Эффективный клиринговый протокол для изучения развития семян в томатах (Solanum lycopersicum L.)

Summary

Семена томатов являются важной моделью для изучения генетики и биологии развития во время размножения растений. Этот протокол полезен для очистки семян томатов на разных стадиях развития, чтобы наблюдать более тонкую эмбриональную структуру.

Abstract

Помидор (Solanum lycopersicum L.) является одной из основных товарных культур во всем мире. Семена томатов являются важной моделью для изучения генетики и биологии развития во время размножения растений. Визуализация более тонкой эмбриональной структуры внутри семени томата часто затруднена слизистой оболочкой семян, многоклеточным слоистым покровом и толстостенным эндоспермом, который необходимо устранить трудоемким встраиванием-сечением. Более простой альтернативой является использование методов очистки тканей, которые делают семена почти прозрачными с помощью химических агентов. Хотя обычные процедуры очистки позволяют глубоко проникнуть в более мелкие семена с более тонкой семенной оболочкой, очистка семян томатов по-прежнему является технически сложной задачей, особенно на поздних стадиях развития.

Здесь представлен быстрый и трудосберегающий протокол очистки для наблюдения за развитием семян томатов от 3 до 23 дней после цветения, когда эмбриональная морфология почти завершена. Этот метод сочетает в себе раствор очистки на основе хлоралгидрата, широко используемый в Арабидопсисе , с другими модификациями, включая пропуск фиксации формалин-ацето-спирта (FAA), добавление обработки семян гипохлоритом натрия, удаление размягченной слизи семенной оболочки, а также промывку и вакуумную обработку. Этот метод может быть применен для эффективной очистки семян томатов на разных стадиях развития и полезен при полном мониторинге процесса развития мутантных семян с хорошим пространственным разрешением. Этот протокол очистки может также применяться для глубокой визуализации других коммерчески важных видов в Solanaceae.

Introduction

Томат (S. lycopersicum L.) является одной из важнейших овощных культур во всем мире, с объемом производства 186,8 млн. тонн мясистых фруктов с 5,1 млн. га в 2020 году¹. Он принадлежит к большому семейству пасленовых, насчитывающему около 2 716 видов², включая многие коммерчески важные культуры, такие как баклажаны, перец, картофель и табак. Культивируемый помидор является диплоидным видом (2n = 2x = 24) с размером генома около 900 Mb³. В течение долгого времени были приложены большие усилия для одомашнивания и селекции томатов путем отбора желаемых признаков из дикого Solanum spp....

Protocol

1. Приготовление растворов

1. Приготовьте фиксатор FAA, добавив 2,5 мл 37% формальдегида, 2,5 мл ледниковой уксусной кислоты и 45 мл 70% этанола в 50 мл центрифужной трубки. Вихрь и храните его при 4 °C. Только что приготовьте фиксатор FAA непосредственно перед использованием.
   ВНИМАНИЕ: 37% формальдегида является коррозионным и потенциально канцерогенным при воздействии или вдыхании. Фиксатор необходимо выполнять в вытяжном капюшоне при ношении соответствующих средств индивидуальной защиты.
2. Приготовьте очищающий раствор, добавив 5 мл 100% глицерина, 40 г хлоралгидрата и 10 мл дистиллированной воды в стеклянную бутылку емкостью 100....

Results

Когда семена томатов очищали с использованием обычного метода, как в Arabidopsis, плотные клетки эндосперма блокировали визуализацию ранних эмбрионов томатов при 3 DAF и 6 DAF (рисунок 3A, B). По мере увеличения общего объема эмбриона шаровидный эмбрион был едва различим при 9 DAF (рисунок 3C). Однако, поскольку размер семян продолжал увеличиваться, их проницаемость уменьшалась, что приводило к нечеткому сердечному эмбриону при 12 DAF (.......

Discussion

По сравнению с механическим сечением, технология очистки более выгодна для трехмерной визуализации, поскольку она сохраняет целостность растительных тканей или органов¹⁶. Обычные протоколы очистки часто ограничиваются небольшими образцами из-за более легкого проникновения химических растворов. Семена томатов являются проблематичным образцом для очистки тканей, потому что они примерно в 70 раз больше, чем семена арабидопсиса по размеру, и имеют больше барьеров проницаемости. Оболочка семян.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,000 & микро; L дозатор	GILSON	FA10006M
1 000 & микро; L наконечники для пипеток	Corning	T-1000-B
2 мл центрифужная пробирка	Axygen	MCT-200-C
37% формальдегид	DAMAO	685-2013
5,000 &; L дозатор	Eppendorf	3120000275
5 000 & микро; L наконечники для пипеток	biosharp	BS-5000-TL
50 мл центрифужная трубка	Corning	430829
Абсолютный этанол	BOYUAN	678-2002
Стеклянная бутылка	Fisher	FB800-100
Хлорал Гидрат	Meryer	M13315-100G
Покровное стекло	Leica	384200
DIC микроскоп	Zeiss	Axio Imager A1	10-кратное, 20-кратное и 40-кратное увеличение
Дезинфицирующее средство	QIKELONGAN	17-9185
Игла для пресечения	Bioroyee	17-9140
Цветок питательной почвы	FANGJIE
Щипцы	HAIOU	4-94
Ледяная уксусная кислота	BOYUAN	676-2007
Глицерин	Solarbio	G8190
Магнитная мешалка	IKA	RET basic
Micro-Tom	Tomato Genetics Ресурсный центр	LA3911
Орбитальный шейкер	QILINBEIER	QB-206
Субстрат для посева	PINDSTRUP	LV713/018-LV252	Отсеивание:0-10 мм
Одинарное вогнутое горло	HUABODEYI
Слайд	Leica	3800381
Стереомикроскоп	Leica	S8 APO	Увеличение от 1x до 4x
Фольга	ZAOWUFANG	613
Tween 20	Sigma	P1379
Вакуумный насос	SHEATING	SHB-III
Вихревой метр	Silogex	MX-S