Методическая статья

Скрининговый анализ с высоким содержанием для идентификации антителозависимых соединений, модифицирующих клеточную цитотоксичность

DOI:

10.3791/64485

⸱

18 августа 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Chemistry, Faculty of Medicine, University of Debrecen, 2Doctoral School of Molecular Medicine, University of Debrecen, 3National Academy of Scientist Education, University of Debrecen, 4ELKH-DE Cell Biology and Signaling Research Group

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол представляет собой автоматизированный высокопроизводительный метод на основе изображений для идентификации соединений, модулирующих естественное уничтожение клеток рака молочной железы, опосредованное естественными клетками-киллерами, в присутствии терапевтического антитела против HER-2.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Иммунотерапия антиген-специфическими антителами или ингибиторами иммунных контрольных точек произвела революцию в терапии рака молочной железы. Клетки рака молочной железы, экспрессирующие рецептор эпидермального фактора роста HER2, могут быть нацелены на антитело против HER-2 трастузумаб. Антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) является важным механизмом, участвующим в противоопухолевом действии HER-2. Трастузумаб, связанный с раковыми клетками, может быть распознан Fc-рецепторами эффекторных клеток ADCC (например, естественных клеток-киллеров (NK), макрофагов и гранулоцитов), запуская цитотоксическую активность этих иммунных клеток, приводящую к гибели раковых клеток. Мы решили разработать анализ на основе изображений для количественного определения ADCC для идентификации новых соединений модулятора ADCC с помощью скрининга с высоким содержанием. В анализе сверхэкспрессирующие клетки рака молочной железы HER2 JIMT-1 культивируются совместно с клетками NK-92 в присутствии трастузумаба, а гибель клеток-мишеней количественно определяется с помощью автоматической микроскопии и количественного анализа изображений. Клетки-мишени отличаются от эффекторных клеток на основе их флуоресценции EGFP. Мы показываем, как библиотеки соединений могут быть протестированы в анализе для идентификации препаратов-модуляторов ADCC. Для этой цели была установлена тестовая пластина для библиотеки соединений с использованием случайно выбранных тонких химикатов с лабораторной полки. В библиотеку тестов также были включены три дестабилизирующих соединения микротрубочек (колхицин, винкристин, подофиллотоксин), которые, как ожидается, будут препятствовать миграции и дегрануляции NK-клеток. Тестовый экран идентифицировал все три положительных контрольных соединения как попадания, доказывающие пригодность метода для идентификации ADCC-модифицирующих лекарств в химической библиотеке. С помощью этого анализа можно проводить скрининг библиотеки соединений для идентификации соединений, усиливающих ADCC, которые могут быть использованы в качестве адъювантных терапевтических агентов для лечения пациентов, получающих противоопухолевую иммунотерапию. Кроме того, метод также может быть использован для выявления любых нежелательных побочных эффектов, ингибирующих ADCC терапевтических препаратов, принимаемых онкологическими больными по различным показаниям.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Иммунотерапия противоопухолевыми антителами, ингибиторами иммунных контрольных точек или Т-клетками, экспрессирующими химерные антигенные рецепторы (CAR-T), представляет собой мощный подход к лечению рака 1,2,3. Трастузумаб представляет собой гуманизированное моноклональное антитело против HER-2 (рецептор 2 эпидермального фактора роста человека), используемое для лечения HER-2-положительного рака молочной железы на ранней стадии или метастатического рака молочной железы, а также HER-2-положительного метастатического рака желудка 4,5,6. Он в первую очередь действует путем ингибирования стимулирующего пролиферацию эффекта эпидермального фактора роста4. Однако сообщалось, что трастузумаб эффективно вызывает гибель раковых клеток, даже если раковые клетки утратили свою реакцию на стимуляцию HER-27. Этот парадоксальный эффект антитела обусловлен антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (ADCC)7. ADCC может быть опосредован естественными клетками-киллерами (NK), гранулоцитами и макрофагами, известными как эффекторные клетки ADCC 8,9. Если антитело, такое как трастузумаб, связывается с опухолевыми клетками, то эти эффекторные клетки используют свои Fc-рецепторы для связывания постоянной (Fc) области антитела. Антитело соединяет опухолевые клетки и эффекторные клетки, несущие Fc-рецептор, вызывая высвобождение их цитотоксических медиаторов10. Естественные клетки-киллеры высвобождают цитотоксический груз своих гранул, содержащих перфорин, для создания пор в клеточной мембране-мишени и гранзима (запускающего сигнальные пути гибели клеток) в иммунный синапс, что приводит к апоптозу раковых клеток (см. рис. 1).

figure-introduction-1
Рисунок 1: Взаимодействие эффекторных и целевых клеток в ADCC. Рецептор Fcγ на клеточной поверхности эффекторной NK-клетки распознает Fc-область антитела к HER2 трастузумабу, специфичную для молекулы HER2, экспрессируемой на поверхности опухолевой клетки. Таким образом, между двумя клетками устанавливается так называемый иммунологический синапс, индуцирующий направленный экзоцитоз цитотоксических гранул эффекторной клетки. Высвобожденные молекулы перфорина и гранзима в конечном итоге приводят к апоптозу клетки-мишени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Ранее было разработано несколько анализов для количественной оценки цитотоксичности, включая ADCC. Золотым стандартом является метод высвобождения радиоактивного хрома, при котором клетки-мишени помечаются радиоактивным изотопом 51Cr, а ADCC количественно определяется путем измерения радиоактивности надосадочной жидкости лизированных клеток-мишеней11. Из-за очевидных проблем, связанных со строго регулируемым обращением, хранением и утилизацией радиоактивных фармаконов и отходов, этот метод становится все более непопулярным среди ученых-биологов. Кроме того, он также не поддается приложениям с высокой пропускной способностью. Измерение активности ферментов (например, лактатдегидрогеназы), высвобождаемых из убитых клеток-мишеней, может обеспечить нерадиоактивную альтернативу анализу 51Cr12. Эти анализы, однако, не могут различить гибель клеток-мишеней и эффекторных клеток. Электрическое измерение импеданса ячейки и подложки (ECIS) оказалось пригодным для количественной оценки ADCC13, но оборудование ECIS недоступно в большинстве лабораторий, и этот метод несовместим с высокопроизводительными приложениями / скринингом. Флуоресцентно меченные клетки представляют собой популярную альтернативу во многих анализах клеточной биологии и часто используются в проточной цитометрии или приложениях на основе считывателей планшетов14,15,16. Однако эти анализы часто содержат этапы промывки или иным образом несовместимы с высокопроизводительными приложениями (например, методами, основанными на проточной цитометрии). Некоторые популярные анализы цитотоксичности, которые теоретически должны подходить для количественного определения ADCC, не могут надежно определить эффективность ADCC13. В последнее время, с распространением флуоресцентной конфокальной микроскопии, анализы с высоким содержанием изображений становятся все более популярными в различных областях наук о жизни17. С одной стороны, оборудование для визуализации клеток в настоящее время довольно распространено, а с другой стороны, из полученных изображений можно собрать практически бесконечные морфологические параметры. Поэтому мы решили разработать анализ ADCC, совместимый с скринингом с высоким содержанием, и продемонстрировать его пригодность для скрининга составных библиотек.

Здесь мы представляем анализ ADCC на основе изображений и демонстрируем, как этот анализ можно использовать для скрининга с высоким содержанием (HCS) для идентификации соединений, модулирующих ADCC. Модель основана на клетках-мишенях карциномы молочной железы JIMT-1, эффекторных клетках CD16.176V.NK-92 и гуманизированном моноклональном антителе против HER2 трастузумабе. С помощью этого метода можно идентифицировать препараты, которые могут усиливать убивающее опухоль действие NK-клеток, или получить представление о механизме NK-клеточно-опосредованного ADCC путем идентификации малых молекул, интерферирующих ADCC. Мы предполагаем, что ученые-биологи, стремящиеся количественно оценить клеточно-опосредованную цитотоксичность с особым вниманием к ADCC, могут извлечь выгоду из использования этого анализа либо для науки, либо для разработки лекарств. Этот анализ может быть альтернативой, если лаборатория имеет доступ и некоторый опыт в флуоресцентной визуализации и количественном анализе изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Ключевые этапы рабочего процесса анализа представлены на рисунке 2.

figure-protocol-1
Рисунок 2: Рабочий процесс экрана ADCC. Клетки-мишени JIMT-1-EGFP, посеянные в 96 луночных планшетов HCS, обрабатывают препаратами из библиотеки соединений. В свою очередь, добавляют неокрашенные NK-(эффекторные) клетки и трастузумаб, и планшет визуализируют в 0-й момент времени и через 3 ч инкубации. Оценка ADCC основана на изменении количества жизнеспособных (поверхностно прикрепленных) клеток-мишеней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

1. Покрытие пластины HCS

  1. Покройте 96 луночных скрининговых планшетов с высоким содержанием (HSC) средой JIMT-1 50 мкл / лунка (среда DMEM/F-12 с добавлением 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 0,3 ЕД/мл инсулина (100 МЕ/мл, Humulin R и 1% пенициллин-стрептомицин).
  2. Поместите тарелку в инкубатор CO2 на 1 час.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытие имеет решающее значение для крепления ячеек JIMT-1 к стеклянной поверхности пластины.

2. Посев клеток JIMT-1 с улучшенным зеленым флуоресцентным белком (EGFP)

ПРИМЕЧАНИЕ: EGFP-экспрессирующие клетки JIMT-1 были получены в нашей предыдущей работе18, и клетки культивировали в колбах для культивирования тканей T25 в среде JIMT-1 (см. композицию на шаге 1.1).

  1. Промойте клетки 2 мл стерильного PBS.
  2. Добавьте 1 мл трипсина-ЭДТА в колбу и поместите колбу обратно в инкубатор CO2 на 10 минут.
  3. После инкубации коснитесь колбы, чтобы проверить, отсоединились ли клетки JIMT-1.
  4. Остановите пищеварение с помощью 2 мл среды JIMT-1 и соберите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл.
  5. Подсчитайте клетки с 0,4% трипанового синего (80 мкл красителя + 20 мкл клеточной суспензии) в камере Bürker и отрегулируйте количество клеток до 133 000 клеток / мл.
  6. Аспирируйте среду покрытия из 96-луночной пластины (шаг 1.2).
  7. Пипетка 75 мкл клеточной суспензии в каждую лунку планшетов HCS (см. Таблицу материалов).
  8. Дайте клеткам прикрепиться во время ночной инкубации при 37 ° C в инкубаторе CO2 .

3. Предварительная обработка клеток JIMT-1 EGFP с помощью библиотеки соединений

  1. Аспирируйте среду из ячеек JIMT-1 и добавьте в лунки 50 мкл / лунку свежей среды JIMT-1. Передайте пластину в высокопроизводительную лабораторию скрининга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование робота для работы с жидкостями делает добавление составных библиотек более эффективным и воспроизводимым.
  2. Перенесите испытуемые соединения с библиотечной пластины на аналитическую пластину с помощью штифтового инструмента, откалиброванного до объема 25 нл. Выполните это четыре раза. Четыре раунда переноса дают конечный объем 100 нл (и конечную концентрацию 20 мкМ).
  3. Между каждым этапом промывайте штифтовый инструмент сначала 50% ДМСО, а затем 70% этанолом.
  4. Инкубируйте планшеты в течение 1 ч в инкубаторе CO2 при 37 °C.

4. Запуск анализа ADCC путем добавления эффекторных ячеек

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки CD16.176V.NK92 (далее именуемые клетками NK92) культивировали в α-MEM с добавлением 20% FBS, 1% MEM-NEAA, 1% Na-пирувата, 1% глутамина, 1% пенициллина-стрептомицина и 100 МЕ/мл IL-2.

  1. Подсчитайте клетки NK92 трипановым синим (80 мкл красителя + 20 мкл клеточной суспензии). Отрегулируйте количество клеток до 400 000 клеток / мл.
  2. Центрифугу 4 мл клеточной суспензии в дозе 150 х г в течение 3 мин при комнатной температуре.
  3. Подготовьте среду ADCC, добавив 20 мкг/мл антитела против HER2 (трастузумаб) в среду JIMT-1.
  4. Ресуспендируют гранулу NK-клеток в среде ADCC объемом 5 мл.
  5. Пипетка 20 000 NK-клеток в 50 мкл среды ADCC к целевым клеткам JIMT-1. Конечный объем составляет 100 мкл, а конечная концентрация трастузумаба составляет 10 мкг/мл.
  6. Поместите пробирную пластину в оборудование для анализа с высоким содержанием со встроенным инкубатором, настроенным на 37 °C.

5. Визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Планшеты следует визуализировать в два момента времени: во-первых, сразу после добавления эффекторных клеток к клеткам-мишеням, а во-вторых, через 3 часа после добавления NK-клеток. Для визуализации можно использовать анализатор высокого содержания и его программное обеспечение или подходящие альтернативы (см. Таблицу материалов).

  1. Выберите Тип пластины (96-луночный носитель ячейки Ultra) из списка планшетов.
  2. Выберите автофокус с двумя пиками, если анализ проводится в пластинах.
  3. Используйте 10-кратный объектив в неконфокальном режиме.
  4. Выберите Binning 2, чтобы удвоить соотношение сигнал/шум.
  5. Сделайте снимки светлого поля с длиной волны 650-760 нм и флуоресцентные изображения клеток JIMT-1, трансдуцированных с помощью EGFP, на длинах волн 488 нм (возбуждение) и 500-550 нм (излучение).
  6. Выберите количество полей и временных точек для изображения.

6. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа эффективности ADCC подсчитываются жизнеспособные клетки JIMT-1. Клетки-мишени, убитые ADCC, отделяются от поверхности и удаляются от фокальной плоскости микроскопа. Следовательно, разница между числом жизнеспособных клеток в начале и в конце реакции ADCC соответствует клеткам-мишеням, элиминированным ADCC. Чтобы показать, как построить последовательность оценки, на видео показана контрольная скважина ADCC.

  1. Используйте модуль «Поиск ячеек» для обнаружения областей на изображении, соответствующих ячейкам.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая ячейка определяется как область на изображении с более высокой интенсивностью флуоресценции, чем ее окружение.
  2. Выбирайте ячейки с помощью встроенного алгоритма M диаметром не менее 80 мкм.
  3. Установите для параметра Чувствительность расщепления, при которой большой объект разбивается на более мелкие, значение 0,5.
  4. Установите для параметра Общий порог (самый низкий уровень интенсивности пикселей) значение 0.
  5. Исключить обнаружение фоновой области с высокой интенсивностью флуоресценции EGFP можно в два этапа.
    1. Во-первых, используйте функцию « Вычислить свойства интенсивности », чтобы определить интенсивность флуоресценции EGFP в ранее выбранной области «Клетки ».
    2. Установите минимальный и максимальный порог интенсивности с помощью параметра «Выбрать население ».

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы продемонстрировать, как анализ работает в реальной жизни, мы создали тестовую библиотеку из 16 соединений, выбранных случайным образом с лабораторных полок (рис. 3). Кроме того, ДМСО также был включен в качестве отрицательного контроля и три соединения-ингибитора полимеризации микротрубочек (колхицин, винкристин и подофиллотоксин) в качестве положительного контроля. Ожидалось, что последние будут ингибировать ADCC, препятствуя миграции NK-клеток в раковые клетки и дегрануляции NK-клето...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Реакция ADCC была описана относительно давно. Также были описаны ключевые молекулярные события процесса19. Методы измерения ADCC варьируются от золотого стандарта анализа высвобождения радиоактивного хрома, анализов высвобождения цитоплазматических ферментов до нескольких проточных цитометрий на основе флуоресценции или микропланшетных анализов20. Однако общим ограничением этих анализов является то, что они не подходят для приложений с высокой пропускной способностью. Ранее...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LV получила финансирование от грантов Национального управления исследований, разработок и инноваций GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS», GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE и OTKA K132193, K147482. Клетки CD16.176V.NK-92 были получены от доктора Керри С. Кэмпбелла (Fox Chase Center, Philapedlphia, PA, от имени Brink Biologics, lnc. Сан-Диего, Калифорния), защищены патентами по всему миру и были лицензированы Nantkwest, lnc. Авторы благодарят Дьёрдя Вереба и Арпада Сёёра за помощь в использовании клеточной линии NK-92 и за технические консультации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
5-фторурацилApplichemA7686в библиотеке соединений
96-луночный Cell Carrier Ultra platePerkinElmerLLC 6055302
BetulinSigmaB9757в библиотеке
соединений CD16.176V.NK92 cellsNankwest Inc. 
ЦеруленинChemCruzsc-396822в библиотеке соединений
ЦисплатинSanta Cruz Biotechnologysc-200896в библиотеке
КолхицинSigmaC9754в библиотеке
соединений Concanavalin-ACalbiochem234567в библиотеке
соединений ДексаметазонSigmaD4902в библиотека соединений
DMEM/F-12 средаSigmaD8437в среде JIMT-1 EGFP среда
DMSOD2650в библиотеке
соединений ЭтопозидSigmaE1383E1383 Фетальная
бычья сыворотка (FBS)BioseraFB-1090/500JIMT-1 EGFP и NK среда
FisetinSigmaF4043в библиотеке соединений
Робот для работы с жидкостями Freedom EVOTECAN
GallotanninFluka Chemical Corp.16201в составной библиотеке
GlutamineGibco35,050– 061в NK medium
Harmony software PerkinElmer
Гуманизированное моноклональное антитело к HER2 (Herzuma)EGIS Pharmaceuticals, Будапешт, ВенгрияN/A
Humulin R (инсулин)Eli LillyHI0219JIMT-1 EGFP medium
IL-2Novartis Hungá ria Kft.PHC0026в среде NK
IsatinSigma114618в библиотеке соединений
MEM Non-Mino Amino Acids (MEM-NEAA)Gibco11,140– 050в среде NK
Na-пируватLonzaBE13-115Eв среде NK
NaringeninSigmaN5893в библиотеке
соединений NQDI-1SigmaSML0185в библиотеке
соединений Opera Phenix оборудование для анализа высокого содержанияPerkinElmer
Penicillin– стрептомицинBioseraLM-A4118JIMT-1 EGFP и NK-среда
пентоксифиллинSigmaP1784в библиотеке соединений
Фосфатный буферизованный физиологический раствор (PBS)LonzaBE17-517Qдля промывания клеток
ПодофиллотоксинSigmaP4405в библиотеке соединений
КверцетинSigmaQ4951в библиотеке соединений
Дубильная кислотаSigmaT8406в библиотеке соединений
ТемозоломидSigmaT2577в библиотеке соединений
Трипановый синий 0,4% растворSigmaT8154для подсчета клеток
ВинкристинсульфатSigmaV0400000в библиотеке соединений
α-MEMSigmaM8042в среде NK
соединений

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gupta, S. L., Basu, S., Soni, V., Jaiswal, R. K. Immunotherapy: an alternative promising therapeutic approach against cancers. Molecular Biology Reports. 49 (10), 9903-9913 (2022).
  2. Moretti, A., et al. The past, present, and future of non-viral CAR T cells. Frontiers in Immunology. 13, 867013(2022).
  3. June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
  4. Ross, J. S., et al. The HER-2 receptor and breast cancer: ten years of targeted anti-HER-2 therapy and personalized medicine. Oncologist. 14 (4), 320-368 (2009).
  5. Shitara, K., et al. Discovery and development of trastuzumab deruxtecan and safety management for patients with HER2-positive gastric cancer. Gastric Cancer. 24 (4), 780-789 (2021).
  6. Gianni, L., et al. Efficacy and safety of neoadjuvant pertuzumab and trastuzumab in women with locally advanced, inflammatory, or early HER2-positive breast cancer (NeoSphere): a randomised multicentre, open-label, phase 2 trial. Lancet Oncology. 13 (1), 25-32 (2012).
  7. Barok, M., et al. Trastuzumab causes antibody-dependent cellular cytotoxicity-mediated growth inhibition of submacroscopic JIMT-1 breast cancer xenografts despite intrinsic drug resistance. Molecular and Cancer Therapy. 6 (7), 2065-2072 (2007).
  8. Gauthier, M., Laroye, C., Bensoussan, D., Boura, C., Decot, V. Natural Killer cells and monoclonal antibodies: Two partners for successful antibody dependent cytotoxicity against tumor cells. Crit Rev Oncol Hematol. 160, 103261(2021).
  9. Gruijs, M., Sewnath, C. A. N., van Egmond, M. Therapeutic exploitation of neutrophils to fight cancer. Semin Immunol. 57, 101581(2021).
  10. Mando, P., Rivero, S. G., Rizzo, M. M., Pinkasz, M., Levy, E. M. Targeting ADCC: A different approach to HER2 breast cancer in the immunotherapy era. Breast. 60, 15-25 (2021).
  11. van der Haar Avila, I., Marmol, P., Kiessling, R., Pico de Coana, Y. Evaluating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by chromium release assay. Methods in Molecular Biology. 1913, 167-179 (2019).
  12. Broussas, M., Broyer, L., Goetsch, L. Evaluation of antibody-dependent cell cytotoxicity using lactate dehydrogenase (LDH) measurement. Methods in Molecular Biology. 988, 305-317 (2013).
  13. Toth, G., Szollosi, J., Vereb, G. Quantitating ADCC against adherent cells: Impedance-based detection is superior to release, membrane permeability, or caspase activation assays in resolving antibody dose response. Cytometry A. 91 (10), 1021-1029 (2017).
  14. Chung, S., Nguyen, V., Lin, Y. L., Kamen, L., Song, A. Thaw-and-use target cells pre-labeled with calcein AM for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 447, 37-46 (2017).
  15. Lee-MacAry, A. E., et al. Development of a novel flow cytometric cell-mediated cytotoxicity assay using the fluorophores PKH-26 and TO-PRO-3 iodide. Journal of Immunological Methods. 252 (1-2), 83-92 (2001).
  16. Tanito, K., et al. Comparative evaluation of natural killer cell-mediated cell killing assay based on the leakage of an endogenous enzyme or a pre-loaded fluorophore. Analytical Science. 37 (11), 1571-1575 (2021).
  17. Lin, S., Schorpp, K., Rothenaigner, I., Hadian, K. Image-based high-content screening in drug discovery. Drug Discovery Today. 25 (8), 1348-1361 (2020).
  18. Guti, E., et al. The multitargeted receptor tyrosine kinase inhibitor sunitinib induces resistance of HER2 positive breast cancer cells to trastuzumab-mediated ADCC. Cancer Immunology, Immunotherapy. 71 (9), 2151-2168 (2022).
  19. Li, F., Liu, S. Focusing on NK cells and ADCC: A promising immunotherapy approach in targeted therapy for HER2-positive breast cancer. Frontiers in Immunology. 13, 1083462(2022).
  20. Perussia, B., Loza, M. J. Assays for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and reverse ADCC (redirected cytotoxicity) in human natural killer cells. Methods in Molecular Biology. 121, 179-192 (2000).
  21. Garcia-Alonso, S., Ocana, A., Pandiella, A. Trastuzumab emtansine: Mechanisms of action and resistance, clinical progress, and beyond. Trends in Cancer. 6 (2), 130-146 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

NKHER2ADCC

Похожие статьи