Продвижение исследования преантрального фолликулогенеза требует эффективных методов выделения фолликулов из одиночных яичников. Здесь представлен упрощенный механический протокол выделения фолликулов из яичников крупного рогатого скота с использованием измельчителя тканей и гомогенизатора. Этот метод позволяет собрать большое количество жизнеспособных преантральных фолликулов из одного яичника.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение малых преантральных фолликулов из бычьего яичника с использованием комбинации фрагментации, гомогенизации и последовательной фильтрации
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Понимание полного процесса фолликулогенеза млекопитающих имеет решающее значение для улучшения вспомогательных репродуктивных технологий у домашнего скота, людей и исчезающих видов. Исследования были в основном ограничены антральными и крупными преантральными фолликулами из-за трудностей с выделением более мелких преантральных фолликулов, особенно у крупных млекопитающих, таких как виды крупного рогатого скота. Эта работа представляет собой эффективный подход к извлечению большого количества небольших преантральных фолликулов из одного бычьего яичника. Кору отдельных бычьих яичников разрезали на 500 мкм кубиков с помощью измельчителя тканей и гомогенизировали в течение 6 мин при 9000-11000 об/мин с помощью 10-мм зонда. Крупный мусор отделяли от гомогената с помощью сырной ткани с последующей последовательной фильтрацией через клеточные сетчатые фильтры 300 мкм и 40 мкм. Содержимое, оставшееся в 40-мкм ситечке, промывали в поисковую посуду, где фолликулы были идентифицированы и собраны в каплю среды. Жизнеспособность собранных фолликулов была проверена с помощью окрашивания в синий цвет трипана. Этот метод позволяет выделить большое количество жизнеспособных мелких преантральных фолликулов из одного бычьего яичника примерно за 90 мин. Важно отметить, что этот метод является полностью механическим и позволяет избежать использования ферментов для диссоциации ткани, что может повредить фолликулы. Фолликулы, полученные с использованием этого протокола, могут быть использованы для последующих применений, таких как выделение РНК для RT-qPCR, иммунолокализация специфических белков и культура in vitro .
Введение
Фолликулы яичников являются функциональными единицами яичника, ответственными за выработку гаметы (ооцита), а также гормонов, критически важных для репродуктивной функции и общего состояния здоровья. Примордиальные фолликулы образуются в яичнике во время внутриутробного развития или в неонатальном периоде в зависимости от вида1, и они составляют женский овариальный резерв. Рост фолликулов начинается с активации первичных фолликулов, которые покидают бассейн покоя и входят в фазу роста. Преантральный фолликулогенез, охватывающий все стадии фолликула до развития антрального нерва, представляет собой высокодинамичный процесс, требующий синхронных ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Яичники крупного рогатого скота (Bos taurus) были получены с местной скотобойни и транспортированы в лабораторию в течение 6 часов после сбора. Из-за большого количества животных, обрабатываемых в учреждении, возраст, порода и стадия цикла течки животных неизвестны. Поскольку в этих экспериментах не использовались живые животные, утвержденный протокол ухода за животными и их использования не требовался.
1. Подготовка оборудования и реагентов
- Накройте секцию лабораторного стенда шириной 2 фута настольной бумагой.
- Получить рукоятку скальпеля, стерильное лезвие скальпеля, гемостат, пару рассеченных....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Обзор и критические шаги
Используя этот протокол, небольшие преантральные фолликулы крупного рогатого скота могут быть надежно выделены из отдельных яичников в экспериментально релевантных количествах. Из общего числа 30 реплик было получено в среднем 41 фолликул на репликат с диапазоном от 11 до 135 фолликулов (рисунок 4A). В 14 репликах фолликулы были охарактеризованы для стадии развития, какописано ранее 26 , путем измерения диаметра фолликула с.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В настоящем протоколе подробно описывается воспроизводимый метод извлечения преантральных фолликулов на ранней стадии, особенно на первичных и ранних вторичных стадиях, из бычьего яичника. Этот протокол основан на предыдущих отчетах 20,25,30,34,35,36 и обеспечивает оптимизацию, которая приводит к выделению значительного количества фолликулов из отдельного яичника.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Этот проект был частично профинансирован многогосударственным проектом USDA W4112 и наградой UC Davis Jastro Shields для SM.
Авторы хотели бы выразить свою признательность Central Valley Meat, Inc. за предоставление бычьих яичников, используемых во всех экспериментах. Авторы также благодарят Оливию Сильвера за помощь в обработке яичников и выделении фолликулов.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 5-3/4" Сода-известковая одноразовая стеклянная пипетка Пастера | Duran Wheaton Kimble | 63A54 | Пастеровская пипетка, которую можно использовать для выбивания фолликулов из мусора во время поиска внутри чашки Петри |
| 16% Параформальдегид | Электронная микроскопия Sciences | 15710 | Разбавленный до 4%; фиксация фолликулов для иммуноокрашивания |
| 20 мл Шприц с люэровским замком | Fisher Scientific | Z116882-100EA | Шприц, используемый с иглой 18 G для выбивания фолликулов из 40 мкм; m cell sit# |
| 21 Стерильное лезвие скальпеля | Fisher Scientific | 50-365-023 | Используется для разрезания яичников и удаления медулы |
| 40 μ m Клеточный фильтр | Fisher Scientific | 22-363-547 | Используется для фильтрации фильтрата от 300 μ m клеточное ситечко |
| 104 мм Пластиковая воронка | Fisher Scientific | 10-348C | Размер может варьироваться, но убедитесь, что сырная ткань разрезана правильно и что гомогенат яичников не прольется более |
| чем на 300 мкм; m Сетчатый фильтр | pluriSelect | 43-50300-03 | Используется для фильтрации фильтрата от марлевой ткани |
| 500 мл Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | FB500500 | Воронка и колба, используемые для улавливания фильтрата из марли |
| Air-Tite Sterile Needles 18 G | Thermo Fisher Scientific | 14-817-151 | 18 G обеспечивает достаточное давление для выбивания фолликулов из 40 мкм; m клеточное ситечко |
| Air-Tite Стерильные иглы 27 G 13 мм | Fisher Scientific | 14-817-171 | Иглы, которые можно использовать для манипуляций с любым мусором, в котором застряли фолликулы |
| BD Hoechst 33342 Раствор | Fisher Scientific | BDB561908 | флуоресцентное окрашивание ДНК |
| Бычья сыворотка Альбумин (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030-100G | Компонент среды для промывки фолликулов |
| Марлевая ткань | Электронная микроскопия Sciences | 71748-00 | Первая стадия фильтрации гомогената яичников, предназначенная для удаления крупных остатков тканей |
| Классические лезвия безопасной бритвы с двойным лезвием | Wilkinson Sword | N/A | Лезвия бритвы, которые лучше всего подходят для измельчителя тканей McIlwain и не тупятся быстро |
| Вторичное антитело Donkey-Anti-Rabbit, Alexa Fluor 488 | Fisher Scientific | A-21206 | Вторичное антитело для иммуноокрашивания |
| Eisco Latex Pipette Bulbs | Fisher Scientific | S29388 | Резиновая груша для использования с пипетками |
| Пастера HEPES | Buffer Sigma-Aldrich | H3375 | Компонент среды для промывки фолликулов |
| Гомогенизатор | VWR | 10032-336 | Гомогенизация ткани яичника для высвобождения фолликулов; |
| ImageJ/Fiji | NIH | v2.3.1 | Программное обеспечение, используемое для анализа флуоресцентно-иммунолокализации |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10184 | Используется для разреза ткани яичника, достаточно маленькой для гомогенизации |
| Микроскоп - Стереоскоп | Olympus | SZX2-ILLT | Диссекционный микроскоп используется для поиска и забора фолликулов из фильтрата |
| Микроскоп - Inverted | Nikon | Diaphot 300 | Инвертированный микроскоп для визуализации выделенных фолликулов с большим увеличением в светлом поле |
| Микроскоп - Инвертированный | микроскоп ECHO | Revolve R4 | Инвертированный микроскоп для визуализации выделенных фолликулов с большим увеличением и эпифлуоресценции |
| Минеральное масло | Sigma-Aldrich | M8410-1L | Масло для покрытия капель промывочной среды фолликулов для предотвращения испарения во время поиска |
| Заменимые аминокислоты (NEAA) | Gibco | 11140-050 | Компонент средства для промывки фолликулов |
| Нормальная сыворотка ослика | Jackson ImmunoResearch | 017-000-001 | Реагент для иммуноокрашивания блокирующего буфера |
| Nunc 4-луночный Чашки для ЭКО | Thermo Fisher Scientific | 144444 | 4-луночные чашки для выделения фолликулов и промывания |
| Раствор пенициллин-стрептомицина 100x | Gibco | 15-140-122 | Компонент средства для промывки фолликулов |
| Чашка Петри 60 мм OD x 13,7 мм | Ted Pella | 10184-04 | Чашка Петри, которая лучше всего подходит для измельчителя тканей McIlwain |
| Фосфатный буферный раствор (PBS) | Fisher Scientific | BP665-1 | Буфер для промывки яичников и фолликулов |
| Пластиковая разделочная доска | Fisher Scientific | 09-002-24A | Разделочная доска достаточного размера для безопасного разрезания |
| Поливинилпирролидон (ПВП) | яичников Fisher Scientific | BP431-100 | Добавление ПВП (0,1% по объему) к PBS предотвращает прилипание фолликулов к пластине или друг к другу |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Монтажная среда для флуоресцентно меченых клеток или тканей |
| Qiagen RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Набор для очистки колонки РНК |
| R | The R Foundation | v4.1.2 | Программное обеспечение для статистического анализа |
| Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Поликлональное антитело | Abcam | ab181701 | Cx37 первичное антитело для иммуноокрашивания |
| RevertAid RT Набор для обратной транскрипции | Thermo Fisher Scientific | K1691 | набор для синтеза кДНК |
| Rstudio | RStudio, PBC | v2021.09.2 | Программное обеспечение для статистического анализа |
| Раствор гидроксида натрия (1N/Certified) | Fisher Scientific | SS266-1 | Используется для повышения pH среды до 7,6-7,8 |
| Пируват натрия (NaPyr) | Gibco | 11360-070 | Компонент среды для промывки фолликулов |
| Квадратная чашка Петри 100 мм x 15 мм | Thermo Fisher Scientific | 60872-310 | Решетчатые чашки Петри позволяют более эффективно идентифицировать фолликулы |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725271 | Mastermix для ПЦР-реакции |
| Steritop Резьбовой фильтр Bottle Top Filter | Sigma-Aldrich | S2GPT02RE | Используется для стерилизации средства для промывки фолликулов |
| SYBR-safe DNA гель | Thermo Fisher | Scientific S33102 | Окрашивание визуальных продуктов ПЦР на агарозный гель |
| TCM199 с Hank' s Соли | Gibco | 12-350-039 | Компонент среды для промывки фолликулов |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Моющее средство для иммуноокрашивания пермеабилизирующего буфера |
| Реагент | Тризол Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Реактив для выделения РНК |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | Gibco | 15-250-061 | Используется для проверки жизнеспособности выделенных фолликулов |
| Tween 20 | Моющее средство для иммуноокрашивания Буфер для стирки | ||
| Подогреватель Универсал | WTA | 20931 | Теплая пластина для удержания фолликулов на уровне 38,5 °С; C во время поиска под микроскопом |
| Wiretrol II Калиброванный микропипетки | Drummond | 50002-005 | Стеклянные микропипетки для манипуляций с фолликулами |
Ссылки
- Fortune, J. E., Yang, M. Y., Allen, J. J., Herrick, S. L. Triennial reproduction symposium: The ovarian follicular reserve in cattle: What regulates its formation and size. Journal of Animal Science. 91 (7), 3041-3050 (2013).
- Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
