Секреция корневых экссудатов обычно является внешней стратегией детоксикации растений в стрессовых условиях. В этом протоколе описывается, как оценить влияние ксенобиотиков на люцерну с помощью нецелевого метаболомного анализа.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Сбор экссудатов корня люцерны для изучения влияния ди(2-этилгексил)фталата на продукцию метаболитов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Корневые экссудаты являются основным средством передачи информации и передачи энергии между корнями растений и окружающей средой. Изменение секреции корневых экссудатов обычно является внешней стратегией детоксикации растений в условиях стресса. Этот протокол направлен на введение общих рекомендаций по сбору экссудатов корня люцерны для изучения влияния ди(2-этилгексил)фталата (DEHP) на производство метаболитов. Во-первых, саженцы люцерны выращивают под давлением DEHP в эксперименте по гидропонной культуре. Во-вторых, растения переносят в центрифужные пробирки, содержащие 50 мл стерилизованной сверхчистой воды, в течение 6 часов для сбора корневых экссудатов. Затем растворы лиофилизируют в вакуумной сублимационной сушилке. Замороженные образцы экстрагируют и дериватизируют реагентом бис(триметилсилил)) трифторацетамида (БСТФА). Затем дериватизированные экстракты измеряют с помощью системы газового хроматографа в сочетании с времяпролетным масс-спектрометром (ГХ-ТОФ-МС). Полученные данные о метаболитах затем анализируются на основе биоинформатических методов. Дифференциальные метаболиты и значительно измененные пути метаболизма должны быть глубоко изучены, чтобы выявить влияние DEHP на люцерну с учетом корневых экссудатов.
Введение
Ди(2-этилгексил)фталат (DEHP) представляет собой синтетическое химическое соединение, которое широко используется в различных пластмассах и полимерах в качестве пластификатора для повышения их пластичности и прочности. В последние несколько лет все большее число исследований показало, что DEHP является эндокринным разрушителем и оказывает неблагоприятное воздействие на дыхательную, нервную и репродуктивную системы человека и других животных 1,2,3. Учитывая риск для здоровья, Агентство по охране окружающей среды США, Европейский Союз и Центр мониторинга окружающей среды Китая ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Цель этого протокола состоит в том, чтобы обеспечить общий конвейер, от эксперимента по гидропонной культуре до метаболомного анализа, количественно оценивающего влияние DEHP на экссудаты корня люцерны.
1. Эксперимент с гидропонной культурой
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе представлен пример эксперимента по гидропонной культуре люцерны, предназначенного для получения проростков люцерны (Medicago sativa) в условиях стресса различных концентраций DEHP. Были назначены три обработки: контроль без каких-либо добавок и питательный раствор с добавлением 1 мг кг-1 и 10 мг кг-1 ди(DEHP.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В этом эксперименте экссудаты корня люцерны были собраны, экстрагированы и проанализированы в соответствии с вышеуказанными методами (рис. 1). Были созданы три группы лечения: контрольная, с низкой концентрацией DEHP (1 мг л-1) и с высокой концентрацией DEHP (10 мг л-1).
Всего на хроматографе контроля было обнаружено 778 пиков, из которых 314 метаболитов могли быть идентифицированы по масс-спектрам. Как показано на рисунк.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол содержит общие рекомендации по сбору и измерению корневых экссудатов люцерны при стрессе DEHP, а также по анализу данных метаболома. Пристальное внимание необходимо уделить некоторым критическим шагам в этом протоколе. В экспериментах по гидропонным культурам саженцы люцерны культивировали на гидропонике в стеклянных бутылках, наполненных питательными растворами с различными концентрациями DEHP. Стеклянные бутылки следует защищать от света, покрывая их алюминиевой фольгой в течение всего периода культивиров.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в этой статье.
Благодарности
Эта работа была поддержана совместно Национальным фондом естественных наук Китая (41877139), Крупными проектами Национального фонда естественных наук Китая (41991335), Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (2016YFD0800204), Фондом естественных наук провинции Цзянсу (No BK20161616), Планом «135» и Программой границ Китайской академии наук (ISSASIP1615).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Адонитол | SIGMA | ≥ 99% | |
| Семена люцерны | Цзянсуская академия сельскохозяйственных наук (Нанкин, Китай) | ||
| Аналитические весы | Sartorius | BSA124S-CW | |
| BSTFA | REGIS Technologies | с 1% TMCS, v/v | |
| Центрифуга | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Хроматографическая колонка | Agilent | ДБ-5МС (30 м & раз; 250 & м; m & times; 0,25 μ m) | |
| Ди(2-этилгексил) фталат | Д-р Эренсторфер | ||
| FAMEs | Д-р Эренсторфер | ||
| Газовая хроматография (GC) | Agilent | 7890A | |
| Шлифовальный инструмент | Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd | JXFSTPRP-24 | |
| Масс-спектрометр (MS) | LECO | PEGASUS HT | |
| Метанол | CNW Technologies | ВЭЖХ | |
| метоксиаминатио гидрохлорид | TCI | AR | |
| Микроцентрифужная трубка | Eppendorf Eppendorf | Quality | 1,5 мл |
| Духовка | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd | DHG-9023A | |
| Пиридин | Адамас | ВЭЖХ | |
| R программное обеспечение | программное обеспечение для статистического анализа (обогащение путей, топология) | ||
| SIMCA16.0.2 | программное обеспечение для статистического анализа (OPLS-DA и т. Д.) | ||
| Сверхнизкотемпературный морозильник | Thermo Fisher Scientific | Forma 900 серия | |
| Ультразвук | Шэньчжэнь Fangao Microelectronics Co., Ltd | YM-080S | |
| Вакуумная сушилка | Тайцан Хуамэй завод биохимических инструментов | LNG-T98 |
Ссылки
- Yin, X. H., Zeb, R., Wei, H., Cai, L. Acute exposure of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) induces immune signal regulation and ferroptosis in oryzias melastigma. Chemosphere. 265, 129053(2021).
- Seyoum, A., Pradhan, A.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
