помощью 3D-моделей, что делает этот подход идеальным для картирования повреждения улитки с функциональными нарушениями. В частности, повреждение улитки из-за старения, травмы, вызванной шумом, или других повреждений может быть показано и количественно оценено в 3D-кохлеарных реконструкциях из 2D-оптических срезов. После того, как улитка была оцифрована, существует множество алгоритмов визуализации, которые можно использовать для оценки повреждения улитки любой тканью в алитке в анатомическом регистре по отношению к другим тканям улитки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры и использование живых животных были рассмотрены и одобрены (идентификатор протокола #2010-38573A) Комитетом по институциональному уходу и использованию Университета Миннесоты (IACUC), а исследователи, использующие этих животных, были тщательно обучены и протестированы ветеринарами Research Animal Resources (RAR), прежде чем они получат доступ к животноводческим объектам. В этом исследовании использовались как самцы, так и самки мышей.

1. Удаление улитки для фиксации и обработки тканей для визуализации

  1. Усыпьте мышь с помощью ингаляции CO2 . Обезглавьте мышь ножницами и сделайте дорсально-вентральный разрез через мозг, чтобы гемисекция черепа. Удалите мозг, определите круглую буллу в базо-вентральной части черепа, вскройте буллу ронгерами, визуализируйте и удалите улитку.
  2. Фиксация: Выполняйте эту процедуру под вытяжным шкафом и с помощью диссекционного микроскопа с 5-кратным увеличением. Надевайте перчатки и защитную одежду. Проколите овальное окошко и удалите стремечки острой киркой. Вставьте кирку в круглое окно, чтобы проколоть мембрану.
  3. Закройте открытое круглое окно отрезанным кончиком инфузионного набора, прикрепленным к шприцу объемом 1 мл, наполненному 2 мл формалина. Медленно вводите формалин через перилимфатические пространства улитки в течение 2 минут, отмечая, что формалин выходит из улитки через открытое овальное окно. Обрежьте лишнюю ткань с улитки и погрузите в бутылку, содержащую 10% формалина, и поместите на ротатор на ночь.
  4. Декальцинация: Промыть улитку в PBS 3x по 5 мин каждый и погрузить во флакон, содержащий 10% раствор динатрийэтилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) с вращением в течение 4 дней, меняя раствор ежедневно.
  5. Обезвоживание: перфузируйте улитку с помощью PBS 3x и погружайте на 15 минут между заменами. Обезвоживание улитки с возрастающими концентрациями этанола 10%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100%; по 30 мин в каждой концентрации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно удалить всю ЭДТА перед обезвоживанием, так как ЭДТА осаждается в этаноле. Кроме того, улитки можно оставить в любой концентрации этанола более 70% на ночь.
  6. Окрашивание: окрашивание всей улитки путем погружения в раствор изотиоцината родамина B (5 мкг/мл в 100% этаноле) на ночь с вращением. Удалите излишки красителя из улитки двумя сменами 100% этанола по 5 минут каждая замена.
  7. Очистка: Переведите окрашенную улитку в две смены раствора Spalteholz12 (5:3 метилсалицилат: бензилбензоат), по 30 мин в каждую смену и оставьте на ночь в очищающем растворе с вращением. Улитки можно оставлять в растворе Шпальтехольца на неопределенный срок.

2. Визуализация улиток

  1. Прикрепите улитки к стержню образца на овальном и круглом конце оконной мембраны, чтобы очищающий раствор оставался внутри улитки и не образовывались пузырьки (рис. 2). Необходимо соблюдать осторожность, чтобы пузырьки не образовывались внутри улитки, так как их трудно удалить, и если их оставить в ткани, они вызовут артефакты визуализации.
  2. Используйте УФ-активирующий клей, чтобы прикрепить влажную улитку к стержню сухого образца (рис. 2). Прикрепите улитку на овальном и круглом концах окна. Отверждайте УФ-клей в течение 10 с, перемещая по улитке ультрафиолетовым светом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Неплотное прикрепление улитки к стержню образца приведет к дефектам изображения. Этот стержень специально изготовлен для этого протокола (подробнее см. Santi et al.8 ) и является специфическим для нашего светового микроскопа.
  3. Суспендировать улитку в камеру визуализации, заполненную раствором Шпальтехольца для визуализации. Камера для образцов представляет собой оптически прозрачную кварцевую кварцевую флуорометрическую ячейку (видео 1).
  4. Прикрепите стержень образца к вращающемуся держателю, который также прикреплен к ступени перемещения XZ. Большинство стеков получают путем перевода образца в плоскости XZ, но можно получить и вращательные стопки.
  5. Оптическое сечение TSLIM: используйте синий или зеленый лазер для возбуждения в зависимости от типа окрашивания флуорохромом. Расположите световой лист в середине ткани для фокусировки и определите увеличение, которое будет использоваться для освещения всей ширины улитки. Затем используйте специально разработанную программу для перемещения образца через световой лист по образцу по оси X (сшивание изображения) и с шагом Z, чтобы создать стопку 2D-изображений по всей улитке.
  6. Для первого изображения лучевая талия светового листа расположена на краю образца, и программа сканирует образец на всю ширину, собирая столбцы данных (см. сшивание изображения; Santi et al.8), которые представляют собой ширину конфокального параметра (рис. 3) для получения составного 2D-изображения с максимальным разрешением по ширине образца. Программа автоматизирует сшивание изображений для каждого Z-шага до тех пор, пока образец не будет полностью визуализирован.
  7. Обработка изображений: перенесите стек изображений на другой компьютер и загрузите его в программу 3D-рендеринга для 3D-реконструкции и количественной оценки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поскольку темой этого специального выпуска является визуализация эффектов старения в улитке, в качестве примеров будут использоваться молодые (3-месячные, HS2479, мышь штамма CBA) и пожилые (23-месячные, мышь штамма HS2521, C57) улитки. Следует отметить, что TSLIM способен визуализировать различные образцы, включая улитки людей, млекопитающих, других грызунов и рыб, а также другие органы, такие как мозг.

Johnson et al. 13 опубликовали статью о SGN у молодых (3-недельных...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оптическое срезирование с помощью световой листовой микроскопии для исследования кохлеарных структур не является механически разрушительным, как другие более традиционные гистологические методы, и обеспечивает полное цифровое представление кохлеарных структур относительно друг друга. Предыдущие методы, такие как поверхностные препараты органа Corti14 , предоставили карту потери волосковых клеток по длине базилярной мембраны, но потеря SGN не могла быть оценена, поскольку ткань была рассечена, чтоб...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам раскрывать нечего.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано грантами Национального института глухоты и других коммуникативных расстройств Национального института здравоохранения, Фонда Келлога и частными пожертвованиями Бриджит Сперл и Джона Маккормика. TSLIM был разработан при превосходной помощи Маттиаса Хилленбранда, Керстин Джон, Мейке Лоуин, Мишеля Лейхера, Тобиаса Шретера, Питера Шахта, Оливера Даннберга и Джулиана Вустера из Технического университета Ильменау, Германия, под наблюдением их наставников (Стефана Зинзингера и Рене Теска) и Джеймса Леже.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Программное обеспечение для 3D-рендеринга AmiraThermoFisher Научныйадрес: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433
бензилбензоат (W213810)Sigma-Aldrich, Inc. Адрес: PO Box, 14508, Сент-Луис, MO 68178
Bondic Бондик Адрес: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Канада
Этанол 95% и 100% Адрес Университета Миннесоты: General Storehouse, Миннеаполис, Миннесота
Этилендиаминтетрауксусная кислота дигидрат соли натрия (ЭДТА)  (Е5134)Сигма-Олдрич, Инк. Адрес: PO Box, 14508, Сент-Луис, Миссури 68178
Графическая программа LabVIEW и VisionNational InstrumentsАдрес: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504
метилсалицилат (M6742)Sigma-Aldrich, Inc. Адрес: PO Box, 14508, Сент-Луис, Миссури 68178
Olympus MVX10 диссекционный микроскопOlympus CorpАдрес: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034
Родамина B изотиоцинат, (283924) Сигма-Олдрич, Инк. Адрес: PO Box, 14508, Сент-Луис, Миссури 68178
Starna Flurometer Cell (3-G-20)Адрес Starna Cells: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423
55455

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deafness and hearing loss. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss (2021).
  2. Vater, M., Kössl, M. Comparative aspects of cochlear functional organization in mammals. Hearing Research. 273 (1-2), 89-99 (2011).
  3. Santi, P. A., Blair, A., Bohne, B. A., Lukkes, J., Nietfeld, J. The digital cytocochleogram. Hearing Research. 192 (1-2), 75-82 (2004).
  4. Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. Journal of Microscopy. 170, 229-236 (1993).
  5. Voie, A. H., Spelman, S. A. Three-dimensional reconstruction of the cochlea from two-dimensional images of optical sections. Computerized Medical Imaging and Graphics. 19 (5), 377-384 (1995).
  6. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  7. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
  8. Santi, P. A., et al. Thin-sheet laser imaging microscopy for optical sectioning of thick tissues. BioTechniques. 46 (4), 287-294 (2009).
  9. Schröter, T. J., Johnson, S. B., John, K., Santi, P. A. Scanning thin-sheet laser imaging microscopy (sTSLIM) with structured illumination and HiLo background rejection. Biomedical Optics Express. 3 (1), 170-177 (2012).
  10. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
  11. Buytaert, J. A. N., Dirckx, J. J. J. Design and quantitative resolution measurements of an optical virtual sectioning three-dimensional imaging technique for biomedical specimens, featuring two-micrometer slicing resolution. Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 014039(2007).
  12. Spalteholz, W. On making human and animal preparations transparent. , S. Hierzel. Leipzig, Germany. (1914).
  13. Johnson, S., Schmitz, H., Santi, P. TSLIM imaging and a morphometric analysis of the mouse spiral ganglion. Hearing Research. 278 (1-2), 34-42 (2011).
  14. Santi, P. A. Organ of Corti surface preparations for computer-assisted morphometry. Hearing Research. 24 (3), 179-187 (1986).
  15. Brown, D., Pastras, C., Curthoys, I., Southwell, C., Van Roon, L. Endolymph movement visualized with light sheet fluorescence microscopy in an acute hydrops model. Hearing Research. 339, 112-124 (2016).
  16. White, J. A., Burgess, B. J., Hall, R. D., Nadol, J. B. Pattern of degeneration of the spiral ganglion cell and its processes in the C57BL/6J mouse. Hearing Research. 141 (1-2), 12-18 (2000).
  17. Grierson, K. E., Hickman, T. T., Liberman, M. C. Dopaminergic and cholinergic innervation in the mouse cochlea after noise-induced or age-related synaptopathy. Hearing Research. 422, 108533(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3D

Похожие статьи