Method Article

Масштабируемый клеточный метод функциональной оценки вариантов Ube3a

DOI:

10.3791/64454

⸱

October 10th, 2022

 , 
1Department of Neuroscience, Washington University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Был разработан простой и масштабируемый метод оценки функциональной значимости вариантов миссенса в Ube3a, гене, потеря и усиление функции которого связаны как с синдромом Ангельмана, так и с расстройством аутистического спектра.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Более широкое использование секвенирования в медицине выявило миллионы вариантов кодирования в геноме человека. Многие из этих вариантов встречаются в генах, связанных с нарушениями нервного развития, но функциональное значение подавляющего большинства вариантов остается неизвестным. Настоящий протокол описывает изучение вариантов Ube3a, гена, который кодирует убиквитин-лигазу E3, связанную как с аутизмом, так и с синдромом Ангельмана. Дублирование или трипликация Ube3a тесно связана с аутизмом, тогда как его удаление вызывает синдром Ангельмана. Таким образом, понимание валентности изменений активности белка UBE3A важно для клинических исходов. Здесь описан быстрый клеточный метод, который связывает варианты Ube3a с репортером пути Wnt. Этот простой анализ является масштабируемым и может быть использован для определения валентности и величины изменений активности в любом варианте Ube3a . Кроме того, возможность этого метода позволяет генерировать богатство структурно-функциональной информации, которая может быть использована для получения глубокого понимания ферментативных механизмов UBE3A.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Последние технологические достижения сделали секвенирование экзомов и геномов рутинным в клинических условиях 1,2. Это привело к открытию большого количества генетических вариантов, в том числе миллионов ошибочных вариантов, которые обычно изменяют одну аминокислоту в белке. Понимание функциональной значимости этих вариантов остается проблемой, и только небольшая часть (~ 2%) известных вариантов промахов имеет клиническую интерпретацию 1,3.

Ярким примером этой проблемы является Ube3a, ген, который кодирует убиквитин-лигазу E3, которая нацелена на белки субстрата для деградации4. Ube3a находится в хромосоме 15q11-13 и экспрессируется исключительно из унаследованного матерью аллеля 5,6,7. Наблюдения генетики заболевания убедительно свидетельствуют о том, что недостаточная или чрезмерная активность фермента UBE3A вызывает отчетливые нарушения развития нервной системы. Делеция материнской хромосомы 15q11-13 вызывает синдром Ангельмана (AS)8, расстройство, характеризующееся тяжелой умственной отсталостью, двигательными нарушениями, судорогами, счастливым поведением с частой улыбкой и дисморфическими чертами лица 8,9,10. Напротив, дупликация или трипликация материнской хромосомы 15q11-13 вызывает синдром Dup15q, гетерогенное состояние, признанное одной из наиболее распространенных синдромных форм аутизма 11,12,13. Кроме того, существуют сотни вариантов промахов, идентифицированных в Ube3a, большинство из которых считаются вариантами неопределенной значимости (VUS), поскольку их функциональное и клиническое значение неизвестно. Таким образом, существует значительный интерес к разработке методов, которые могут эмпирически оценить варианты Ube3a, чтобы определить, способствуют ли они заболеванию нервного развития.

Фермент UBE3A принадлежит к семейству доменов HECT (гомологичному E6-AP C-terminus) убиквитиновых лигажей E3, которые все обладают одноименным доменом HECT, который содержит биохимический механизм, необходимый для принятия активированного убиквитина из ферментов E2 и переноса его в субстратные белки14. Исторически сложилось так, что характеристика ферментов E3 основывалась на восстановленных системах in vitro, которые требуют ансамбля очищенных белков 4,15,16. Такие методы медленны и трудоемки и не поддаются оценке активности большого количества вариантов. В предыдущей работе было идентифицировано, что UBE3A активирует путь Wnt в клетках HEK293T путем модуляции функции протеасомы для замедления деградации β-катенина17. Это понимание позволяет использовать репортеры путей Wnt в качестве эффективного и быстрого метода для идентификации вариантов Ube3a18 как потери, так и усиления функции. В приведенном ниже протоколе подробно описан метод генерации вариантов Ube3a, а также репортер на основе люциферазы для оценки изменений активности вариантов Ube3a.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Клонирование мутагенеза для генерации вариантов Ube3a

  1. Клонируйте все варианты Ube3a в плазмиду pCIG2 (рисунок 1A), бицистронный вектор, который содержит промотор цыпленка-β-актина и внутренний сайт входа рибосомы (IRES) для экспрессии EGFP19. Полноразмерные конструкции Ube3a содержат N-концевую последовательность Myc-тегов и клонируются в pCIG2 с использованием 5' SacI сайта и 3' XmaI сайта. Кроме того, естественные участки EcoRI, EcoRV и PstI в кодирующей последовательности Ube3a также используются для фрагментов субклонов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Деидентифицированные варианты для Ube3a могут быть получены через литературу и в общедоступных репозиториях, таких как база данных ClinVar1. Дополнительные незарегистрированные варианты можно получить через личное общение с медицинскими центрами.
  2. Используйте адаптированный двухступенчатый метод20 мегапраймерного мутагенеза для введения мутаций в кадр считывания Ube3a . На первом этапе спроектируйте мутагенный олигонуклеотид, который содержит желаемую мутацию (пример, показанный в этом протоколе, заключается в генерации варианта UBE3A Q588E), окруженного по меньшей мере 30 парами оснований (bp) гомологии 5' и 3′ к мутации (рисунок 1B и таблица 1).
  3. Используйте мутагенный олигонуклеотид вместе с комплементарным олигонуклеотидом для первого раунда ПЦР для генерации мегапраймера 200-400 bp, содержащего мутацию (рисунок 1C; Таблица 2 и Таблица 3). Используйте все 50 мкл реакционного объема ПЦР для электрофореза агарозного геля с использованием 1% геля и последующей очистки геля (Таблица материалов). Элюируют продукт ПЦР в 30 мкл деионизированногоH2O(diH2O) для использования на стадии ПЦР второго раунда ниже.
  4. Настройте ПЦР второго раунда, как указано (рисунок 1С; Таблица 2 и Таблица 3). На этом этапе будут генерироваться более крупные фрагменты ДНК (обычно ~ 1-1,5 кб в длину), содержащие участки мутации и терминального ограничения, подходящие для субклонирования (рисунок 1C).
  5. После завершения реакции ПЦР очистите полученный продукт с помощью набора для очистки ПЦР (Таблица материалов). Элюируют в 30 мкл и переваривают весь очищенный продукт и конструкцию pCIG2 Ube3a WT с соответствующими ферментами рестрикции (пример показывает пищеварение с помощью EcoRI и XmaI).
  6. После 2 ч пищеварения при 37 °C растворяют продукты пищеварения посредством агарозного геля электрофореза (1% гель) и гель-очищают соответствующими продуктами. Настройте лигирование в соответствии с протоколом производителя (Таблица материалов), преобразуйте продукты лигирования в бактериальный штамм DH10B (Таблица материалов), а затем пластину с выбором ампициллина (100 мкг/мл).
  7. На следующий день выберите от двух до четырех колоний, чтобы привить 3 мл культур, содержащих бульон Лурия (LB) и 100 мкг / мл ампициллина. Дайте культурам расти ночью при 37 °C в орбитальном инкубаторе с встряхиванием (225 об/мин).
  8. На следующий день используйте 1-1,5 мл бактериальной культуры для минипрепа плазмидной ДНК (Таблица материалов). Сохраните оставшиеся культуры, поместив их при температуре 4 °C. Скрининг мини-подготовленных плазмид методом секвенирования Сэнгера с использованием олигонуклеотида, который связывает ~ 200 bp от желаемой мутации.
  9. Используйте бактериальные культуры, сохраненные при 4 °C, для повторной инокуляции культур 50 мл для мидипрепа правильной плазмиды (Таблица материалов). Полная секвенирование кодирующей последовательности Ube3a для проверки правильной последовательности ДНК.
  10. Создание рабочих запасов плазмид варианта Ube3a, а также β-катенин-активированного репортера (BAR)21, TK-Ренилла люциферазы, лигазы-мертвой Ube3a (мутация UBE3A C820A) и пустого вектора pCIG2 в концентрации 100 нг/мкл с использованием стерильногоH2Oдля последующих стадий трансфекции.

2. Получение и трансфекция эмбриональных клеток почек человека 293T (HEK293T)

  1. Проводят анализы в клетках HEK293T, выращенных в модифицированной среде Dulbecco Eagle (DMEM), предварительно дополненной глютамином, 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и антибиотико-антимикотическим агентом, как описано ранее17. Выращивайте клетки в стерильном, увлажненном инкубаторе при 37 °C с 5% CO2.
  2. Используя шкаф биобезопасности, сначала нанесите взвешенные клетки HEK293T на обработанные культурой тканей 96-луночные плоскодонные пластины с плотностью 2,2 × 104 клетки на скважину в 100 мкл культуральной среды и позвольте им расти в течение ночи.
  3. На второй день трансфектируют клетки в шкафу биобезопасности с помощью светлячков и рениллы люциферазы репортерных плазмид (таблица 4) и плазмид Ube3a в трех экземплярах. Выполняют трансфекции в 10 мкл общего объема на лунку, используя соотношение плазмид 10:1:8 (50 нг БАР, 5 нг TK-Renilla и 40 нг плазмиды Ube3a на лунку соответственно), как описано ранее18, и 0,4 мкл трансфекционного реагента (таблица 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого эксперимента пустой вектор (только GFP) и плазмида, кодирующая лигазу Ube3a , также трансфицируются, чтобы служить отрицательными элементами управления.
  4. Создайте мастер-микс для трансфекции для каждого варианта в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл (таблица 4) и инкубируйте при комнатной температуре (RT) в течение 15 минут. После инкубации осторожно перемешивают трансфекционную смесь, постукивая по трубке, а затем добавляют 10 мкл трансфекционной смеси непосредственно в существующие питательные среды в скважинах.
  5. После этого верните клетки в инкубатор и дайте плазмидам экспрессироваться в течение 48 ч. Замена питательных сред не требуется.
  6. Мониторинг эффективности трансфекции с помощью флуоресценции GFP с помощью флуоресцентного микроскопа. Клетки HEK293T эффективно трансфектируются этим методом, и >80% клеток должны экспрессировать GFP через 48 ч.

3. Измерение активности люциферазы

ПРИМЕЧАНИЕ: Активность люциферазы оценивается с использованием коммерчески доступной системы, которая анализирует как Светлячка, так и Рениллу люциферазу (Таблица материалов) в соответствии с протоколом производителя.

  1. Осторожно аспирируйте культуральную среду из трансфектированных клеток HEK293T, а затем промывайте клетки холодным фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS). Аспирировать PBS и лизировать клетки, добавляя 25 мкл неденатурирующего лизисного буфера и инкубировать в течение 15 мин с мягким раскачиванием на льду.
  2. После этого добавьте 20 мкл полученного лизата (центрифугирование не требуется) в новую 96-луночную пробирную пластину, содержащую 100 мкл реагента субстрата люциферазы Светлячка. Аккуратно перемешайте тарелку постукиванием.
  3. Загрузите пластину на считыватель пластин и измерьте люминесценцию с помощью верхнего детектора с высотой считывания 1 мм и временем интеграции 1 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент усиления детектора, возможно, потребуется отрегулировать в зависимости от силы сигнала.
  4. Сразу после считывания люминесценции люциферазы светлячка добавьте в лунки 100 мкл субстрата люциферазы Renilla. Этот шаг одновременно утоляет активность люциферазы Светлячка при оценке активности люциферазы Рениллы. Смешайте образцы путем мягкого перемешивания пластины и снова измерьте люминесценцию, чтобы оценить активность люциферазы Renilla .
    ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как другие пластины могут быть использованы для этого анализа, использование пластин с черными рамками и белыми колодцами обеспечит наиболее чувствительные результаты, поскольку это усиливает сигнал люциферазы при минимизации шума.
  5. Количественно оцените ответы репортера как отношение люциферазы светлячка к люциферазе Рениллы (Firefly/Renilla) и усредните значения трехкратных измерений. После этого нормализуйте значение Firefly/Renilla для каждого варианта по отношению к значениям для клеток Ube3a дикого типа (WT), чтобы сравнить относительную активность альтернативных белков.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Крупномасштабный функциональный скрининг вариантов Ube3a missense выявляет широкий ландшафт мутаций потери и усиления функции
Предыдущая работа с мутантами Ube3a показала, что ответ Wnt может служить репортером активности клеточного белка UBE3A. Эти наблюдения были расширены, и были проведены дополнительные эксперименты по валидации, чтобы выяснить, подходит ли анализ BAR для сообщения о диапазоне активности UBE3A в клетке. Во-первых, клетки HEK293T были трансфектированы различным ко...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, описанный здесь, обеспечивает эффективный и масштабируемый метод оценки ферментативной активности вариантов Ube3a. Есть несколько технических деталей, которые требуют тщательного рассмотрения при использовании этого анализа. Одним из соображений является выбор плазмид репортера Wnt, используемых в этом анализе. Протокол, описанный здесь, специально использует β-катенин-активированный репортер (BAR)21, репортер, который содержит конкатемер 12 элементов ответа Т-клеточного фактора...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана премией Фонда Саймонса «Мост к независимости» (SFARI Award #387972; J.J.Y.), премия NARSAD Young Investigator Award от Фонда исследований мозга и поведения (J.J.Y.), исследовательская стипендия от Фонда Альфреда. Слоуна (J.J.Y.) и исследовательские гранты от Фонда синдрома Ангельмана (J.J.Y.), Фонда Уайтхолла (J.J.Y.) и NIMH (R01MH122786; Д.Ж.Ю.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,05% трипсин-ЭДТА (1x), фенол красныйGibco25300-054
1 Kb DNA ladderLambda BiotechM108-S
100 bp DNA LadderLambda BiotechM107
10x Буфер для T4 DNA Ligase с 10 мМ АТФNew England BioLabsB0202A
5x Phusion HF Реакционный буферNew England BioLabsB0518S
Антибиотик-антимикотический растворCorning30004CI
Черный/белый Isoplate-96 Черная рамка Белая ЛункаПластина PerkinElmer6005030
Карбенициллин Динатриевая сольMidwest ScientificKCC46000-5
Countess Камера для подсчета клеток  слайдыInvitrogen by Thermo Fisher ScientificC10283
Countess II Автоматический счетчик ячеек life technologiesМашина для подсчета клеток
Custom DNA oligos IntegratedDNA Technologies (IDT)
Смесь растворов дезоксинуклеотидов (dNTP) NewEngland BioLabsN0447S
DMEM, высокий уровень глюкозы, добавка GlutaMAX, пируватGibco10569044базальная среда для поддержки роста HEK293T клеточной линии
DPBS (1x)Gibco14190-136
Двухлюциферазный репортерный анализаторPromegaE1910
EcoRI-HF New England BioLabsR3101SФермент рестрикции
Фетальная бычья сыворотка, квалифицированная, термоинактивированнаяGibco16140071Фетальная бычья сыворотка
Fisherbrand Surface Обработанные блюда для культуры тканейFisherbrandFB012924
FuGENE 6 Реагент для трансфекцииPromegaE2691
Гель для загрузки красителя фиолетового цвета (6x)Новая Англия BioLabsB7024A
HEK293T клеткиATCCCRL-3216
Высокоэффективные ig 10B Химически компетентные клеткиИнтактные геномики1011-12E. coli DH10B клетки
HiSpeed Plasmid Midi KitQiagen12643Midi prep
pCIG2 плазмида
pGL3 BAR плазмида
Phusion HF DNA PolymeraseНовая Англия BioLabsM0530LДНК-полимераза
ProFlex 3 x 32 лунки ПЦР Система ПЦРПрименяемые биосистемы по технологиижизни Термоамплификатор
pTK Ренилла плазмида
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)Qiagen27106Мини-преп
QIAquick Набор для экстракции геля (250)Qiagen28706Очистка
гелемQIAquick PCR Purification Kit (250)Qiagen28106PCR Очистка
rCutSmart BufferNew England BioLabsB6004S
SacI-HFNew England BioLabsR3156SФермент рестрикции
Synergy HTX Multi-Mode ReaderBioTek  Планшетный ридер работает под управлением программного обеспечения Gen5 v3.08 (BioTek)
T4 DNA LigaseNew England BioLabsM0202LLigase
TAE Buffer, трис-ацетат-ЭДТА, 50x раствор, электрофорезFisher ScientificBP13324
тканевая культуральная пластина 96 лунок, плоское дноFisherbrandFB012931
ультрачистый раствор бромида этидияInvitrogen от Thermo Fisher Scientific
XmaINew England BioLabsR0180Sрестрикционный фермент
Gibco15585011

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).
  2. Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
  3. Starita, L. M., et al. Variant interpretation: Functional assays to the rescue. American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).
  4. Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53. Cell. 75 (3), 495-505 (1993).
  5. Albrecht, U., et al. Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons. Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).
  6. Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain. Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).
  7. Vu, T. H., Hoffman, A. R. Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain. Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).
  8. Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome. Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).
  9. Jiang, Y. H., et al. Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation. Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).
  10. Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes. Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).
  11. Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13. Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).
  12. Urraca, N., et al. The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature. Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).
  13. de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics. Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).
  14. Scheffner, M., Staub, O. HECT E3s and human disease. BMC Biochemistry. 8, Suppl 1 (2007).
  15. Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein. Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).
  16. Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. TGF-beta signaling specifies axons during brain development. Cell. 142 (1), 144-157 (2010).
  17. Yi, J. J., et al. The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).
  18. Weston, K. P., et al. Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis. Nature Communications. 12 (1), 6809(2021).
  19. Hand, R., Polleux, F. Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum. Neural Development. 6, 30(2011).
  20. Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).
  21. Biechele, T. L., Moon, R. T. Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs. Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).
  22. Yi, J. J., et al. An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A. Cell. 162 (4), 795-807 (2015).
  23. Kuhnle, S., et al. Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).
  24. Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing. Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).
  25. Avagliano Trezza, R., et al. Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome. Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).
  26. Bossuyt, S. N. V., et al. Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations. Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Ube3a VariantsFunctional AssessmentUbiquitin LigaseAngelman SyndromeAutism SpectrumCell Based AssayHEK293T CellsLuciferase ReporterBAR AssayMutational Analysis

Related Articles