Был разработан световой микроскоп для визуализации и оцифровки всей улитки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Визуализация стареющей улитки с помощью флуоресцентной микроскопии со световым листом
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Глухота является наиболее распространенным сенсорным нарушением, затрагивающим примерно 5% или 430 миллионов человек во всем мире по данным Всемирной организации здравоохранения1. Старение или пресбиакузис является основной причиной нейросенсорной тугоухости и характеризуется повреждением волосковых клеток, спиральных ганглиозных нейронов (SGN) и vascularis. Эти структуры находятся в улитке, которая имеет сложную спиралевидную анатомию мембранных тканей, взвешенных в жидкости и окруженных костью. Эти свойства делают технически сложным исследование и количественную оценку гистопатологических изменений. Чтобы удовлетворить эту потребность, мы разработали световой микроскоп (TSLIM), который может визуализировать и оцифровывать всю улитку, чтобы облегчить изучение структурно-функциональных взаимосвязей во внутреннем ухе. Правильно выровненные последовательные срезы всей улитки приводят к стеку изображений для трехмерного (3D) объемного рендеринга и сегментации отдельных структур для 3D-визуализации и количественного анализа (т. е. длины, ширины, поверхности, объема и количества). Улитки требуют минимальных этапов обработки (фиксация, декальцинация, обезвоживание, окрашивание и оптическая очистка), все из которых совместимы с последующей визуализацией с высоким разрешением с помощью сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии. Поскольку все ткани присутствуют в штабелях, каждая структура может быть оценена индивидуально или относительно других структур. Кроме того, поскольку для визуализации используются флуоресцентные зонды, иммуногистохимия и связывание лигандов могут быть использованы для идентификации конкретных структур и их 3D-объема или распределения в улитке. Здесь мы использовали TSLIM для изучения улиток старых мышей, чтобы количественно оценить потерю волосковых клеток и спиральных ганглиозных нейронов. Кроме того, расширенный анализ (например, кластерный анализ) был использован для визуализации локальных сокращений спиральных ганглиозных нейронов в канале Розенталя вдоль его 3D-объема. Эти подходы демонстрируют способность микроскопии TSLIM количественно оценивать структурно-функциональные взаимосвязи внутри улитки и между ними.
Введение
Улитка является периферическим органом чувств для слуха у млекопитающих. Он имеет сложную спиральную анатомию повторяющихся сенсорных и поддерживающих клеток, которые анатомически специализированы для обнаружения звуковых колебаний и передачи их в мозг для восприятия слуха. Основными сенсорными элементами являются внутренние и внешние волосковые клетки и их иннервирующие нервные волокна, клеточные тела которых составляют спиральный ганглий, который находится в канале Розенталя (рис. 1). Эти сенсорные и нейронные структуры тонотопически расположены таким образом, что высокочастотные звуки преобразуются в кохлеарной базе, а низкочастотные з....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры и использование живых животных были рассмотрены и одобрены (идентификатор протокола #2010-38573A) Комитетом по институциональному уходу и использованию Университета Миннесоты (IACUC), а исследователи, использующие этих животных, были тщательно обучены и протестированы ветеринарами Research Animal Resources (RAR), прежде чем они получат доступ к животноводческим объектам. В этом исследовании использовались как самцы, так и самки мышей.
1. Удаление улитки для фиксации и обработки тканей для визуализации
- Усыпьте мышь с помощью ингаляции CO2 . Обезглавьте мышь ножницами и сделайте дорсально-ве....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Поскольку темой этого специального выпуска является визуализация эффектов старения в улитке, в качестве примеров будут использоваться молодые (3-месячные, HS2479, мышь штамма CBA) и пожилые (23-месячные, мышь штамма HS2521, C57) улитки. Следует отметить, что TSLIM способен визуализировать различные образцы, включая улитки людей, млекопитающих, других грызунов и рыб, а также другие органы, такие как мозг.
Johnson et al. 13 опубликовали статью о SGN у молодых (3-недельных.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Оптическое срезирование с помощью световой листовой микроскопии для исследования кохлеарных структур не является механически разрушительным, как другие более традиционные гистологические методы, и обеспечивает полное цифровое представление кохлеарных структур относительно друг друга. Предыдущие методы, такие как поверхностные препараты органа Corti14 , предоставили карту потери волосковых клеток по длине базилярной мембраны, но потеря SGN не могла быть оценена, поскольку ткань была рассечена, чтоб.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам раскрывать нечего.
Благодарности
Это исследование было поддержано грантами Национального института глухоты и других коммуникативных расстройств Национального института здравоохранения, Фонда Келлога и частными пожертвованиями Бриджит Сперл и Джона Маккормика. TSLIM был разработан при превосходной помощи Маттиаса Хилленбранда, Керстин Джон, Мейке Лоуин, Мишеля Лейхера, Тобиаса Шретера, Питера Шахта, Оливера Даннберга и Джулиана Вустера из Технического университета Ильменау, Германия, под наблюдением их наставников (Стефана Зинзингера и Рене Теска) и Джеймса Леже.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Программное обеспечение для 3D-рендеринга Amira | ThermoFisher Научный | адрес: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433 | |
| бензилбензоат (W213810) | Sigma-Aldrich, Inc. | Адрес: PO Box, 14508, Сент-Луис, MO 68178 | |
| Bondic | Бондик | Адрес: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Канада | |
| Этанол 95% и 100% | Адрес Университета Миннесоты | : General Storehouse, Миннеаполис, Миннесота | |
| Этилендиаминтетрауксусная кислота дигидрат соли натрия (ЭДТА) (Е5134) | Сигма-Олдрич, Инк. | Адрес: PO Box, 14508, Сент-Луис, Миссури 68178 | |
| Графическая программа LabVIEW и Vision | National Instruments | Адрес: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504 | |
| метилсалицилат (M6742) | Sigma-Aldrich, Inc. | Адрес: PO Box, 14508, Сент-Луис, Миссури 68178 | |
| Olympus MVX10 диссекционный микроскоп | Olympus Corp | Адрес: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034 | |
| Родамина B изотиоцинат, (283924) | Сигма-Олдрич, Инк. | Адрес: PO Box, 14508, Сент-Луис, Миссури 68178 | |
| Starna Flurometer Cell (3-G-20) | Адрес Starna Cells | : PO Box 1919, Atascadero, CA 82423 |
Ссылки
- Deafness and hearing loss. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss (2021).
- Vater, M., Kössl, M. Comparative aspects of cochlear functional organization in mammals. Hearing Research. 273 (1-2), 89-99 (2011).
- Santi, P. A., Blair, A., Bohne, B. A., Lukkes, J., Nietfeld, J.....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
