Микровыборка в целевом масс-спектрометрическом анализе белков с низким содержанием белка

Краткое содержание

Представлен протокол определения биомаркеров низкого содержания из высушенных образцов сыворотки на примере биомаркера пептида высвобождения прогастрина (ProGRP). Магнитные шарики, покрытые антителами, используются для селективной очистки и обогащения протеотипического пептида ProGRP. Захваченный пептид впоследствии анализируется с помощью жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии.

Аннотация

В этой статье представлен протокол с подробным описанием эффективной очистки образцов от белков с низким содержанием из высушенных образцов. Это выполняется с использованием протеолиза на основе гранул перед определением аффинного захвата протеотипического пептида и тандемной масс-спектрометрии жидкостной хроматографии (ЖХ-МС/МС). Процедура может быть применена как к обычным высушенным образцам с использованием бумажных карт (например, высушенные пятна крови [DBS] и высушенные сывороточные пятна [DSS]), так и к образцам, собранным с помощью новых методов отбора проб, таких как объемный абсорбционный микроотбор проб (VAMS). В дополнение к описанию этой процедуры, в этой работе поэтапно представлено получение как трипсиновых шариков, так и шариков, покрытых антителами. Преимуществами представленной процедуры являются эффективный по времени протеолиз с использованием гранул и селективная надежная очистка с помощью пептидного аффинного захвата. Текущая процедура описывает определение биомаркера малораспространенного мелкоклеточного рака легкого (МРЛ), пептида, высвобождающего прогастрин (ProGRP), в высушенной сыворотке (как DSS, так и VAMS). Подробные процедуры подготовки шариков облегчают внедрение рабочего процесса в новых приложениях или других лабораториях. Показано, что результаты могут зависеть от материала для отбора проб; в рамках настоящего проекта для образцов, собранных с помощью VAMS, наблюдалась более высокая интенсивность сигнала по сравнению с DSS.

Введение

Микровыборка существует уже более 100 лет с тех пор, как Ивар Банг описал мониторинг глюкозы с помощью DBS в 1913 году¹. После того, как в 1963 году Гатри и Сьюзи представили DBS для определения фенилаланина у новорожденных², этот метод становится все более распространенным. Первые сообщения о DBS для отбора проб и хранения белков были сделаны в начале 1970-х годов^3,4, а десятилетие спустя, в 1980-х годах^, мы нашли первый отчет о масс-спектрометрии (MS) для определения белков из DBS⁵. Несмотря на это раннее введение, только на рубеже веков определение белков РС из DBS и других методов микровыборки стало более распространенным.

В клиническом контексте представляет интерес определение белков в диагностике и последующем наблюдении за заболеваниями, а также для мониторинга лечения и допинговых целей. Это целенаправленное определение белковых аналитов с помощью РС из небольших количеств высушенных образцов по-прежнему является сложной задачей и часто требует обширной подготовки образцов перед анализом.

Целенаправленное количественное определение белков с помощью РС обычно выполняется с применением подхода «снизу вверх», расщепляя белки до пептидов перед анализом. Эта процедура производит множество пептидов, что затрудняет прямой анализ переваренного биологического образца. Способ обойти это заключается в применении этапа селективной очистки сродства перед анализом РС до или после разложения ^6,7,8. Таким образом, интересующий белок (или его протеотипический пептид, если стадия аффинного захвата выполняется после расщепления) селективно выделяют из матрицы образца перед анализом, обеспечивая более низкие пределы обнаружения⁹.

Микроотбор проб с использованием карт DBS имеет определенные преимущества по сравнению с обычными образцами крови, включая небольшой объем образца, менее инвазивный отбор проб и повышенную стабильность при хранении. Однако матрица образца отличается и может создавать другие проблемы при анализе (например, матрица высушенных и жидких образцов и капиллярная кровь по сравнению с сывороткой или плазмой)^10,11. Еще одной проблемой, которая наблюдается при использовании DBS, является так называемый гематокритный эффект, при котором гематокрит крови влияет на объем образца, дополнительно обрабатываемого для анализа, и, следовательно, вносит межиндивидуальную вариабельность в анализ¹². Новые микропробоотборники, такие как VAMS, представленные в 2014 году¹³, решают эту проблему, собирая фиксированный объем крови вместо капли крови.

Этот протокол описывает установку для анализа биомаркеров низкого содержания из высушенных микрообразцов. После элюирования высушенный образец расщепляют и, впоследствии, выделяют протеотипический пептид путем пептидного аффинного захвата. Модельным аналитом является биомаркер МРЛ ProGRP. Поскольку ProGRP не может быть надежно определен из цельной крови, в качестве матрицы образца использовали сыворотку. Показаны репрезентативные результаты как DSS, так и образцов сыворотки, собранных с использованием VAMS.

Протокол

Сыворотка от здоровых доноров крови использовалась для приготовления стандартных растворов. Использование сыворотки от здоровых доноров крови проводилось в строгом соответствии с норвежским законодательством. Информированное согласие было получено от всех субъектов. Образцы сыворотки были проанализированы с использованием методов в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами. Описанный протокол представляет собой модифицированную версию способа, описанного в предыдущей работе¹⁴. Обзор состава буферов и растворов и способов их приготовления можно найти в дополнительной таблице S1, в то время как таблица материалов содержит материалы, оборудование и реагенты, используемые в этом протоколе.

1. Приготовление магнитных шариков с покрытием антител

1. Рассчитайте количество антител, необходимое для приготовления нужного количества шариков. Используйте 1 мг антитела на 50 мг магнитных шариков.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, в последующих экспериментах на образец используют 20 мкл суспензии гранул 20 мг/мл (см. этап 5.1).
2. Рассчитайте объем антител, необходимый для приготовления нужного количества шариков.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Объем антител зависит от концентрации антител и должен быть рассчитан для каждого антитела.
3. Перенесите желаемый объем раствора антитела в микроцентрифужную пробирку объемом 5 мл с низким связыванием с белком. Например, если раствор антитела содержит 1 мг/мл антитела, используйте 0,4 мл для приготовления 1,0 мл суспензии шариков (20 мг шариков/мл с 1 мг антитела/50 мг шариков).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела должны находиться в буфере, не содержащем аминов. Используйте микроцентрифужные пробирки с низким связыванием белка для всех растворов, содержащих белки, чтобы избежать потери аналита из-за адсорбции.
4. Добавьте небольшой магнитный перемешивающий стержень к раствору антител и отрегулируйте рН до 2,5 при непрерывном перемешивании. Используйте рН-метр с микроэлектродом для измерения рН и отрегулируйте рН путем ступенчатого добавления определенных объемов 1,0 М HCl (начните с добавления 10 мкл порций 1,0 М HCl и уменьшайте объем по мере приближения рН к 2,5). Запишите общий объем 1,0 М HCl, необходимый для регулировки рН до 2,5.
5. Снимите микроэлектрод и инкубируйте подкисленное антитело на льду на магнитной мешалке в течение 1 часа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кислотная обработка антител проводится для обеспечения правильной ориентации антител на шарике. Концентрация HCl может быть снижена до 0,5 М или 0,2 М HCl, в зависимости от буферной концентрации в растворе антитела.
6. Нейтрализуйте раствор антител. Используйте рН-метр с микроэлектродом для измерения рН и отрегулируйте рН до 7 путем ступенчатого добавления определенных объемов 1,0 М NaOH (начните с порции 10 мкл и уменьшайте объем по мере приближения рН к 7). Запишите общий объем добавленного NaOH 1,0 М.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация NaOH должна быть такой же, как концентрация HCl, используемая на шаге 1.4. NaOH обладает высокой коррозионной активностью; Используйте средства защиты, включая перчатки и соответствующие средства защиты глаз.
7. Рассчитайте желаемый объем магнитных шариков, активируемых тозилом, которые будут использоваться.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, рекомендуется использовать гранулы 20 мг / мл при выполнении мелкомасштабного соединения. Следует использовать не менее 5 мг бусин.
8. Тщательно перемешайте суспензию магнитных шариков на вихревом смесителе и извлеките объем, содержащий желаемое количество суспензии шариков. Например, чтобы приготовить 1 мл суспензии шариков, извлеките объем, содержащий 20 мг шариков (667 мкл, если концентрация шариков составляет 30 мг / мл).
9. Поместите суспензию шарика на магнитную стойку на 1 минуту и удалите надосадочную жидкость. Вымойте шарики 2 раза равным объемом типа 1 H₂O (667 мкл, если для приготовления 1 мл гранул используется раствор шариков 30 мг / мл, покрытых антителами). Перемешивайте с помощью вихревого смесителя после каждого добавления промывочного раствора и поместите на магнитную решетку на 1 минуту перед удалением надосадочной жидкости.
10. Добавьте к магнитным шарикам следующее: обработанное кислотой антитело, 0,5 М боратный буфер (рН 9,5) (1/5 от общего объема, так как конечная концентрация должна составлять 0,1 М; это равно 0,2 мл для приготовления 1 мл шариковой суспензии) и связующий буфер для связывания антител (для приготовления 1 мл магнитных шариков, покрытых антителами, объем буфера связи должен быть равен 1 мл - объем обработанного кислотой антитела - 0,2 мл боратного буфера). Перемешайте с помощью вихревого миксера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем антитела, обработанного кислотой, равен объему раствора антитела (0,4 мл при приготовлении 1 мл суспензии шариков с использованием раствора антитела 1 мг / мл) + объем 1,0 М HCl, используемый для регулировки рН до 2,5 + объем 1,0 М NaOH, используемый для корректировки рН до 7).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Состав 0,5 М боратного буфера (рН 9,5) и связующего буфера для связывания антител можно найти в дополнительной таблице S1.
11. Вращайте при температуре окружающей среды в течение ночи с помощью сквозного смесителя образцов, желательно с взаимным вращением и вибрацией.
12. Центрифуга в течение 10 мин при 239 × г. Поместите трубку на магнит на 2 минуты и удалите надосадочную жидкость.
13. Промойте шарики 2 x 2 часа и один раз на ночь, вращая в буфере для хранения шариков антител при температуре окружающей среды с помощью смесителя для сквозных образцов. Используйте тот же объем, что и общий объем на шаге 1.10. Поместите трубку на магнит на 1 минуту и удаляйте надосадочную жидкость между каждой стиркой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Состав буфера для хранения шариков антител можно найти в дополнительной таблице S1.
14. Хранят в желаемом буфере (например, в том же буфере, что и на шаге 1.13), используя желаемую исходную концентрацию шариков (обычно 20 мг/мл). Хранить в холодильнике.

2. Приготовление 2 мл иммобилизованных шариков трипсина (20 мг / мл шариков)

1. Добавьте 20 мл 1 мМ HCl к 2 мл активированных NHS шариков агарозы, чтобы промыть шарики.
2. Смешать и центрифугировать при 2,655 × г в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость.
3. Добавьте 20 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,8). Смешайте с помощью вихревого смесителя и центрифуги при концентрации 2,655 × г в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Состав 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,8) можно найти в дополнительной таблице S1.
4. Добавьте 2 мл 20 мг / мл трипсина (растворенного в буфере холодной связи для связывания трипсина).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Состав буфера связи для соединения трипсина можно найти в дополнительной таблице S1. Храните буфер в холодильнике.
5. Инкубировать в течение 25 минут при 22 °C и 1 100 об/мин с помощью смесителя с регулируемой температурой. Центрифуга при 2,655 × г в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость.
6. Добавьте 2 мл модифицированного буфера для приготовления гранул трипсина и инкубируйте в течение 20 мин при 22 ° C и 1 100 об/мин с помощью смесителя с регулируемой температурой. Центрифуга при 2,655 × г в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Состав модификационного буфера для приготовления трипсиновых гранул можно найти в дополнительной таблице S1. Храните буфер в холодильнике.
7. Добавьте 10 мл блокирующего буфера для приготовления гранул трипсина и выдерживайте в течение 10 мин при 22 ° C и 1 100 об/мин с помощью смесителя с регулируемой температурой. Центрифуга при 2,655 × г в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Состав блокирующего буфера для приготовления гранул трипсина можно найти в дополнительной таблице S1. Храните буфер в холодильнике.
8. Добавьте 2 мл буфера для хранения, перемешайте с помощью вихревого миксера и храните в холодильнике до использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Состав буфера для хранения трипсина можно найти в дополнительной таблице S1. Храните буфер в холодильнике.

3. Отбор проб DSS/VAMS и последующая экстракция высушенной сыворотки

1. Подготовьте стандарты, введя в сыворотку ProGRP (или интересующий белок) на соответствующем уровне. Поддерживайте пиковый объем ≤ 1% от общего объема.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь для приготовления стандартов сыворотки с шипами использовали исходный раствор 295 мкг/мл ProGRP в воде.
2. Смешайте стандарты на вихревом миксере.
3. Нанесите 10 мкл сыворотки (стандарты с шипами) на карты DBS или дайте собрать 10 мкл сыворотки с помощью VAMS (10 мкл) в соответствии с рекомендациями производителя. Для DSS убедитесь, что пятно находится в пунктирном круге.
4. Дайте высохнуть на воздухе при температуре окружающей среды не менее 2 часов.
5. Вырежьте все пятно и перенесите его в микроцентрифугу объемом 2 мл с низким связыванием белка или извлеките VAMS из держателя и поместите его в пробирку с микроцентрифугой с низким связыванием белка объемом 2 мл.
6. Добавьте 1,000 мкл 100 мМ раствора бикарбоната аммония (ABC). Экстрагируйте высушенную сыворотку из пятна / VAMS в течение 1 ч при 22 ° C с помощью смесителя с регулируемой температурой при 1 000 об/мин.
7. Перенесите экстракт в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с низким связыванием белка для триптического протеолиза.

4. Переваривание экстрактов DSS/VAMS

1. Используйте 30 мкл гранул трипсина (как приготовлено в разделе 2) на образец. Перенесите объем, содержащий гранулы трипсина для всех образцов, в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с низким связыванием белка, центрифугу при 2,655 × г в течение 5 мин и удалите надосадочную жидкость.
2. Промойте гранулы трипсина 2 раза 1 мл холодного 50 мМ ABC, прежде чем ресуспендировать в том же объеме, который был вынут пипеткой. Центрифугу при 2,655 × г в течение 5 мин и удаляют надосадочную жидкость между этапами.
3. Добавьте 30 мкл промытых гранул трипсина в каждый экстракт DSS/VAMS, чтобы начать пищеварение.
4. Инкубировать в течение 2 ч при 37 °C и 1 000 об/мин с помощью смесителя с регулируемой температурой или аналогичного. Центрифугу при 2,655 × г в течение 5 мин и перенесите надосадочную жидкость (не шарики) в новую микроцентрифужную пробирку объемом 2,0 мл с низким связыванием белка.
5. Добавьте 25 мкл 14 нг/мл раствора внутреннего стандарта (IS), содержащего стабильный меченый изотопом (SIL) пептид ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_¹³C₆_¹⁵N₂] в раствор ABC 100 мМ.

5. Захват протеотипического пептида ProGRP с использованием магнитных шариков, покрытых антителами

1. Используйте 20 мкл шариков, покрытых антителами (20 мг / мл, как приготовлено в разделе 1) на экстракцию. Перенесите все шарики, покрытые антителами, в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с низким связыванием белка, поместите на магнит на 1 минуту и снимите буфер для хранения.
2. Промойте шарики, покрытые магнитными антителами, 1 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), pH 7,4, содержащего 0,05% полисорбата 20, и 2 x 1 мл PBS, прежде чем ресуспендировать в том же объеме, который был пипеткой. Перемешайте на вихревом смесителе и поместите на магнит на 1 минуту между буферными обменами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: PBS содержит 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 8 мМ Na 2 HPO 4 и 1,8 мМ KH₂PO₄. Рекомендуется готовить раствор в 10-кратной концентрации для повышения стабильности. Для состава 100 мл 10x PBS см. Дополнительную таблицу S1. Разбавление 10x PBS 10x позволит достичь pH ~ 7,4.
3. Добавьте 20 мкл промытой суспензии магнитных шариков в каждую микроцентрифужную пробирку с низким связыванием белка, содержащую расщепленный экстракт DSS/VAMS и IS. Иммунную экстракцию проводят в течение 1 ч с помощью смесителя сквозного образца при температуре окружающей среды.
4. Промывайте магнитные шарики следующими растворами: 500 мкл PBS с 0,05% (об. / об.) полисорбатом 20, 400 мкл PBS, 300 мкл 10 мМ Tris HCl (pH 7,4) и 300 мкл 100 мМ ABC.
   1. После добавления каждого промывочного раствора извлеките микроцентрифужную пробирку с шариками и моющим раствором с магнитной стойки и осторожно переверните до однородной массы. Затем поместите микроцентрифужную трубку с низким связыванием белка на магнит на 30 с, инвертируйте на 30 с и поместите на магнит на 1 минуту. Удалите моющий раствор.
   2. Открутите оставшуюся суспензию с помощью микроцентрифуги. Поместите на магнит на 1 минуту и удалите остатки моющего раствора.
5. Добавьте 15 мкл 2% (об./об.) муравьиной кислоты типа 1 H₂O к каждому образцу и инкубируйте в течение 5 мин при 22 ° C и 1000 об/мин с помощью смесителя с регулируемой температурой или аналогичного для разбавления захваченных пептидов. Поместите на магнит на 1 минуту и перенесите элюат в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с низким связыванием белка. Повторите один раз и перенесите второй элюат в ту же микроцентрифужную пробирку с низким связыванием белка, что и первый элюат.
6. Добавьте 20 мкл 100 мМ ABC к каждому элюату (общий объем 50 мкл).
7. Центрифуга (микроцентрифуга) и перенос 40 мкл элюата на микровкладыши для флаконов с высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ).

6. Анализ методом LC-MS/MS

1. Используйте тройной квадрупольный MS micro LC с ионизацией электрораспылением для обеспечения высокой надежности.
2. Подготовьте систему ЖХ-МС/МС к анализу, продув насосы подвижной фазой A (20 мМ FA в H 2 O и MeCN,95:5 об.) и B (20 мМ FA в H₂O и MeCN, 5:95 об/об).
3. Вставьте аналитическую колонку (C18, внутренний диаметр 50 мм x 1 мм [ID], частицы 3 мкм).
4. Продолжайте подготовку прибора к анализу, следуя процедурам запуска конкретного прибора.
5. В программном обеспечении прибора установите температуру колонной печи на 25 °C и расход на 50 мкл / мин (100% подвижная фаза A).
6. Уравновесьте колонку с подвижной фазой А в течение не менее 15 минут.
7. Поместите образцы в автоподатчик.
8. Подготовьте инструментальный метод для анализа ProGRP-специфического триптического пептида ALGNQQPSWDSEDSSNFK и его IS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые параметры метода зависят от прибора и должны быть оптимизированы для конкретного используемого прибора. Подробные сведения о параметрах метода, используемых здесь, описаны в шагах 6.9–6.11.
9. Для градиентной программы в LC используйте следующие настройки: скорость потока: 50 мкл/мин; от времени 0,0 до 3,0 мин: 100% подвижная фаза А; от времени 3,0 до 18,0 мин: запустить линейный градиент от 0% до 50% подвижной фазы B; от времени 18,0 до 18,1 мин: увеличить подвижную фазу B с 50% до 100%; от времени 18,1 до 20,0 мин: 100% подвижная фаза B; от времени 20,0 до 20,1 мин: уменьшить подвижную фазу B со 100% до 0%; от времени 20,1 до 30 мин: 100% подвижная фаза А для повторной балансировки колонны (используйте не менее 10 объемов колонки).
10. Для настроек MS/MS запустите MS/MS в положительном режиме, используя настройки прибора, обеспечивающие эффективную ионизацию. Чтобы следовать этому протоколу, используйте напряжение распыления +4,000 В, температуру нагретого капилляра 270 °C, азот в виде листового газа (5 произвольных единиц) и аргон (2 мТорр) для фрагментации диссоциации, вызванной столкновением (CID). Если прибор позволяет, направьте поток LC впустую первые 2 минуты (0-2 мин) и последний 1 мин (29-30 мин) пробега, а не в МС.
11. Используйте выбранные переходы мониторинга реакций (SRM) для (A) сигнатурного пептида (ALGNQQPSWDSEDSSNFK): 1,005.45→913.3, 1,005.45→1,028.3 и 1,005.45→1,398.5 и (B) пептида IS SIL (ALGNQQPSWDSDSSSNF[K_¹³C₆_¹⁵N₂]): 1,009.45→921.3, 1,009.45→1,036.3 и 1,009.45→1,406.5. Используйте оптимизированную энергию столкновения (35 В в этом протоколе) для всех контролируемых переходов.
12. Подготовьте последовательность, содержащую сэмплы, которые будут выполняться с помощью программного обеспечения, доступного для вашей системы LC-MS/MS. Установите объем впрыска на 10 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно добавьте пустые образцы и образцы контроля качества по мере необходимости.
13. Нажмите «Запустить последовательность» в программном обеспечении прибора, чтобы начать последовательность.
14. Мониторинг пиковой площади аффинно-захваченного, ProGRP-специфического, триптического пептида ALGNQQPSWDSEDSSNFK и его пептида IS SIL.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор и подтверждение сигнатурного пептида, ALGNQQPSWDSEDSSNFK, описано в другом месте¹⁴.

Результаты

Обзор аналитического рабочего процесса с использованием выборки DSS и VAMS показан на рисунке 1. За исключением различий в методе отбора проб, процедуры идентичны. Изображения сыворотки, отобранной с использованием двух методов отбора проб, можно увидеть на рисунке 2.

Обе формы отбора проб (VAMS и DSS) подходят для отбора проб сыворотки, содержащей ProGRP. Это видно на рисунке 3 , где показаны хроматограммы МС протеотипического пептида и пептида IS SIL из образцов DSS и VAMS. Кроме того, в состав МС включают хроматограмму после анализа контрольного образца, состоящего из 10 мкл образца жидкой сыворотки с шипами, обработанного таким же образом, как и высушенные образцы. Последний разбавляли в том же объеме, что и объем экстракционного раствора DSS/VAMS, подвергали разложению с помощью гранул трипсина и очищали с помощью пептидного аффинного захвата.

Сравнивая выборку VAMS и DSS (рис. 4), VAMS обеспечивает более высокое соотношение площади протеотипического пептида / IS, чем DSS. Это указывает на то, что может произойти потеря целевого белка ProGRP в бумаге, используемой для DSS (чистая целлюлоза). При сравнении с контрольным образцом, где сыворотка не высушивается перед дальнейшей обработкой и анализом (рис. 4), показано, что VAMS обеспечивает те же соотношения площадей, что и контрольный образец (двусторонний t-критерий, p≤ 0,65), что указывает на отсутствие потерь материала для отбора проб, в то время как DSS обеспечивает значительно более низкое соотношение площадей (двусторонний t-критерий, р≤ 0,005), указывая на потерю материала для отбора проб.

Краткая оценка была выполнена с использованием VAMS. Линейность была показана от 10 до 1000 нг / мл (R² = 0,9996) с пределом обнаружения (LOD, S / N = 3) 6,7 нг / мл. LOD считается удовлетворительным, так как анализ проводился на довольно старом тройном квадруполе (2008 г.) с идентификационной колонкой 1 мм. Повторяемость всех уровней с S/N > 10 также была признана удовлетворительной с RSD от 7% до 17% (n = 3) с использованием коррекции IS.

Аффинный захват может быть выполнен как до, так и после этапа пищеварения путем захвата интересующего белка или его протеотипического пептида. Текущая процедура описывает захват пептида по аффинности. Преимущество этого подхода по сравнению с захватом белка заключается в том, что захватывается только интересующий пептид, и достигается еще более эффективная очистка образца. Это проиллюстрировано на рисунке 5, показывающем более сложную хроматограмму полного сканирования с большим шумом после захвата белка по сравнению с захватом пептида. Образцы, проанализированные на рисунке 5 , не отбираются с использованием выборки DSS или VAMS; Однако сыворотка также является матрицей образца, и аффинный захват осуществляется с использованием того же антитела, которое используется для захвата пептидов в описанной процедуре.

Рисунок 1: Обзор аналитического рабочего процесса с использованием выборки DSS и VAMS. Сокращения: DSS = высохшая пятнистость сыворотки; VAMS = объемная поглощающая микровыборка; ЖХ-МС/МС = жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Изображения сыворотки, отобранные с использованием различных методов . (A) Целлюлозная карта DBS и (B) VAMS. Сокращения: DBS = засохшее пятно крови; VAMS = объемная поглощающая микровыборка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Репрезентативные хроматограммы МС протеотипического пептида и пептида IS SIL после отбора проб DSS и VAMS, а также для образца сыворотки с шипами, добавленного непосредственно в экстракционный раствор. Хроматограммы РС показывают 10 мкл образцов сыворотки, добавленных 1,5 мкг / мл ProGRP и нанесенных на (A) VAMS, (B) карту отбора проб целлюлозы (для DSS) или (C) непосредственно на экстракционный буфер (контрольный образец). Двадцать пять микролитров 14 нг / мл - это пептид SIL, добавленный ко всем образцам перед захватом пептида. Сокращения: DSS = высохшая пятнистость сыворотки; VAMS = объемная поглощающая микровыборка; МС = масс-спектрометрия; ProGRP = пептид, высвобождающий прогастрин; IS = внутренний стандарт; SIL = стабильный изотоп, меченный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Репрезентативные результаты соотношения площадей ALGNQQPSWDSDSSSNFK/IS для образцов сыворотки, с добавлением ProGRP и нанесением (10 мкл) на VAMS, DSS или непосредственно на экстракционный раствор (контрольный образец). Концентрация ProGRP составляет 1,5 мкг/мл, n = 4 для каждого состояния; 25 мкл 14 нг/мл пептида SIL добавляют ко всем образцам перед захватом пептида сродства. *указывает на то, что соотношение площадей значительно отличается от образцов, применяемых к VAMS (двусторонний t-критерий, p≤ 0,005). Стержни погрешностей ± стандартное отклонение. Сокращения: DSS = высохшая пятнистость сыворотки; VAMS = объемная поглощающая микровыборка; ProGRP = пептид, высвобождающий прогастрин; IS = внутренний стандарт; SIL = стабильный изотоп, меченный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Сравнение хроматограмм базового пика (полный анализ сканирования Orbitrap) после экстракции интактного белка (синий) и протеотипической экстракции эпитопного пептида (красный). Справа показаны экстрагированные ионные хроматограммы протеотипического эпитопного пептида (ALGNQQPSWDSEDSSNFK, m/z 1005.45). В качестве образца использовали сыворотку с 150 нг ^мл-1 ProGRP. Этот рисунок перепечатан из Levernæs et ^al.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительная таблица S1: Обзор состава буферов и растворов и способов их приготовления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Описанный протокол содержит информацию о том, как провести несколько важных этапов анализа биомаркеров низкого содержания из высушенных микрообразцов (DSS и VAMS), включая получение трипсиновых шариков и магнитных шариков, покрытых антителами. Основываясь на предыдущем опыте, мы всегда обрабатываем антитела кислотой перед иммобилизацией шариков, чтобы улучшить ориентацию антител¹⁵.

Одним из важнейших шагов в этой процедуре является выбор наиболее подходящего формата микродискретизации. Во-первых, необходимо учитывать, может ли рассматриваемый аналит быть определен из цельной крови, или концентрация зависит от клеток крови и должна быть определена в сыворотке или плазме (как для модельного аналита, ProGRP).

Подходы, основанные как на бумаге, так и на полимерах, имеют свои преимущества и ограничения; для ProGRP VAMS дает явное преимущество в отношении извлечения аналита после извлечения из пробоотборника. Однако это, вероятно, может быть оптимизировано с использованием другого решения для экстракции образцов DSS. Тем не менее, это потенциальное взаимодействие между анализируемым веществом и материалом для отбора проб важно учитывать, поскольку оно может привести к увеличению аналитических вариаций и более высоким пределам обнаружения. Поскольку используемая ИС представляет собой пептид SIL и впервые добавляется после разложения, IS корректирует этапы после разложения (например, аффинную экстракцию и анализ ЖХ-МС/МС). Коррекция ИС невозможна при экстракции из DSS/VAMS и стадии сбраживания.

В процедуре используются два типа шариков: гранулы трипсина для расщепления после извлечения образца сыворотки из пробоотборника и магнитные шарики, покрытые антителами, для захвата протеотипического пептида после сбраживания. Основной причиной использования трипсиновых шариков, помимо ускорения пищеварения, является минимизация остаточной активности трипсина в образце во время аффинного захвата. Это важно, чтобы избежать триптического протеолиза mAb во время аффинного захвата.

Агарозные шарики использовались для приготовления трипсиновых шариков, в то время как магнитные шарики использовались для получения шариков, покрытых антителами. Агарозные шарики дешевле, чем магнитные шарики, но имеют ограничение, заключающееся в том, что отделение шариков от раствора требует центрифугирования. Это делает разделение шариков и надосадочной жидкости менее эффективным, чем при использовании магнитных шариков. Кроме того, автоматизация рабочего процесса затруднена с помощью агарозных шариков. Тем не менее, магнитные шарики, активируемые NHS, доступны и могут использоваться для более упорядоченного и автоматизированного рабочего процесса подготовки образцов.

Микровыборка является важным направлением в биоанализе как лекарств, так и биомаркеров. Одной из проблем, связанных с нынешним подходом, является ограниченный объем пробы (10 мкл), который может иметь особое значение при определении аналитов с очень низким содержанием, таких как ProGRP (пг/мл - низкий уровень нг/мл). Однако эту проблему можно обойти с помощью современного аналитического оборудования. Для этих аналитов с низким содержанием содержится решающее значение выбор пробоподготовки, и чаще всего требуется селективная очистка образца путем захвата аффинности на основе антител. Поскольку было показано, что захват пептидов обеспечивает более чистые экстракты и более низкие пределы обнаружения, чем захват белка (с использованием того же антитела)¹⁴, настоящий метод фокусируется на этом подходе в сочетании с микроотбором проб. Еще одно преимущество подхода к захвату пептидов заключается в том, что пептид IS SIL также корректирует стадию аффинного захвата.

В этой работе антитело, нацеленное на белок, использовалось для захвата пептидов. Это является преимуществом, поскольку доступность готовых антител, нацеленных на белки, выше, чем готовых антител, нацеленных на протеотипические пептиды. Однако для того, чтобы антибелковое антитело эффективно захватывало протеотипический пептид, эпитоп должен быть неповрежденным после переваривания белка. Кроме того, для многих антител точный эпитоп неизвестен, что делает поиск антибелкового антитела утомительным. Это ограничивает количество доступных антибелковых антител, применимых для захвата пептидов. Описанная процедура продемонстрирована с использованием сыворотки в качестве матрицы и ProGRP в качестве целевого аналита. Предполагается, что процедура будет применима к другим матрицам и другим целевым аналитам. Вместо того, чтобы использовать коммерчески доступное антибелковое антитело для аффинного захвата протеотипического пептида, можно также использовать изготовленные на заказ антипептидные антитела. Эффективность очистки захвата пептидов по сравнению с захватом белка проиллюстрирована на рисунке 5. Заменяя агарозные шарики, используемые для приготовления трипсиновых шариков, магнитными шариками, процедура также должна быть совместима с роботизированными рабочими станциями пробоподготовки, представленными на рынке.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
N-гидроксисукцинимид эфира уксусной кислоты	Carbosynt (Staad, Швейцария	)FA33719	хранить в морозильной камере при температуре ниже -20°С; C
ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6 _15N2] (≥ 95%)	Innovagen (Lund, Швеция)	Не применимо	Хранить в морозильной камере при температуре ниже -20 °°; C
Бикарбонат аммония BioUltra (≥ 99,5% )	Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США)	09830-500G
Aquasil C18 колонка, 3 & микро; m, 50 мм x 1 мм	Thermo scientific (Waltham, MA, США)	77503-051030	Аналитическая колонка, совместимая со 100% водной подвижной фазой
Benzamidine (≥ 95.0%) Sigma	Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США)	12072	Хранить в холодильнике при температуре 2-6 градусов; C
Дигидрат хлорида кальция  (≥ 99% )	Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США)	223506-500G
Centrifuge 5804	Eppendorf (Hamburg, Tyskland)	5804000010
Клонированная изоформа ProGRP 1	Radium hospital, Университетская больница Осло (Осло, Норвегия)	Не применимо	Хранить в морозильной камере при температуре ниже -20 °°; C
Динатрия гидрогенфосфата дигидрат (про анализ)	Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США)	30435-500G
Додекагидрат гидрогенфосфата натрия (про анализ)	Merck (Darmstadt, Tyskland)	1.06579.0500
Dynabeads M-280 тозилактивированный 10 мл	Invitrogen (Карлсбад, США)	14204	Хранить в холодильнике при 2-6 °°; C
DynaMag-2	Invitrogen (Carlsbad, США)	123-21D Этаноламин
(pro анализ, ≥ 99%)	Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США)	#02400
Муравьиная кислота (≥ 99% ) для LC-MS	VWR International (Radnor, PA, США)	84865.260
FTA DMPK-C целлюлозная карта	Whatman (Кент, Великобритания)	WB129243	DBS карта
Флаконы с ВЭЖХ, прозрачное стекло, 1,5 мл, 32 x 11,6 мм, Clean Pack	Nerliens Meszansky (Oslo, Norge)	LPP 11 09 0519
Hulamixer Смеситель образцов	Invitrogen (Carlsbad, США)	101561503016	Смеситель образцов с перемешиванием из конца в конец и возвратным вращением и вибрацией
Сыворотка крови человека от здоровых доноров крови	Bloodbank, Ullevå l, Университетская больница Осло (Осло, Норвегия)	Не применимо	Хранить в морозильной камере при температуре ниже -20 °°С;
C Дымление соляной кислотой 37% (Emsure for analysis)	Merck (Darmstadt, Tyskland)	1.00317.1000
LC-MS/MS система: Система Ultimate 3000 (автоподатчик, WPS-3000TRS; Микронасос, СУГ-3400М; Flow manager, FLM-3300, MIC, 1X2P-10P) и доступ TSQ Quantum. Управляется Xcalibur 2.2 SP1.48	Thermo scientific (Уолтем, Массачусетс, США)	Не применимо
LiChrosolv Ацетонитрил гиперград для LC-MS	Merck (Дармштадт, Tyskland)	1.00029.2500
LL Биотрод, комбинированный стеклянный электрод	Metrohm (Херизау, Свейтс)	6.0224.100
Магнитная мешалка, тип M10	Franz Morat KG (Айзенбах, Германия)	10236
Микровставки, стекло (31 x 6 мм, 0,1 мл)	VWR International (Radnor, PA, США)	548-0006
MilliQ integral 3 с Q-POD	Merck Millipore (Molsheim, France)	ZRXQ003T0	Для производства водного
моноклонального антитела типа 1 M18	Radium hospital, Университетская больница Осло (Осло, Норвегия)	Не применимо	Хранить в холодильнике при температуре 2-6 градусов; C
Neoteryx Mitra микропробоотборник (10 μ L) 4 образца Clamshell	Fisher Scientific (Waltham, MA, США	)NC1382947
NHS-активированные сефарозные бусины 4 fast flow	Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США)	GE17-0906-01	Агарозные бусины, хранить в холодильнике при температуре 2-6 градусов; C
Optifit, Наконечники для пипеток, 10 мл	Sartorius Biohit (Хельсинки, Финляндия)	613-2911
Optifit, Наконечники для пипеток, 10 μ L	Sartorius Biohit (Хельсинки, Финляндия)	790012
Optifit, наконечники для пипеток, 1 000 μ L	Sartorius Biohit (Хельсинки, Финляндия)	791002
Optifit, наконечники для пипеток, 200 μ L	Sartorius Biohit (Хельсинки, Финляндия)	790202
pH-стеклянный электрод	Metrohm (Херизау, Свейц)	6.0233.100
pH-метр 744	Metrohm (Херизау, Свейц)	8.744.1003
Пипетка 10 мл	Sartorius Biohit (Хельсинки, Финляндия)	725090
Пипетка m10 &микро; Л	Sartorius Biohit (Хельсинки, Финляндия)	725020
Pipet m100 µ L	Sartorius Biohit (Хельсинки, Финляндия)	725050
Pipet m1,000 µ L	Sartorius Biohit (Хельсинки, Финляндия)	725070
Пипетка m20 &микро; L	Sartorius Biohit (Хельсинки, Финляндия)	725030
Хлорид калия (KCl ≥ 99,9%)	Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США)	P-3911
Дигидрогенфосфат калия (про анализ)	Merck (Дармштадт, Тискланд)	1.04873.0250
Protein LoBind Eppendorf tube 0.5 мл	Eppendorf (Гамбург, Tyskland)	525-0133 (0030 108.094)
Protein LoBind Eppendorf tube 1,5 мл	Eppendorf (Hamburg, Tyskland)	525-0132 (0030 108.116)
Protein LoBind Eppendorf tube 2,0 мл	Eppendorf (Hamburg, Tyskland)	525-0134 (0030 108.450)
Protein LoBind Eppendorf tube 5,0 мл	Eppendorf (Hamburg, Tyskland)	525-0792 (0030108.302)
Ножницы	Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США)	Z186716-1EA
Азид натрия (BioUltra; ≥ 99,5%)	Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США)	71289-5G
Хлорид натрия (для анализа)	Merck (Дармштадт, Тискланд)	1.06404.1000
Моногидрат дигидрогенфосфата натрия (про анализ)	Merck (Дармштадт, Тискленд)	1.06346.0500
Гидроксид натрия (AnalaR NORMAPUR)	VWR International (Раднор, Пенсильвания, США)	28244.295
Декагидрат тетрабората натрия (≥ 99. %)	Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США)	S9640-500G
Мини-центрифуга Spectrafuge	LABNET International (Эдисон, Нью-Джерси, США)	C1301
Магнит-мешалка, 25 мм x 6 мм Ø, круглый	Leybold (Кельн, Германия)	666  851
Стюарт  Вихревой смеситель Scientific SA8	Stuart (Стаффордшир, Великобритания)	Z648531-1EA
Центрифужные пробирки SuperClear (15 мл)	VWR International (Раднор, Пенсильвания, США)	525-0150
Центрифужные пробирки SuperClear (50 мл)	VWR International (Раднор, Пенсильвания, США)	525-0155
Термомиксер comfort 1,5 мл	Eppendorf (Гамбург, Tyskland)	53,55,27,831	Терморегулируемый миксер
Основание тризмы (марка реагента, ≥ 99.0 %)	Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США)	T6066	Трис(гидроксиметил)аминометан (трис)
Trizma HCl (реагентный класс, ≥ 99,0%)	Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США)	T3253-100G	Tris(гидроксиметил)аминометан HCl (tris HCl)
Трипсин (обработанный TCPK из поджелудочной железы крупного рогатого скота, 10 000-15 000 единиц BAEE/мг белка)	Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США)	T8802	Хранить в морозильной камере при температуре ниже -20 °°; C
Tween 20	Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США)	P7949-500ML	полисорбат 20
Пинцет	Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США)	TEM-78511-27
Колпачки флаконов, белые, 9 мм	Nerliens Meszansky (Осло, Норвегия)	LPP 09 15 0981
Микропробоотборник Mitra с технологией VAMS (Объемная адсорбционная микровыборка), 10 &; L, 4-сэмплер раскладушка	Neoteryx (Торранс, Калифорния, США)