Бешенство – это острый, прогрессирующий, вирусный энцефалит. Пулевидный этиологический агент относится к роду Lyssavirus, по крайней мере 17 из которых вызывают бешенство по всему миру (кроме Антарктиды). Вирус бешенства является наиболее важным членом этих разнообразных РНК-вирусов. Все млекопитающие восприимчивы, при этом летучие мыши и мезоплотоядные животные являются значительными резервуарами. Передача происходит в первую очередь после укуса. Являясь квинтэссенцией нейротропных агентов, вирионы развиваются центростремительно после осаждения через аксоны от периферии к центральной нервной системе (ЦНС) для репликации, а затем к слюнных железам и выводятся в слюну. Во всем мире собаки являются причиной наибольшего числа смертей людей от бешенства, вызывая десятки тысяч смертей ежегодно. Учитывая зоонозные аспекты, лабораторные методы имеют важное значение для прикладных исследований и оповещения, профилактики и контроля заболеваний у людей, домашних животных и диких животных. Целью этого сборника из девяти взаимосвязанных статей является представление методов, обеспечивающих самоанализ возникновения бешенства, обнаружение, патобиологию, эпидемиологию, управление и совершенствование биологических препаратов.
Как оценивается бешенство? Бешенство должно быть заболеванием, подлежащим регистрации, с надлежащим сбором, анализом и эпидемиологической интерпретацией данных. Сегодня большинство случаев регистрируется в результате пассивного эпиднадзора, основанного на животных, которые контактируют с людьми. В то время как может показаться достаточно простым представить себе безопасный отлов, удержание, успокоение и эвтаназию клинического подозреваемого (т.е. укусившей собаки для постановки диагноза бешенства), это не так просто для некоторых диких животных. Например, Тайвань считался «свободным» от бешенства, первоначально основываясь на обширном наблюдении за домашними животными. Однако, признавая важность других водоемов для животных, исследователи на острове обратили свое внимание на дикую природу. Как описывают Hsu et al., целенаправленный сбор умирающих и мертвых летучих мышей дает возможность для обнаружения уникальных видов лиссавируса на Тайване. Такие усилия расширили таксономическую широту этого вирусного рода и обеспечили разумную схему для других оценок в Азии.
Какие ткани нужны для диагностики лиссавируса? В дополнение к выработке соответствующих методов эпиднадзора и правильной идентификации видов, безопасный и надлежащий отбор тканей имеет первостепенное значение для чувствительной и специфической диагностики бешенства. С 19века центральная нервная система (ЦНС) считалась первичной тканью. Животных усыпляли, их туши отправляли в лабораторию, вскрывали черепа, удаляли мозги, а их части исследовали под микроскопом на наличие вирусных включений. Тем не менее, перевозка целых животных нецелесообразна, особенно с крупными млекопитающими, такими как домашний скот. Более того, не все области мозга одинаково полезны для диагностики. Jarvis et al. описывают безопасные и практичные методы вскрытия как для мелких, так и для крупных млекопитающих, которые минимизируют риск воздействия и сокращают время обработки2. Применение таких рекомендаций по биобезопасности и концентрация внимания на стволе мозга и мозжечке позволят улучшить практику современного лабораторного эпиднадзора за бешенством животных.
Какие варианты используются для обнаружения вирусных антигенов? Для рутинной диагностики лиссавируса с середины 20века используется прямой тест на флуоресцентные антитела (ДФА) для наблюдения за вирусными включениями в тканях ЦНС. Несмотря на высокую чувствительность и специфичность, тест DFA требует флуоресцентного микроскопа и использует ацетон в качестве фиксатора ткани. Patrick et al. сообщают об использовании прямого быстрого иммуногистохимического теста (DRIT), который основан на сборе ствола мозга, фиксации формалином отпечатков тканей, использовании моноклональных или поликлональных антител, конъюгированных с биотином, и обнаружении вирусных включений с помощью световой микроскопии, менее чем за 1 час3. Дрит обладает такой же чувствительностью и специфичностью, как и тест DFA, и подходит для децентрализованного, усиленного лабораторного наблюдения в полевых условиях. В условиях ограниченных ресурсов анализ линейного потока (LFA) является еще одним методом быстрой диагностики, требующим минимальных технических знаний, как сообщают Mauti et al.. Положительные тест-полоски с места могут быть отправлены в центральную лабораторию для подтверждения4.
Существуют ли другие методы, помимо обнаружения антигена, подходящие для диагностики лиссавируса? Тесты DFA, drit и LFA полезны для обнаружения вирусных антигенов в посмертных тканях ЦНС. Однако ткани мозга могут разлагаться. Кроме того, при подозрении на людей более желательны предсмертные тесты, которые могут включать альтернативные клинические образцы, такие как ликвор. Таким образом, молекулярные анализы очень полезны для обнаружения небольших количеств вирусных нуклеиновых кислот. Marston et al. и Wang et al. описывают метод полимеразной цепной реакции в реальном времени и вложенный, соответственно, который является быстрым, чувствительным и специфичным 5,6. Такое тщательное внимание к деталям для минимизации загрязнения образца и правильная конструкция праймера позволяют проводить первичную диагностику по всему спектру дивергентных лиссавирусов.
Является ли обычная микроскопия адекватной после постановки диагноза для современных представлений о патобиологии лиссавируса? Использование только двумерных микроскопических методов может привести к отсутствию критических элементов in vivo в контексте и сложности. Тем не менее, используя объективы с большим свободным расстоянием, инфицированные вирусом ткани могут быть визуализированы с помощью обычной конфокальной лазерной сканирующей микроскопии с высоким разрешением, как подробно описано Zaeck et al., чтобы визуализировать распределение патогена и лучше оценить мелкие детали вирусного патогенеза, распространения, тропизма и нейроинвазии7.
Существуют ли альтернативы для измерения эффективности вакцины против бешенства? Современные методы измерения эффективности вакцины против бешенства требуют большого количества лабораторных грызунов. Тем не менее, затраты, доверительные интервалы и проблемы благосостояния требуют альтернативы. Гликопротеин вируса бешенства вызывает вируснейтрализующие антитела после вакцинации. Как сообщили Джалле и Тордо, тест ИФА in vitro может быть использован вместо животных для измерения относительного содержания вакцин против вируса бешенства с использованием высокоспецифичных моноклональных антител8.
Можно ли сделать вывод о пероральном потреблении вакцинных приманок дикими животными с помощью биомаркеров? Помимо парентеральной вакцинации людей и домашних животных, пероральная вакцинация диких мезоплотоядных животных применяется с 1970-х годов. Помимо измерения иммуногенности вакцины или результирующей эффективности среди популяций лис, енотов, скунсов и т. д. путем выявления случаев заболевания, биомаркеры могут быть использованы для вывода о контакте и потреблении вакцинированных приманок. Исторически сложилось так, что обнаружение инкорпорированного тетрациклина в приманках производилось в костях или зубах животных. Альтернативой сбору таких твердых тканей является серологическое измерение другого биомаркера, такого как йофеноксиновая кислота. Berentsen et al. сообщают об анализе таких дериватов в сыворотках мангустов, важном природном резервуаре в Азии, который был интродуцирован в Карибский регион9. После употребления мангустами в неволе приманки, содержащей этот биомаркер, они экстрагировали иофеноксиновые кислоты в ацетонитрил и анализировали сыворотки животных методом жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии. Адекватная маркировка была обнаружена в течение нескольких недель после употребления приманки, и такие производные могут быть пригодны для полевой оценки поглощения вакцинированной приманки у животных, находящихся на свободном выгуле.
Отчасти в связи с продолжающейся пандемией COVID-19 ожидаются усовершенствованные вирусологические методы в области усиленного эпиднадзора за лиссавирусом, обнаружения патогенов, подтверждающей диагностики и характеристики вариантов. Чтение о различных техниках в рецензируемой литературе, как правило, является первым шагом для заинтересованного человека. Тем не менее, непосредственное наблюдение за последовательностью шагов и выслушивание контекста от опытного оператора устраняет нюансы и неверное толкование. Существующие и будущие лабораторные и полевые протоколы, связанные с бешенством, в соответствии с рекомендациями МЭБ и ВОЗ, могли бы выиграть от дополнительных коллекций визуальных методов для оказания помощи новым исследователям, особенно в развивающихся странах.