Эксперименты на животных проводились в соответствии с принципами регионального комитета (Ministerium für Energiewende, Landwirtschaft, Umwelt, Natur und Digitalisierung des Landes Schleswig-Holstein, номер разрешения: V242-21249/2020 [38-4/20]). Мыши, использованные для настоящего исследования, были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). Животные содержались в стандартных условиях с 12-часовым светом, 12-часовым ночным циклом; вода и еда предлагались ad libitum.
1. Уход за животными
- Размещайте мышей в специализированных клетках с подстилкой, гнездовым материалом, укрытием и надлежащим доступом к питьевой воде и пище.
- Держите животных под постоянным специализированным ветеринарным контролем и лечением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для мышей, заказанных внешними поставщиками, пожалуйста, обеспечьте 7 дней акклиматизации перед началом процедуры.
2. Подготовка уплотнительного кольца
ПРИМЕЧАНИЕ: Уплотнительное кольцо с фиксированным диаметром 0,4 мм рекомендуется индуцировать гипертрофию сердца через 2 недели. Степень и тяжесть индуцированного сердечного фенотипа зависят от размера диаметра уплотнительного кольца.
- Во-первых, выполните один разрез уплотнительного кольца (см. Таблицу материалов) под микроскопом с помощью ножниц или скальпеля, чтобы обеспечить размещение вокруг аорты (рисунок 1A, B).
- Проткните каждую сторону кольца близко к разрезу иглой, соединенной с 8-0 нерассасывающийся шов и натянуть нить. Отрежьте и оставьте 2-3 см с одной стороны и 2 см с другой стороны, чтобы закрепить уплотнительное кольцо вокруг аорты на заключительном этапе (рисунок 1C, D).
- Перед операцией возьмите средство для перевязки (видовой инструмент, см. Таблицу материалов) и потяните конец нити (которая держится дольше) одной кольцевой стороны через отверстие сужения (рисунок 1E, F). Отложите средство для перевязки с прикрепленным уплотнительным кольцом в сторону для размещения на следующем этапе (шаг 6).
- Для дезинфекции кольца нитками поместите кольцо в спиртовой раствор на полчаса. После этого выложите его на целлюлозу для высыхания. Держите высушенное кольцо в закрытой ванне или футляре до использования. Во время операции, после протягивания нити через средство перевязки, поместите кольцо на чистую поверхность до использования.

Рисунок 1: Выполнение подготовки уплотнительного кольца к перевязке. (А) Уплотнительное кольцо фиксированного диаметра разрезается ножницами или скальпелем с одной стороны. (B) Изображение уплотнительного кольца. (C) Каждая сторона уплотнительного кольца прокалывается со счетом 8-0 проленовая нить. (D) Уплотнительное кольцо, пробитое двумя нитями. (E) Нити одной кольцевой стороны уплотнительного кольца протягиваются через отверстие лигативного средства. (F) Конечное положение перед размещением: нити одной стороны помещаются через отверстие лигативного средства, в то время как нити другой стороны остаются свободными. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
3. Премедикация мышей и подготовка операционного поля
- Чтобы получить достаточную анальгезию во время операции, вводите анальгетик бупренорфин (0,1 мг/кг, см. Таблицу материалов) внутрибрюшинно за 20 мин до начала операции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования обезболивающее использовалось в соответствии с рекомендациями Gesellschaft für Versuchstierkunde/Общества лабораторных наук о животных (GV-SOLAS).
- После премедикации обезболивают мышь в индукционной камере 2%-4% изофлураном, смешанным с 0,5-1,0 л/мин 100%O2.
- Сбрить мех на левой стороне грудной клетки успокоенной мыши. После бритья поместите мышь обратно в камеру, заполненную изофлураном, и дождитесь достаточной седации, прежде чем интубировать животное.
ПРИМЕЧАНИЕ: Правильная точка седации показывает медленное дыхание, но позволяет избежать мгновенного дыхания. В зависимости от газовой установки изофлурана для достижения нужного уровня седации требуется 2-3 мин.
- Включите грелку перед операцией, чтобы поддерживать температуру тела животного (37 °C). Подключите грелку к ректальному зонду (см. Таблицу материалов) для автоматического поддержания температуры тела мыши.
4. Интубация мышей
- Подготовьте необходимые приборы (рисунок 2А). Продезинфицируйте ларингоскоп перед операцией, поместив его в спирт примерно на 1-3 минуты, а затем оставив его для высыхания на ночь.
- Растяните резинку вокруг грелки, чтобы закрепить мышь передними зубьями на пластине. Поместите седативную мышь на грелку в лежачем положении.
- Поместите резинку на передние зубы животного, чтобы вытянуть шею на пластине.
- Сфокусируйте источник света на горле для хорошей видимости отверстия трахеи для эндотрахеальной интубации (рисунок 2B).
- Осторожно откройте рот одной рукой, позиционируя вспомогательное средство для интубации (ларингоскоп ручной работы, см. Таблицу материалов) (рисунок 2A[3]).
- Другой рукой и небольшими щипцами осторожно двигайте языком, чтобы очистить отверстие трахеи.
- Используйте эту руку также для введения эндотрахеальной трубки в трахею. С другой стороны, до сих пор держат интубационную помощь. Для интубации используйте канюлю весом 22 Г (см. Таблицу материалов) (рисунок 2A[1]).
- Подключите положение эндотрахеальной трубки через трехсторонний стоп-кран к вентилятору (см. Таблицу материалов) для мышей, чтобы подтвердить правильное положение эндотрахеальной трубки (эндотрахеальной).
- Контролируйте правильную вентиляцию в соответствии с инструкциями производителя (приливный объем 200 мкл и частота дыхания между 100-150 вдохами/мин) (рисунок 2C).
- Подтвердите достаточную глубину анестезии с помощью рефлекторной проверки пальца ноги (нет рефлекторного ответа).
- Превратите анестезиологическую установку в 2% изофлуран, смешанный с 0,5-1,0 л/мин 100% O2.
- Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы избежать сухости во время операции.
- Используя ватный тампон, продезинфицируйте область операции 3 раза коммерчески доступным дезинфицирующим раствором (см. Таблицу материалов).

Рисунок 2: Интубация мыши. (А) Инструменты интубации: (1) В качестве эндотрахеальной трубки (без мандарина) используется канюля 22 Г и.В.; 2) щипцы; (3) Ларингоскоп ручной работы (деформированная/сплющенная канюля, склеенная деревянными палочками и лентой). (B) Выполнение интубации на расположенной грелке. (C) Интубированная мышь, подключенная к вентилятору. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
5. Хирургия и подготовка к позиционированию кольца
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стерильные материалы и инструменты, чтобы избежать инфекций.
- С помощью ножниц сделайте разрез кожи длиной 0,5-1 см в середине линии между клифовым отростком и левой подмышечной впадиной. Используйте щипцы, чтобы отделить мышечный слой от нижележащих ребер и поместить два втягивающих устройства (длиной 5 мм, см. Таблицу материалов) в разрез, чтобы обнажить грудную клетку.
- Чтобы начать левую торакотомию, выполните небольшой разрез (~1-2 мм) в межреберных мышцах между вторым и третьим ребром с помощью микропружинальных ножниц. Откройте грудную полость и распределите разрез щипцами под углом 45°.
- Поместите три ретрактора грудной клетки (длиной 1,0-2,5 мм) в разрез для открытия грудной полости для улучшения визуализации.
- Чтобы обнажить дугу аорты, попробуйте поднять вверх и аккуратно отделить тимус и жировую ткань от дуги тонким кончиком 45° угловыми щипцами.
6. Перевязка поперечной аорты уплотнительным кольцом
- Обнажите дугу аорты щипцами под углом 45° в одной руке. Поместите, с другой стороны, уплотнительное кольцо, соединенное с помощью лигирования через нити одной стороны (шаг 2).
- Пропустите нити с помощью средства перевязки под дугу аорты с каудальной стороны на черепную сторону поперечной аорты между брахиоцефальной и левой общей сонной артериями (рисунок 3А).
- Осторожно возьмите обе нити между средством перевязки и дугой аорты щипцами. Втяните и извлеките средство перевязки и аккуратно расположите уплотнительное кольцо вокруг арки, потянув резьбу с каждой стороны (рисунок 3B).
- После успешного позиционирования закрепите уплотнительное кольцо нитями и хирургическим узлом. Сделайте дополнительный, чтобы избежать вскрытия узла с каждой стороны (рисунок 3C).

Рисунок 3: Выполнение имплантации уплотнительного кольца. (А) Дуга аорты обнажается тремя втягивающими устройствами размером 1,0-2,5 мм. Обе длинные нити одной кольцевой стороны проходят под аорту. (B) Уплотнительное кольцо будет помещено путем осторожного нажатия кольца и вытягивания резьбы. (C) Уплотнительное кольцо находится в правильном положении, и одна черепная нить завязана каудальной нитью с каждой стороны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
7. Шов и послеоперационное восстановление
- Извлеките из разреза три ретрактора грудной клетки (длиной 2,5 мм).
- При необходимости исключите остаточный воздух из грудной клетки, заполнив ее теплым 0,9% изотоническим раствором соли.
- Чтобы обнажить разрез грудной клетки для шва, снова возьмите два втягивателя (длиной 5 мм), чтобы зажать кожу сбоку.
- Закройте грудную клетку двумя или тремя 6-0 нерассасывающимися швами (см. Таблицу материалов) и отщипните отток вентилятора на 2 с, чтобы повторно сдуть легкие.
- Удалите два втягивающих средства и закройте кожу тремя-пятью 4-0-рассасывающимися швами.
- Выключите изофлуран и монитор. Когда животное начинает самодыхать, усы двигаются, и на пальце ноги могут срабатывать рефлексы защемления, экстубировать мышь. Положите мышь с левой стороны под тепловую лампу в ее блоке ухода и наблюдайте за ней, пока она полностью не проснется.
- Не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока оно не придет в достаточное сознание.
ПРИМЕЧАНИЕ: Животное, перенесшее операцию, должно получить собственное отделение по уходу (клетку) для лучшего выздоровления.
- Проводят лечение боли трамадолом (1 мг/мл) в питьевой воде в течение 7 дней и бупренорфином (0,1 мг/кг, 3 раза в сутки) путем внутрибрюшинной инъекции в течение 3 дней после операции, если это необходимо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте рекомендациям местного комитета по этике животных для послеоперационного обезболивания.
- Проверяйте лекарства, ежедневно взвешивая бутылки с водой и наблюдайте за поведением животного.
8. Подтверждение успешного сужения и правильного положения кольца
- Через день после операции проверьте стеноз с помощью ультразвука, измерив максимальную скорость потока над стенозом.
- Для измерений используют эхокардиографию с ультразвуковой системой и датчиком зонда с частотой 30 МГц (см. Таблицу материалов).
- Как описано выше, поддерживают анестезию с помощью маски при 1,5%-2% изофлурана с 0,5-1,0 л/мин 100%O2.
- Поместите обезболенное животное на грелку в лежачем положении. Подключите грелку с ректальным зондом для поддержания температуры тела на уровне 37 °C ± 1 °C и контролируйте частоту сердечных сокращений с помощью ЭКГ с помощью четырех датчиков лап мыши (см. Таблицу материалов).
- Для лучшей визуализации используйте крем для депиляции.
- Успешно выполненный ORAB приводит к увеличению скорости потока над стенозом, измеренной ультразвуком (~ 2 400 мм / с) (рисунок 4C). Для этого измерения расположите головку преобразователя парастернально на правой стороне грудной клетки, чтобы локализовать дугу аорты с помощью двумерной (2D) визуализации («B-режим»).
- Используйте цветной допплер для визуализации кровотока в аорте и измерения с помощью импульсной волны допплеровской скорости кровотока над стенозом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши с фиктивной операцией (контрольная операция без сужения) показывают скорость кровотока ~ 600-900 мм / с. Кроме того, успешный ORAB также приводит к увеличению скоростного расхода между правой сонной артерией (~ 150 мм / с) (RC, рисунок 4A) и левой сонной (~ 300 мм / с) LC, рисунок 4B) в мыши.
- Визуализируйте правую и левую артерию carotis interna с помощью двумерной (2D) визуализации (B-режим). Расположите головку преобразователя горизонтально на левой и правой сторонах шеи под углом 45° и используйте импульсную волну допплера для определения скорости кровотока.
ПРИМЕЧАНИЕ: У мышей с фиктивной операцией скорость потока в обеих артериях одинакова.

Рисунок 4: Подтверждение перевязки поперечной аорты с помощью импульсно-волнового доплеровского измерения скорости в сонных артериях. (А) Репрезентативная импульсная волна доплеровской скорости сигналов правой сонной артерии. (B) Стеноз приводит к более высокой скорости потока в правой сонной артерии, чем в левой. (C) Стеноз, вызванный сужением, приводит к скорости потока в нисходящей аорте более 2 400 мм/с. Фиктивные мыши показывают скорость потока 600-900 мм/с. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.