Методическая статья

Метод выделения долговременных и краткосрочных гемопоэтических стволовых клеток

DOI:

10.3791/64488

⸱

19 мая 2023 г.

 ,  ,  ,  , 
1Hematopoietic Stem Cell Biology and Medical Innovation (HSCBMI), Department of Pediatrics, Kobe University Graduate School of Medicine, 2RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представлен пошаговый протокол выделения долгосрочных гемопоэтических стволовых клеток (ЛТ-ГСК) и кратковременных ГСК (СТ-ГСК) с использованием репортерной системы Hoxb5.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Способность к самообновлению и потенциал многолинейной дифференцировки обычно рассматриваются как определяющие характеристики гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Однако многочисленные исследования показали, что функциональная гетерогенность существует в компартменте ГСК. Недавние одноклеточные анализы сообщили о клонах ГСК с различными судьбами клеток в компартменте ГСК, которые называются смещенными клонами ГСК. Механизмы, лежащие в основе гетерогенных или плохо воспроизводимых результатов, мало изучены, особенно в отношении продолжительности самообновления при трансплантации очищенных фракций ГСК обычным иммуноокрашиванием. Таким образом, создание воспроизводимого метода изоляции для долгосрочных ГСК (ЛТ-ГСК) и краткосрочных ГСК (СТ-ГСК), определяемых продолжительностью их самообновления, имеет решающее значение для преодоления этой проблемы. Используя непредвзятый многоступенчатый скрининг, мы идентифицировали фактор транскрипции Hoxb5, который может быть эксклюзивным маркером LT-HSC в кроветворной системе мыши. Основываясь на этом выводе, мы создали линию репортерных мышей Hoxb5 и успешно изолировали LT-HSC и ST-HSC. Здесь мы описываем подробный протокол выделения LT-HSC и ST-HSC с использованием репортерной системы Hoxb5 . Этот метод выделения поможет исследователям лучше понять механизмы самообновления и биологическую основу такой гетерогенности в компартменте ГСК.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), обладающие способностью к самообновлению и мультипотентности, находятся на вершине гемопоэтической иерархии 1,2. В 1988 году Вайсман и его коллеги впервые продемонстрировали, что выделение ГСК мыши может быть достигнуто с помощью проточной цитометрии3. Впоследствии сообщалось, что фракция, определяемая комбинацией маркеров клеточной поверхности, Lineage-c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD34-/loFlk2-, содержит все ГСК у мышей 4,5,6,7,8.

Иммунофенотипически определенные (Lineage−c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD34 - / loFlk2-) ГСК (далее - pHSCs) ранее считались функционально однородными. Однако недавние одноклеточные анализы показали, что рГСК по-прежнему проявляют гетерогенность в отношении их способности к самообновлению9,10 и мультипотентности11,12. В частности, в фракции pHSC, по-видимому, существуют две популяции в отношении их способности к самообновлению: долгосрочные гемопоэтические стволовые клетки (LT-HSCs), которые обладают способностью к непрерывному самообновлению, и краткосрочные гемопоэтические стволовые клетки (ST-HSCs), которые обладают преходящей способностью к самообновлению 9,10.

На сегодняшний день молекулярные механизмы способности к самообновлению, которые отличают LT-ГСК и ST-ГСК, остаются малоизученными. Крайне важно изолировать обе клеточные популяции на основе их способности к самообновлению и обнаружить основные молекулярные механизмы. Также было внедрено несколько репортерных систем для очистки LT-HSC13,14,15; однако чистота LT-HSC, определяемая каждой репортерной системой, варьируется, и до настоящего времени не была достигнута исключительная очистка LT-HSC.

Таким образом, разработка системы изоляции для LT-HSC и ST-HSC ускорит исследования способности к самообновлению фракции pHSC. При выделении LT-ГСК и ST-ГСК исследование с использованием многоступенчатого несмещенного скрининга идентифицировало один ген Hoxb5, который гетерогенно экспрессируется в фракцииpHSC 16. Кроме того, анализ костного мозга мышей-репортеров Hoxb5 показал, что примерно 20-25% фракции pHSC состоит изpos-клеток Hoxb5. Конкурентный анализ трансплантации с использованием Hoxb5 pos pHSC и Hoxb5 neg pHSCs показал, что только Hoxb5pos pHSC обладают способностью к длительному самообновлению, в то время как Hoxb5neg pHSC теряют свою способность к самообновлению в течение короткого периода времени, что указывает на то, что Hoxb5 идентифицирует LT-HSC во фракцииpHSC 16.

Здесь мы демонстрируем пошаговый протокол для выделения LT-HSC и ST-HSC с использованием репортерной системы Hoxb5 . Кроме того, мы представляем конкурентный анализ трансплантации для оценки способности к самообновлению рГСК Hoxb5pos/neg (рис. 1). Эта репортерная система Hoxb5 позволяет нам проспективно изолировать LT-HSC и ST-HSC и способствует пониманию специфических для LT-HSC характеристик.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все описанные эксперименты на животных были одобрены Центром исследований динамики биосистем RIKEN.

1. Предварительное кондиционирование мышей-реципиентов

  1. Подготовьте самцов конгенных мышей C57BL / 6 в возрасте 8-10 недель в качестве мышей-реципиентов. Количество мышей-реципиентов зависит от протокола эксперимента. Обычно мы готовим 10-20 мышей для каждого состояния.
    1. Кормите мышей стерилизованной водой с добавлением энрофлоксацина (170 мг/л). Поскольку облученные мыши-реципиенты очень восприимчивы к инфекции, держите клетки как можно более чистыми.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прием антибиотиков начинается за 24 часа до облучения и продолжается в течение 3 недель после трансплантации, чтобы избежать инфекций.
  2. Облучение всего тела
    1. Общее облучение тела разрушает клетки костного мозга реципиента, чтобы обеспечить приживление донорских клеток. Перенесите мышей-реципиентов в клетку для облучения. Летально облучают мышей-реципиентов однократной дозой 8,7 Гр за 12-16 ч до трансплантации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Доза облучения и время могут варьироваться в зависимости от оборудования. Смертельная доза облучения должна быть подтверждена облучателем исследователя и штаммом мыши.
    2. Верните их в клетки после облучения всего тела.

2. Забор донорских клеток костного мозга

  1. Подготовьте самца мыши Hoxb5-tri-mCherry в возрасте 12 недель и усыпьте мышь воздействием CO2 с последующим вывихом шейки матки или с использованием методов, одобренных местным комитетом по этике животных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем реагента на мышь описан в следующих шагах.
  2. В стерильных условиях удаляют кожу и обнажают кости (бедренную кость, большеберцовую кость, таз, плечевую кость). Разрежьте основные мышцы и возьмите кости (бедренную кость, большеберцовую кость, таз, плечевую кость) у мыши. Поместите их в стерильные чашки для культивирования клеток с ледяным PBS без Ca 2+ и Mg2+.
  3. Обрежьте мышцы и волокнистые ткани с костей с помощью пинцета, маленьких ножниц и салфеток, чтобы предотвратить загрязнение. Будьте осторожны, чтобы не сломать кости на этом этапе. Выбросьте все сломанные кости, чтобы сохранить стерильность.
  4. Стерилизуйте ступку и пестик 70% этанолом (EtOH) и дайте им полностью высохнуть. Уравновешивайте с помощью буфера для окрашивания клеток (Ca 2+ и Mg2+ без PBS с добавлением 2% инактивированного теплом FBS, 2 мМ ЭДТА, 100 ЕД / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина).
  5. Положите кости в ступку и добавьте 3 мл буфера для окрашивания клеток. Раздавите кости пестиком. Дезагрегируйте клеточные скопления путем осторожного пипетирования и перенесите клеточную суспензию через клеточный фильтр размером 100 мкм в пробирку объемом 50 мл.
  6. Повторяйте шаг 2.5 до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Обычно достаточно трех раз.

3. Разделение ячеек c-kit+ методом магнитной сортировки

  1. Окрашивание антител для магнитной сортировки
    1. Центрифугируйте образцы при 400 x g и 4 °C в течение 5 мин. Аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулу в 1 мл буфера для окрашивания клеток. Добавьте 10 мкл крысиного IgG (5 мг / мл), чтобы уменьшить связывание неспецифических антител, и осторожно пипетка вверх и вниз с помощью пипетки P1000. Инкубировать на льду 15 мин.
    2. Добавьте антитело c-Kit (клон 2B8) в концентрации 4 мкг/мл и перемешайте пипеткой P1000. Инкубировать на льду 15 мин.
    3. Добавьте 5 мл буфера для окрашивания клеток и хорошо перемешайте. Центрифугируют образцы при 400 x g, 4 °C, 5 мин. Аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулу в 500 мкл буфера для окрашивания клеток.
    4. Добавьте 35 мкл микрогранул против APC, чтобы обогатить клетки c-Kit+ , и перемешайте пипеткой P1,000. Инкубировать на льду 15 мин.
    5. Добавьте 4-5 мл буфера для окрашивания клеток. Центрифугируйте образцы при 400 x g и 4 °C в течение 5 мин. Аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулу в 1 мл буфера для окрашивания клеток.
  2. Магнитная сортировка ячеек c-Kit+
    1. Следуйте инструкциям производителя, чтобы отсортировать ячейки. Короче говоря, заправьте магнитную сортировочную колонну 3 мл буфера для окрашивания клеток. Отфильтруйте образец (1 мл) через сетчатый фильтр 40 мкм и загрузите образец в магнитную сортировочную колонну.
    2. Вымойте, добавив 3 мл буфера для окрашивания клеток три раза. Добавляйте буфер окрашивания ячеек только в том случае, если резервуар столбца пуст.
    3. Поместите магнитную сортировочную колонку поверх ледяной пробирки объемом 15 мл и добавьте 5 мл буфера для окрашивания клеток. Промойте ячейки, сильно протолкнув поршень в колонну. Держите проточный диск на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случае случайной потери образца мы сохраняем проточный поток до конца эксперимента.

4. Окрашивание гемопоэтическими стволовыми клетками

  1. Центрифугируют образец, приготовленный на этапе 3.2.3, при 400 x g и 4 °C в течение 5 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость.
  2. Добавьте антитело CD34 (клон RAM34) в концентрации 50 мкг/мл к грануле и инкубируйте на льду в течение 60 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для сокращения времени обработки рекомендуется подготовка поддерживающих клеток в течение первого часа инкубации с CD34.
  3. Приготовьте основную смесь антител в соответствии с таблицей 1. Добавьте 100 мкл мастер-смеси в образец и выдержите на льду в течение 30 минут. Антитело к антигену CD34 (клон; RAM34) требуется 90 минут для достаточного окрашивания.
  4. Добавьте 4-5 мл буфера для окрашивания клеток. Центрифугируйте образец при 400 x g и 4 °C в течение 5 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость. Добавьте в гранулы стрептавидин-BUV737 в концентрации 3 мкг/мл и выдержите на льду в течение 30 мин.
  5. Добавьте 4-5 мл буфера для окрашивания клеток. Центрифугируйте образец при 400 x g и 4 °C в течение 5 мин. Аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулу в 400 мкл буфера для окрашивания клеток. Держите образец на льду.

5. Вспомогательная подготовка клеток

  1. Подготовьте конгенную мышь CD45.1+ CD45.2+ в возрасте 12 недель; В идеале это должен быть тот же возраст, что и мышь-донор. Усыпьте мышь воздействием CO2 с последующим вывихом шейки матки или с использованием методов, одобренных местным комитетом по этике животных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В приведенном примере конгенные мыши CD45.1+ CD45.2+ были выведены в домашних условиях путем скрещивания B6. Конгенные мыши CD45.1 с мышами C57BL/6J16.
  2. В стерильных условиях возьмите бедренную и большеберцовую кости и поместите их в стерильные чашки для культивирования клеток с ледяным PBS без Ca 2+ и Mg2+. Обрежьте мышцы и фиброзные ткани с костей с помощью пинцета и маленьких ножниц.
  3. Обрежьте оба конца костей острыми стерильными ножницами. Используйте иглу 23 г и шприц объемом 5 мл, заполненный ледяным буфером для клеточной суспензии (PBS без Ca 2+ и Mg2+, дополненный 2% инактивированным теплом FBS, 100 ЕД / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина), чтобы промыть костный мозг в стерильную чашку для культивирования клеток с буфером клеточной суспензии. Дезагрегируйте клеточные скопления путем осторожного пипетирования.
  4. Отфильтруйте клеточную суспензию через клеточный фильтр размером 40 мкм с помощью пипетки P1,000. Подсчитайте количество клеток клеточной суспензии с помощью гемоцитометра и приготовьте суспензию клеток костного мозга, содержащую 1 x 106 клеток / мл.
  5. Перенесите 200 мкл суспензии клеток костного мозга (2 x 105 клеток) на 96-луночную пластину с круглым дном. Держать на льду до использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать пластины с круглым дном для легкого сбора клеток.

6. Сортировка Hoxb5pos или Hoxb5neg pHSC

  1. Установка литникового монтажа
    1. Перенесите 400 мкл образца, приготовленного на этапе 4.5, в полистирольную пробирку с круглым дном и защелкивающейся крышкой сетчатого фильтра ячейки 35 мкм. Приготовьте реагент для окрашивания мертвых клеток и добавьте его в образец перед анализом в соответствии с инструкциями производителя.
    2. Включите проточный цитометр и запустите программное обеспечение для анализа в соответствии с инструкциями производителя. Затем нажмите «Загрузить» и получите данные.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для повышения чистоты отсортированных клеток рекомендуется использовать проточный цитометр, оснащенный пятью лазерами и соплом 70 мкм.
    3. После исключения дублетов, мертвых клеток и клеток, положительных по происхождению, затворите фракцию Lineage−c-Kit+Sca-1+ . Затем выйдем из дроби Flk2+ . Затем затворите Hoxb5pos или Hoxb5neg pHSCs в CD150 + CD34-/низкой фракции (рис. 2). Выполните компенсацию спектрального перекрытия в первом эксперименте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидается, что Hoxb5-положительные клетки будут составлять 20-25% фракции Lineage−c-Kit + Sca-1+CD150+CD34−/lowFlk2-.
  2. Сортировка Hoxb5pos или Hoxb5neg pHSC
    1. Приготовьте пробирку с низким содержанием белка объемом 1,5 мл с 600 мкл PBS, не содержащего Ca 2+ и Mg2+, с добавлением 10% инактивированного теплом FBS.
    2. Установите пробирку с низким содержанием белка объемом 1,5 мл на устройство для сбора сортировки и отсортируйте pHSC Hoxb5pos или Hoxb5neg в пробирку объемом 1,5 мл, используя стратегию стробирования, установленную на шаге 6.1.3. При первой сортировке используйте выход из режима точности сортировки.
    3. Установите 96-луночную пластину с опорными ячейками, подготовленными на шаге 5.5, на стадию автоматической установки осаждения ячеек (ACDU). Установите пробирку с низким содержанием белка объемом 1,5 мл, приготовленную на шаге 6.2.2, в загрузочное отверстие проточного цитометра.
    4. Отсортируйте pHSC Hoxb5pos или Hoxb5neg в 96-луночную пластину с поддерживающими ячейками, используя стратегию стробирования, установленную на шаге 6.1.3. Отсортируйте 10 pHSC Hoxb5pos или Hoxb5neg , чтобы проверить их способность к самообновлению.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для повышения чистоты рекомендуется двойная сортировка. Во второй сортировке используйте чистоту в качестве рекомендуемого режима точности сортировки.
    5. Как правило, после двойной сортировки собирают 500-1,000 pHSCHoxb5 pos и 1,500-4,000pHSC Hoxb5 neg . Приступайте к процедурам трансплантации как можно скорее после сортировки ГСК для повышения жизнеспособности клеток (в идеале в течение 1-2 часов).

7. Трансплантация

  1. Поместите отсортированную HSC 96-луночную пластину, подготовленную на шаге 6.2.4, на лед. Обрабатывайте отсортированную HSC 96-луночную пластину в стерильных условиях, в идеале в камерном колпаке.
  2. Анестезируйте мышь-реципиента 2% изофлураном в индукционной камере для газовой анестезии. Как только животное будет полностью обезболено, извлеките его и положите на бок. Чтобы обеспечить достаточную анестезию, убедитесь, что нет движений в ответ на вредный раздражитель.
  3. После подтверждения надлежащей анестезии как можно скорее выполните ретроорбитальную инъекцию, чтобы предотвратить приход мыши в сознание. Ретроорбитальная инъекция занимает менее 30 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку время инъекции короткое, мы заканчиваем процедуру, не нанося офтальмологическую мазь в глаза. Однако, если процедура занимает больше времени, мы рекомендуем использовать офтальмологическую мазь.
  4. Аккуратно поместите клетки в отсортированную HSC 96-луночную пластину, чтобы перемешать их. Соберите донорские клетки в сортировочную пластину с помощью инсулинового шприца 30 г и введите их в ретроорбитальное венозное сплетение мышей-реципиентов. Рекомендуемый объем для инъекций составляет ≤200 мкл.
  5. Наблюдайте до тех пор, пока мыши не придут в сознание и не будут передвигаться в чистой клетке. Верните их в клетки после подтверждения их выздоровления.

8. Анализ периферической крови

  1. Соберите 50 мкл периферической крови из хвостовой вены и ресуспендируйте ее 100 мкл Ca 2+ и Mg2+ свободных PBS с 2 мМ ЭДТА. Перенесите все образцы на 96-луночную пластину. Центрифугу при 400 x g и 4 °C в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость.
  2. Добавьте 200 мкл буфера для лизиса эритроцитов и инкубируйте на льду в течение 3 минут. Центрифугируют образцы при 400 x g и 4 °C в течение 5 мин и удаляют надосадочную жидкость. Повторите еще раз.
  3. Добавьте 200 мкл буфера для окрашивания клеток. Центрифугируют образцы при 400 x g и 4 °C в течение 5 мин и удаляют надосадочную жидкость.
  4. Подготовьте основную смесь антител в соответствии с таблицей 2. Добавьте 50 мкл основной смеси антител и инкубируйте на льду в течение 30 минут.
  5. Добавьте 150 мкл буфера для окрашивания клеток. Центрифугируют образцы при 400 x g и 4 °C в течение 5 мин и удаляют надосадочную жидкость.
  6. Добавьте 200 мкл буфера для окрашивания клеток. Центрифугируют образцы при 400 x g и 4 °C в течение 5 мин и удаляют надосадочную жидкость. Ресуспендировать в 200 мкл буфера для окрашивания клеток и добавить реагент для окрашивания мертвых клеток перед анализом в соответствии с инструкциями производителя.
  7. Проанализируйте химеризм периферической крови с помощью проточного цитометра, как описано ранее16. Соберите кровь через 4 недели, 8 недель, 12 недель и 16 недель после трансплантации, чтобы следовать многолинейному восстановлению. Репрезентативные графики проточной цитометрии представлены на рисунке 3.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ранее способность к самообновлению измерялась с использованием конкурентных анализов трансплантации, в которых считается, что донорские ГСК сохраняют свою способность к самообновлению только в том случае, если наблюдаются многолинейные донорские клетки в периферической крови реципиента17. Кроме того, в нескольких отчетах LT-ГСК определяются как клетки, которые продолжают продуцировать клетки периферической крови через несколько месяцев после второй трансплантации костного мозга10...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Традиционно для изучения функций ГСК, таких как способность к самообновлению и мультипотенция 19,20,21, были подготовлены ГСК, определяемые маркерами клеточной поверхности. Однако иммунофенотипически определенная (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2-) фракция ГСК содержит две дискретные популяции ГСК: ЛТ-ГСК и ST-ГСК 9,10

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, связанного с этим исследованием.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Хироши Киёнари за уход за животными и предоставление мышей-реципиентов в RIKEN BDR, а также Хитоми Ога, Каёко Нагасаку и Масаки Мияхаси за управление лабораторией в Университете Кобе. Авторы также высоко ценят постоянную поддержку этой работы. Масанори Мияниши был поддержан Японским обществом содействия науке (JSPS) KAKENHI с номерами грантов JP17K07407 и JP20H03268, Мемориальным фондом медицинских и фармацевтических исследований Мочида, Японским фондом наук о жизни, Научным фондом Такеда, Фондом исследований метаболических нарушений Астелласа и AMED-PRIME, AMED под номером гранта JP18gm6110020. Таро Сакамаки поддерживается JSPS KAKENHI с номерами грантов JP21K20669 и JP22K16334 и поддерживается Программа JSPS Core-to-Core и Программа младших научных сотрудников RIKEN. Кацуюки Ниши был поддержан грантом JSPS No KAKENHI JP18J13408.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,2 мл полоска из 8 пробирок, купольная крышкаSSIbio3230-00
0,5M EDTA pH 8,0IinvtrogenAM9260G
100 &; m Клеточный ситечкоFalcon352360
30G инсулиновый шприцBD326668
40 &микро; m Клеточный фильтрFalcon352340
5 мл 5 мл Круглое дно Полистирольная пробирка, с защелкивающимся колпачкомFALCON352235
7-AAD Раствор для окрашивания жизнеспособностиBioLegend420404
96 лунок U-образное дноFALCON351177
анти-APC-МикрошарикиMiltenybiotec 130-090-855
Аспиратор с ловушкой колбаBiosanFTA-1
B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2)BioLegend103232
B220-Biotin (RA3-6B2)BioLegend103204
B220-BV786 (RA3-6B2)BD Biosciences563894
B6. CD45.1 конгенные мыши Sankyo Labo ServiceN/A
Baytril 10%BAYER341106546
BD FACS Aria II система специальных заказов BDN/A
Блестящий буфер для окрашиванияBD566349
CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70)BioLegend101222
CD11b-Biotin (M1/70)BioLegend101204
CD11b-BUV395 (M1/70)BD Biosciences563553
CD11b-BV711 (M1/70)BD Biosciences563168
CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34)Invitrogen56-1271-82
CD150-BV421 (TC15-12F12.2)BioLegend115943
CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93)Invitrogen56-0161-82
CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34)BD Biosciences560230
CD34-FITC (RAM34)Invitrogen11034185
CD3-Alexa Fluor 700 (17A2)BioLegend100216
CD3ε -Biotin (145-2C11)BioLegend100304
CD3ε -BV421 (145-2C11)BioLegend100341
CD45.1/CD45.2 конгенные мышиН/ДН/Двыведены в нашей лаборатории
CD45.1-FITC (A20)BD Biosciences553775
CD45.2-PE (104)BD Biosciences560695
CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5)BioLegend100430
CD4-Биотин (GK1.5)BioLegend100404
CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7)BioLegend100730
CD8a-Биотин (53-6.7)
15млNICHIRYO00-ETS-CT-15
Пробирка центрифуга 50млNICHIRYO00-ETS-CT-50
c-Kit-APC-eFluor780 (2B8)Invitrogen47117182
D-PBS (-) без Ca и Mg, жидкая Nacalai14249-24
Фетальная бычья сывороткаThermo Fisher10270106
Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10)eBioscience46135182
FlowJo версия 10BD Biosciences 
Gmmacell 40 ExactorBest theratronicsN/A
Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5)BioLegend108422
Gr-1-Biotin (RB6-8C5)BioLegend108404
Hoxb5-tri-mCherry мыши (C57BL/6J фон) Н/ДН/АВыведенный в нашей лаборатории
IgG из сыворотки крыс, технического качества, >=80% (SDS-PAGE), буферный водный растворSigma-AldrichI8015-100MG
изофлуранаPfizer4987-114-13340-3 
Kimwipes S200NIPPON PAPER CRECIA 6-6689-01
Колонны LSMilteny biotec130-042-401
Буфер для лизиса BD555899
MACS  MultiStandMilteny biotec130-042-303
Микропланшет для культуры тканей (для адгезионной клетки) 6WellIWAKI3810-006
MidiMACS СепараторMilteny biotec130-042-302
Клетки для мышиного пирогаNatsume SeisakushoKN-331
Многоцелевая центрифуга холодильнаяTOMYEX-125
NARCOBIT-E (II)Natsume SeisakushoKN-1071-I
NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136)BioLegend108728
Пенициллин-стрептомицин Смешанный растворnacalai26253-84
Фарфоровая ступка φ 120 мм с пестикомAsone6-549-03
Протеин LoBind Tube 1,5 мл Eppendorf22431081
Sca-I-BUV395 (D7)BD Biosciences563990
Лезвие скальпеля из нержавеющей сталиFastGeneFG-B2010
Streptavidin-BUV737BD Biosciences612775
SYTOX-redInvitrogenS34859
Tailveiner Restrainer для мышей стандартBraintreeTV-150 STD
TCRb-BV421 (H57-597)BioLegend109230
Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119)BioLegend116220
Ter-119-биотин (TER-119)BioLegend116204
Terumo 5 мл концентрический шприц Luer-SlipTERUMOSS-05LZ
Terumo Игла для подкожных инъекций 23G x 1TERUMONN-2325-R
Пробирка для центрифуги BioLegend 100704 https://www.flowjo.com/solutions/flowjo

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112 (9), 3543-3553 (2008).
  2. Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
  3. Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241 (4861), 58-62 (1988).
  4. Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
  5. Ikuta, K., Weissman, I. L. Evidence that hematopoietic stem cells express mouse c-kit but do not depend on steel factor for their generation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (4), 1502-1506 (1992).
  6. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
  7. Christensen, J. L., Weissman, I. L. Flk-2 is a marker in hematopoietic stem cell differentiation: A simple method to isolate long-term stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (25), 14541-14546 (2001).
  8. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  9. Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1 (8), 661-673 (1994).
  10. Spangrude, G. J., Brooks, D. M., Tumas, D. B. Long-term repopulation of irradiated mice with limiting numbers of purified hematopoietic stem cells: In vivo expansion of stem cell phenotype but not function. Blood. 85 (4), 1006-1016 (1995).
  11. Dykstra, B., Olthof, S., Schreuder, J., Ritsema, M., de Haan, G. Clonal analysis reveals multiple functional defects of aged murine hematopoietic stem cells. Journal of Experimental Medicine. 208 (13), 2691-2703 (2011).
  12. Grover, A., et al. Single-cell RNA sequencing reveals molecular and functional platelet bias of aged haematopoietic stem cells. Nature Communications. 7, 11075(2016).
  13. Kataoka, K., et al. Evi1 is essential for hematopoietic stem cell self-renewal, and its expression marks hematopoietic cells with long-term multilineage repopulating activity. Journal of Experimental Medicine. 208 (12), 2403-2416 (2011).
  14. Gazit, R., et al. Fgd5 identifies hematopoietic stem cells in the murine bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 211 (7), 1315-1331 (2014).
  15. Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
  16. Chen, J. Y., et al. Hoxb5 marks long-term haematopoietic stem cells and reveals a homogenous perivascular niche. Nature. 530 (7589), 223-227 (2016).
  17. Ema, H., et al. Quantification of self-renewal capacity in single hematopoietic stem cells from normal and Lnk-deficient mice. Developmental Cell. 8 (6), 907-914 (2005).
  18. Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1182 (2010).
  19. Yamamoto, R., et al. Clonal analysis unveils self-renewing lineage-restricted progenitors generated directly from hematopoietic stem cells. Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).
  20. Fathman, J. W., et al. Upregulation of CD11A on hematopoietic stem cells denotes the loss of long-term reconstitution potential. Stem Cell Reports. 3 (5), 707-715 (2014).
  21. Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
  22. Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity. Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).
  23. Schroeder, T. Hematopoietic stem cell heterogeneity: Subtypes, not unpredictable behavior. Cell Stem Cell. 6 (3), 203-207 (2010).
  24. Muller-Sieburg, C. E., Sieburg, H. B., Bernitz, J. M., Cattarossi, G. Stem cell heterogeneity: Implications for aging and regenerative medicine. Blood. 119 (17), 3900-3907 (2012).
  25. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): Providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (1), 11-22 (2009).
  26. Nishi, K., et al. Identification of the minimum requirements for successful haematopoietic stem cell transplantation. British Journal of Haematology. 196 (3), 711-723 (2022).
  27. Sakamaki, T., et al. Hoxb5 defines the heterogeneity of self-renewal capacity in the hematopoietic stem cell compartment. Biochemical and Biophysical Research Communications. 539, 34-41 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Hoxb5lineage

Похожие статьи