Настоящий протокол описывает извлечение люмиканов из амниотической мембраны (AM) и условия их хранения в виде экстракта AM (AME) при -20 °C, 4 °C и комнатной температуре (RT) в течение 6, 12, 20 и 32 дней для количественной оценки его белков и концентрации люмиканов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Извлечение люмикана из амниотической мембраны и определение температуры ее хранения
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Люмикан представляет собой небольшой богатый лейцином протеогликан в амниотической мембране человека (АМ), который способствует эпителизации роговицы и организации коллагеновых волокон, поддерживая прозрачность роговицы. В настоящей работе предложен способ экстракции белка из АМ для получения люмикана. Кроме того, оценивается стабильность люмикана в экстракте AM (AME), хранящемся при различных температурах и периодах времени. 100 мг АМ размораживали и механически деэпителизировали. Деэпителиализованный АМ замораживали и измельчали до получения мелкого порошка, который солюбилизировали 2,5 мл физиологического буфера с ингибиторами протеазы и центрифугировали для экстракции белка. Супернатант собирали и хранили при -20 °C, 4 °C и комнатной температуре (RT) в течение 6, 12, 20 и 32 дней. После этого люмикан был количественно определен в каждом AME. Этот метод позволяет создать доступный и доступный протокол для извлечения люмиканов из AM. На концентрацию люмикана влияли время хранения и температурные условия. Люмикан в АМЕ 12 дней хранился при -20 °C и 4 °C был значительно выше, чем в других AME. Эта экстракт люмикана может быть полезна для разработки методов лечения и фармацевтических решений. Необходимы дальнейшие исследования для определения использования люмикана AME в процессе реэпителизации и заживления ран.
Введение
Одним из наиболее часто используемых методов лечения поражений роговицы является трансплантация амниотической мембраны; однако в последние годы появились новые предложения по использованию различных компонентов амниотической ткани в качестве альтернативных и адъювантных методов лечения. К числу наиболее изученных компонентов АМ относятся те, которые получены из экстракта АМ (АМЕ)1,2,3,4,5,6,7. AM содержит множество растворимых факторов, т....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все экспериментальные процедуры были одобрены Институциональным наблюдательным советом (проект No CEI-2020/06/04). AM был получен из Банка АМТа Офтальмологии Валенсии (из деидентифицированных людей), который подготовлен, как описано Чавесом-Гарсией и др.17.
1. Приготовление экстракта амниотической мембраны
- Получают 100 мг АМ из амнионного банка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно предыдущему отчету, 50 мг АМ секретирует в общей сложности 10 нг/мл люмикана14. Для получения более высокой концентрации люмикана используют 100 мг АМ, что эквивалентно общей площади 32см2.<....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Результаты сообщаются как среднее значение ± стандартного отклонения (SD). Были проведены студенческие т-тесты и анализ дисперсии (ANOVA). P-значения < 0,05 были признаны статистически значимыми. Статистический анализ проводился с использованием статистического программного обеспечения (см. Таблицу материалов).
Общее количество белка в АМЕ зависело от времени и условий хранения. Концентрация базального белка была одинаковой среди всех АМЕ; диапазон общего .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В данном исследовании анализировалось наличие люмикана в АМЕ и его прямая корреляция с его стабильностью при различных условиях хранения. Интересно, что когда общая концентрация белка в АМЕ была количественно определена, концентрация белка увеличивалась после хранения. Данные свидетельствуют о трех механизмах, которые могут изменить концентрацию белка в замороженном хранилище: холодная денатурация, замороженная концентрация растворенных веществ и частичное развертывание структуры белка19, вызванно.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Исследование финансировалось Программой поддержки научно-исследовательских и технологических инновационных проектов Национального автономного университета Мексики (грант No PAPIIT IN203821) и Министерства образования, науки, технологий и инноваций (грант No SECTEI 250/2019).
Благодарности
У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1 N H2SO4 stop solution | R& D Systems | DY994 | |
| 100 μ L микродозатор | Eppendorf | ||
| 1000 μ L микропипетка | Eppendorf | ||
| 15 мм чашка | Петри Symlaboratorios | ||
| 18 G Игла (1,2 мм x 40 мм) | BD Becton Dickinson | ||
| микроцентрифужная пробирка | Eppendorf | Z606340 | |
| пластиковый шприц объемом 20 мл; | BD Becton Dickinson | ||
| 20 μ L микропипетка | Eppendorf | ||
| 20-200 μ Микропипетка | L Eppendorf | ||
| 5 мл микроцентрифужная пробирка | Eppendorf | 30119401 | |
| 96-луночный микропланшет | SARSTEDT | 821581 | |
| Алюминиевая фольга | Н/ | Д Н/Д | |
| Амниотическая мембрана | Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank | 100 мг | |
| Сбалансированный раствор соли | Bausch + Lomb | BSS-403802 | |
| Стакан | н/д н | /д | |
| BioRender | BioRender | ||
| Компактный рокер | BioRad | 970822DD | Mod. 5202SD-BIO |
| полный, без ЭДТА, ингибитор протеазы коктейльные таблетки | Roche | 11 873 580 001 | Ингибитор протеазы |
| Daiggner vortex Genie 2 | A.Daigger & Co. , INC | 22220A | |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | |
| ELISA планшетный спектрометр | Thermo Labsystems& НБСП; | 35401106 | Морозильная |
| камера | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc | версия 9 | для статистического анализа и графической программы |
| Human lumican DuoSet ELISA kit | R& D Systems | DY2846-05 | включает в себя инкубатор антител Lumican Capture |
| для человека | Форма Научная | 3326 Серийный номер 36481-7002 | |
| Микроскоп с инвертированным светом | Olympus | 6A13921 | для подтверждения деэпителизации Mod.CK2 |
| Ламинарный проточный колпак | Forma Scientific | 14753-567 | Mod.1184 |
| Жидкий азот | Н/Д | /Д | |
| Раствор | Н/ | Д | |
| Многоканальный дозатор | Eppendorf | ||
| Nitrogen Tank | Thermo Scientific | Mod. Biocan 20 | |
| Бумажные полотенца | Н/Д | Н/Д | |
| Фосфатно-солевой буфер | R& D Systems | DY006 | |
| Pierce Модифицированный набор для анализа белка Lowry | Thermo Scientific | 23240 | |
| Пластинчатые запайщики | R& D Systems | DY992 | |
| Разбавитель реагентов | R& D Systems | DY995 | 1% BSA в PBS, pH 7,2-7,4, 0,2 μ m фильтрованная |
| Охлаждаемая центрифуга | centurion scientific Ltd | 15877 | Мод. K2015R |
| Резиновый скребок полицейский NEST | 710001 | для механической деэпителизации | |
| Скальпельный нож | Braun | BB521 | No10 или 21 |
| Стрептавидин-HRP 40-кратный концентрат | НИР D Systems | часть 893975 | |
| Субстрат раствор тетраметилбензидина (TMB) | R& D Systems | DY999 | |
| Зубчатый пинцет | Invent Germany | 6b | inox |
| Сверхчистая вода | PISA | ||
| Wash buffer | R& D Systems | WA126 | 0,05% Твин 20 в PBS, pH 7,2-7,4 |
Ссылки
- Jirsova, K., Jones, G. Amniotic membrane in ophthalmology: properties, preparation, storage and indications for grafting-a review. Cell and Tissue Banking. 18 (2), 193-204 (2017).
- Witherel, C., Yu, T., Concannon, M., Dampier, W., Spiller, K.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
