Методическая статья

Определение длительности S-фазы с использованием включения 5-этинил-2'-дезоксиуридина в Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/64490

⸱

21 октября 2022 г.

 ,  , 
1Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier, Université de Montpellier, CNRS

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем два дополнительных протокола для точного определения длительности S-фазы в S. cerevisiae с использованием EdU, аналога тимидина, который включен in vivo и обнаружен с помощью химии Click с помощью микроскопии и проточной цитометрии. Это позволяет легко характеризовать продолжительность репликации ДНК и упущенные дефекты репликации у мутантов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Репликация эукариотической ДНК является строго регулируемым процессом, который гарантирует, что генетический чертеж клетки правильно дублируется до сегрегации хромосом. Поскольку дефекты синтеза ДНК лежат в основе хромосомных перестроек, мониторинг репликации ДНК стал необходимым для понимания основы нестабильности генома. Saccharomyces cerevisiae является классической моделью для изучения регуляции клеточного цикла, но ключевые параметры репликации ДНК, такие как доля клеток в S-фазе или длительность S-фазы, все еще трудно определить. Этот протокол использует короткие и нетоксичные импульсы 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU), аналога тимидина, в инженерных дрожжевых клетках TK-hENT1 с последующим его обнаружением реакцией Клика, чтобы обеспечить визуализацию и количественную оценку репликации ДНК с высоким пространственным и временным разрешением как на одноклеточном, так и на популяционном уровнях с помощью микроскопии и проточной цитометрии. Этот метод может идентифицировать ранее упущенные дефекты в S-фазе и прогрессии клеточного цикла дрожжевых мутантов, тем самым позволяя характеризовать новых игроков, необходимых для обеспечения стабильности генома.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стабильность генома посредством митотического деления обеспечивается передачей полного и равного набора хромосом двум продуцируемым клеточным потомкам. Это зависит от точного завершения серии событий, происходящих в данное время в каждой фазе клеточного цикла. В G1 источники репликации лицензируются после набора нескольких лицензионных факторов, включая Cdc61. В S-фазе дупликация всего генома инициируется из нескольких активных источников репликации и выполняется механизмами репликации, которые собираются в микроскопически видимые очаги, называемые фабриками репликации2. В М-фазе дублированные сестринские хроматиды прикрепляются и биоориентируются на митотическом веретене, чтобы обеспечить их сегрегацию к противоположным полюсам митотической клетки3. Регуляция, правильное завершение и продолжительность каждой фазы являются ключом к обеспечению стабильности генома. Действительно, преждевременный выход из любой из этих фаз приводит к нестабильности генома. Например, более короткийG1, индуцированный делецией бутонирующего ингибитора CDK ДРОЖЖЕЙ Sic1 или сверхэкспрессией циклиновG1, изменит последующую S-фазу 4,5,6. Следовательно, эти дерегуляции, связанные или не связанные со стрессом репликации, приводят к разрывам хромосом, перестройкам и неправильной сегрегации 4,5,6. Поэтому мониторинг продолжительности S-фазы и, в более широком смысле, продолжительности других фаз клеточного цикла может иметь решающее значение для выявления дефектов, возникающих у разных мутантов и в разных стрессовых условиях.

Традиционный метод измерения длительности фазы клеточного цикла включает простую цитометрию потока содержания ДНК (рисунок 1A) и опирается на алгоритм подгонки (доступный в большинстве программ для цитометрии), используемый для разделения популяции на фазовые фракции G1, S и G2 + M от пиков 1C и 2C. Затем дроби умножаются на время удвоения популяции7. Однако этот метод дает только оценочные значения, требует однородного распределения размеров клеток в пределах заданной фракции и не применим к синхронизированным культурам. Для изучения длительности S-фазы в клетках млекопитающих было разработано и широко использовано несколько аналогов тимидина, включая EdU. Их поглощение из внеклеточной среды и фосфорилирование тимидинкиназой (далее именуемой ТЗ) делают их доступными для ДНК-полимераз для включения их в места синтеза ДНК (репликация, рекомбинация, репарация). Чтобы обойти отсутствие гена TK в клетках Saccharomyces cerevisiae , штаммы дрожжей были спроектированы таким образом, чтобы обеспечить стабильную и конститутивную экспрессию вируса простого герпеса TK8 и уравновешивающего транспортера нуклеозидов человека (hENT1)9. После включения в ДНК EdU обнаруживается с помощью селективной реакции Click, которая химически связывает его алкиновый фрагмент с азид-модифицированными фторхромами10.

В этой статье представлены два оптимизированных комплексных протокола для импульсной маркировки асинхронных и синхронных клеток, спроектированных TK-hENT1 с EdU, чтобы точно визуализировать и измерить продолжительность и динамику репликации ДНК, а также продолжительность других фаз клеточного цикла с высоким пространственным и временным разрешением как на одноклеточном, так и на популяционном уровнях с помощью микроскопии и проточной цитометрии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Клеточная культура S. cerevisiae

ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые штаммы дрожжей перечислены в таблице 1

ПРИМЕЧАНИЕ: Длительность S-фазы можно контролировать различными способами. В зависимости от вопроса, который необходимо решить, клетки могут быть выращены асинхронно или синхронно после остановкиG1 .

  1. Из асинхронно растущих клеток S. cerevisiae
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод позволяет определить процент клеток в S-фазе в асинхронно растущей клеточной популяции. Определяя время удвоения, продолжительность S-фазы (и других фаз) может быть экстраполирована.
    1. Инокулируют клетки S. cerevisiae в 10 мл синтетической полной (SC) среды при низкой концентрации клеток (5 × 104 клеток/мл) для ночной культуры при 30 °C с орбитальным перемешиванием при 130 об/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация измеряется с помощью счетчика клеток. Чтобы эффективно рассчитать время удвоения, рекомендуется привить культуру из ночной культуры, которая все еще находится в экспоненциальной фазе (т. Е. В идеале ниже 2 × 107 клеток / мл). Выращивание клеток в богатой среде (YPD) не рекомендуется, так как обнаружение EdU неэффективно.
    2. На следующий день разводят клетки в 20 мл свежей среды SC в конечной концентрации 5 × 105 клеток/мл.
    3. Культивируйте клетки при 30 °C на встряхивающей водяной бане с горизонтальным встряхиванием при 120 об/мин.
    4. Измеряйте концентрацию клеток каждый час, пока она не достигнет 1 × 107 клеток / мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг позволяет сделать графическое представление увеличения концентрации клеток с течением времени. Формула, используемая для расчета времени удвоения, объясняется в легенде таблицы 2.
    5. Параллельно с этапом 2 для маркировки EdU, когда концентрация в клетке составляет около 2 × 106-5 × 106 клеток/мл.
  2. Из G1-синхронизированных клеток S. cerevisiae
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод позволяет определить, когда начинается и заканчивается S-фаза, с помощью проточной цитометрии и/или микроскопического анализа.
    1. Инокулируют клетки S. cerevisiae в 10 мл среды SC при низкой концентрации клеток (5 × 104 клеток/мл) для ночной культуры при 30 °C с орбитальным перемешиванием при 130 об/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: См. примечания после шага 1.1.1.
    2. На следующий день разводят клетки в 20 мл свежей среды SC в конечной концентрации 2 × 106-3 × 106 клеток/мл.
    3. Добавьте 40 мкл 1 мг/мл α-фактора, разбавленного в воде.
    4. Культивируйте клетки при 30 °C с орбитальным перемешиванием при 130 об/мин в течение 1 ч.
    5. Добавьте еще раз 40 мкл 1 мг/мл α-фактора, разбавленного в воде.
    6. Культивируйте клетки при 30 °C с орбитальным перемешиванием при 130 об/мин в течение 1 ч.
    7. Визуализируйте клетки под световым микроскопом для мониторинга остановки G1 . Продолжайте, если более 90% ячеек отображают shmoo, а остальные представляют собой округлые, неочищенные ячейки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от используемого фона, рекомендуется обрабатывать клетки ультразвуком перед визуализацией shmoo. Для фона W303 снаряжайте ультразвуком 2x, в течение 2 с каждый раз, с амплитудой 40-50.
    8. Центрифуга в течение 3 мин при 1 500 × г. Выбросьте супернатант вакуумной пипеткой.
    9. Повторное суспендирование клеток в 20 мл среды SC.
    10. Повторите шаги 1.2.8-1.2.9 один раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Α-фактор смывается этими шагами, и клетки высвобождаются в клеточном цикле. Альтернативно, α-фактор может быть смыт путем фильтрации дрожжевых клеток с помощью нитроцеллюлозного фильтра 1,2 мкм с использованием воронки, установленной на колбе с боковым рычагом, соединенной с вакуумным насосом.
    11. Соберите 1 мл клеток 2 раза каждые 5 минут и перейдите к шагу 2 для маркировки EdU.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Импульсная метка клеток только из одной из двух трубок с EdU. Неимпульсно-меченые клетки используются для различения EdU-положительных и EdU-отрицательных клеток на бивариатном графике пропидидия йодида (PI)-EdU.
    12. Добавьте 400 мкл 1 мг/мл α-фактора, разбавленного в воде через 30 мин после высвобождения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта высокая доза α-фактора необходима для остановки клеток в фазе G1 следующего клеточного цикла и предотвращения повторного входа клеток в последующую S-фазу.

2. Маркировка EdU

  1. Переложите 1 мл клеточной культуры в микрофьюжную трубку объемом 2,0 мл, содержащую 1 мкл 10 мМ EdU. Хорошо перемешать путем инверсии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы отличить EdU-положительные клетки от EdU-отрицательных клеток на PI-EdU бивариатном FACS, переведите еще 1 мл клеточной культуры в микрофьюжную трубку объемом 2,0 мл, содержащую 1 мкл DMSO.
  2. Инкубировать в течение 3-5 мин при 30 °С при перемешивании на встряхивающей водяной бане.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трех минут достаточно для обнаружения EdU с помощью микроскопа; Для оптимального обнаружения EdU на проточном цитометре требуется 5 мин.
  3. Прекращают реакцию добавлением 100 мкл 100% этанола.
    1. Прекращают реакцию добавлением 100 мкл 20% параформальдегида, если требуется измерение размера клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если ядерная архитектура митотических клеток должна быть сохранена нетронутой для дальнейшего анализа после реакции Клика, мы рекомендуем фиксировать клетки с 2% параформальдегидом при комнатной температуре (RT), а не помещать клетки на лед, поскольку последний вызывает деполимеризацию микротрубочек.
    2. Оставьте ячейки на 20 мин при РТ при мягком перемешивании на коромысле с переменной скоростью при 20 наклонах/мин, чтобы зафиксировать ячейки перед добавлением 100 мкл 100% этанола.

3. Фиксация и пермеабилизация клеток

  1. Гранулируют клетки в течение 2 мин по 10 000 × г в микрофуге. Удалите супернатант с помощью вакуумной пипетки.
  2. Повторно суспендировать ячейку гранулы в 500 мкл 70% этанола. Хорошо перемешать путем вихря.
  3. Оставьте на ≥1 ч при RT со скоростью 20 наклонов/мин на коромысле с переменной скоростью, чтобы пропитать ячейки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, выращенные в среде SC, плохо гранулируются, поскольку они, как правило, прилипают к стенкам микрофуге. Добавление этанола улучшает гранулирование и уменьшает потерю клеток. Клетки могут храниться при 4 °C в течение ночи или в течение более длительных периодов при −20 °C.
  4. Гранулируйте клетки в течение 2 мин при 10 000 × г в микроцентрифуге. Выбросьте супернатант вакуумной пипеткой.
  5. Промыть клетки 2x с 500 мкл 10% этанола в PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Промывки имеют решающее значение для удаления неинкорпорированного EdU из клеток.

4. Реакция клик-ит

  1. Для цитометрического анализа
    1. Гранулируют клетки в течение 2 мин по 10 000 × г в микрофуге. Выбросьте супернатант вакуумной пипеткой.
    2. Повторно суспендируют гранулы в 200 мкл ПБС, содержащих 0,1 мг/мл РНКазы А и 0,2 мг/мл протеиназы К.
    3. Инкубировать в течение 1-2 ч при 50 °C с периодическим встряхиванием (или на ночь при 37 °C).
    4. Гранулируйте клетки в течение 2 мин при 10 000 × г в микроцентрифуге. Выбросьте супернатант вакуумной пипеткой.
    5. Промыть клетки 500 мкл PBS.
    6. Гранулируют клетки в течение 2 мин по 10 000 × г в микрофуге. Выбросьте супернатант вакуумной пипеткой.
    7. Повторное суспендирование клеточной гранулы в 200 мкл PBS + 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Инкубировать в течение 30 мин на РТ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более длительное время не требуется и даже наносит ущерб эффективности реакций Клика.
    8. Гранулируйте клетки в течение 2 мин при 10 000 × г в микроцентрифуге. Выбросьте супернатант вакуумной пипеткой.
    9. Повторно суспендировать гранулы в 300 мкл PBS + 1% BSA.
    10. Распределите ячейки между двумя трубками: 200 мкл в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл для реакции Клика и 100 мкл в другой микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл для окрашивания Sytox Green.
    11. Гранулируйте клетки в течение 2 мин при 10 000 × г в микроцентрифуге. Выбросьте супернатант вакуумной пипеткой.
    12. Для окрашивания Sytox Green
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы настоятельно рекомендуем использовать аликвоту для окрашивания Sytox Green (без Click), чтобы получить высококачественные справочные профили содержания ДНК. Действительно, реакция Клика сильно гасит интеркалантную флуоресценцию, включая флуоресценцию Sytox Green и PI. Следовательно, реакция Клика может исказить чтение содержимого ДНК.
      1. Повторное суспендирование клеточной гранулы в 100 мкл PBS.
      2. Переложить 10-30 мкл (в зависимости от концентрации в клетке) в проточную цитометрическую трубку, содержащую 300 мкл 50 мМ Tris-HCl, рН 7,5 и 0,5 мкМ Sytox Green.
      3. Ультразвук 2x, в течение 2 с каждый раз, с амплитудой 40-50.
      4. Оставить в темноте до обработки образцов на проточном цитометре.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут храниться на этой стадии при 4 °C в течение нескольких дней.
    13. Для реакции клика
      1. Готовят свежий буфер азидного красителя путем смешивания реагентов в следующем порядке (количество для одной пробирки): 36 мкл PBS, 2 мкл 0,2 M CuSO4, 0,2 мкл 2 мМ Cy5 Azide и 2 мкл 1 M аскорбиновой кислоты.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Можно приготовить мастер-микс буфера Азидного красителя. Реагенты должны быть смешаны в том же порядке, что и упомянутый выше.
      2. Повторно суспендируйте ячейку гранулы 40 мкл свежеприготовленной смеси Azide Dye. Инкубировать в RT в темноте в течение 60 мин.
      3. Гранулируйте клетки в течение 2 мин при 10 000 × г в микроцентрифуге. Выбросьте супернатант вакуумной пипеткой.
      4. Промыть ячейки 3x с 300 мкл 10% этанола в PBS.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Промывки имеют решающее значение для устранения всего растворимого азида EdU-Cy5.
      5. Повторное суспендирование клеток в 100 мкл 50 мкг/мл PI в PBS. Оставить на 10 мин в темноте.
      6. Переложить 10-30 мкл клеточной суспензии (в зависимости от концентрации в клетке) в проточную трубку цитометра, содержащую 300 мкл 50 мМ Tris-HCl, рН 7,5.
      7. Ультразвук 2x, в течение 2 с каждый раз, с амплитудой 40-50.
      8. Оставить в темноте до обработки образцов на цитометре.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут храниться на этой стадии при 4 °C в течение нескольких дней.
    14. Считывайте образцы Sytox Green с помощью синего лазера возбуждения при 488 нм и фильтра BP 530/30. Типичные результаты см. на рисунке 1A . Считывание двухмерных образцов PI-EdU на точечном графике с помощью синего лазера возбуждения при 488 нм и фильтра 615/20 BP для PI (ось x) и красного лазера возбуждения при 640 нм и фильтра 660/20 BP (ось Y). Типичные результаты см. на рисунке 1B .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рисунок 1C представляет типичный двухмерный результат PI-EdU FACS для EdU-отрицательных клеток. Он позволяет различать EdU-отрицательные клетки от EdU-положительных клеток.
  2. Для микроскопического анализа
    1. Гранулируйте клетки в течение 2 мин при 10 000 × г в микроцентрифуге. Выбросьте супернатант вакуумной пипеткой.
    2. Повторно суспендировать гранулы в 200 мкл PBS + 1% BSA. Инкубировать в течение 30 мин на РТ.
    3. Гранулируют клетки в течение 2 мин по 10 000 × г в микрофуге. Выбросьте супернатант вакуумной пипеткой.
    4. Готовят свежий буфер азидного красителя путем смешивания реагентов в следующем порядке (количество для одной пробирки): 36 мкл PBS, 2 мкл 0,2 М CuSO4, 0,2 мкл 2 мМ Ди-530 азида, 2 мкл 1 М аскорбиновой кислоты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мастер-смесь буфера азидных красителей может быть приготовлена в свежем виде путем смешивания реагентов в указанном порядке.
    5. Повторно суспендируйте гранулы 40 мкл свежеприготовленного буфера азидного красителя. Инкубировать в RT в темноте в течение 60 мин.
    6. Гранулируйте клетки в течение 2 мин при 10 000 × г в микрофуге. Выбросьте супернатант вакуумной пипеткой.
    7. Промыть клетки в 2 раза 300 мкл 10% этанола в PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Промывки имеют решающее значение для устранения всех растворимых азидов Dy-530.
    8. Гранулируйте клетки в течение 2 мин при 10 000 × г в микроцентрифуге. Выбросьте супернатант вакуумной пипеткой.
    9. Повторное суспендирование клеток в 100 мкл 0,5 мкг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в PBS. Оставить на 30 мин в темноте при комнатной температуре.
    10. Гранулируют клетки в течение 2 мин при 10 000 × г в микроцентрифуге. Выбросьте супернатант вакуумной пипеткой.
    11. Промыть 300 мкл PBS, чтобы удалить избыток DAPI.
    12. Гранулируют клетки в течение 2 мин при 10 000 × г в микрофуге. Выбросьте супернатант вакуумной пипеткой.
    13. Повторно суспендировать гранулу с 10-50 мкл PBS в зависимости от концентрации в клетке.
    14. Ультразвук 2x, в течение 2 с каждый раз, с амплитудой 40-50.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут храниться на этой стадии при 4 °C в течение нескольких дней.
    15. Пипетка 1,7 мкл клеток на стеклянный микроскоп скользит и покрывается чистым чехлом.
    16. Сразу же наблюдать под флуоресцентным микроскопом с помощью фильтров DAPI и TexasRed или Cy3.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для определения длительности S-фазы и, в более широком смысле, длительностиG1 иG2 +M (этап протокола 1.1) клетки S. cerevisiae W303 дикого типа (WT, таблица 1) выращивали асинхронно в среде SC в течение 7 ч. Каждый час концентрацию клеток контролировали для определения времени удвоения (рисунок 2B). В этих условиях роста расчетное время удвоения составляло 120 мин ± 13 мин при 25 °C (таблица 2). Когда клетки находились в экспон...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дрожжи являются основным модельным организмом для исследований клеточного цикла, но характеристика их S-фазы уже давно затруднена их неспособностью включать экзогенные нуклеозиды, такие как BrdU, которые используются в качестве индикаторов репликации ДНК. Оснащение дрожжей высокой экспрессией простого герпеса тимидинкиназы (TK) и добавление транспортера нуклеозидов человека (hENT) в значительной степени решило эту проблему 15,16. EdU более универсален, чем BrdU, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы выразить признательность Национальному агентству исследований (ANR) и Ассоциации по исследованиям в области рака (ARC) за стипендии phD для J.d.D.B.T. и Agence Nationale pour la Recherche (ANR) за финансовую поддержку (грант ANR-18-CE12-0018-01). Цитометрия и микроскопия были выполнены в центре визуализации МРТ BioCampus в Монпелье.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
α-factor ГеноскриптRP01002
Бычий сывороточный альбумин (БСА)Euromedex04-100--812-E
Сульфат медиSigmaC1297
DAPISigmaD9542
Ди-сульфо-цианиновый азид 5 (Cy5 азид)InterchimFP-JV6320Альтернатива Alexa647-Азид
Dy-530 азидDyomics  530-10
EdU (5-этинил-2'-дезоксиуридин)КарбосинтNE08701
абсолютный этанолРеагенты Carlo ErbaP013A10D16или эквивалент
L-аскорбиновой кислотыSigmaA4544
Пропидиум йодидSigmaP4864
Протеиназа KEuromedexEU0090
RnaseSIGMAR5000
Sytox GreenInvitrogenS-7020
Equipment
Cell counterOLSCASY
Flow цитометрAgilentNovoSampler Pro
Встряхивающий инкубаторInfors444-4230или аналог
Встряхивающая вода ваннаJulaboSW22или аналог
SonicsVibra cell
Широкопольная микроскопияLeicaTHUNDER Imagerили аналог

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bell, S. P., Labib, K. Chromosome duplication in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).
  2. Kitamura, E., Blow, J. J., Tanaka, T. U. Live-cell imaging reveals replication of individual replicons in eukaryotic replication factories. Cell. 125 (7), 1297-1308 (2006).
  3. Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: Sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).
  4. Lengronne, A., Schwob, E. The yeast CDK inhibitor Sic1 prevents genomic instability by promoting replication origin licensing in late G1. Molecular Cell. 9 (5), 1067-1078 (2002).
  5. Tanaka, S., Diffley, J. F. X. Deregulated G 1-cyclin expression induces genomic instability by preventing efficient pre-RC formation. Genes & Development. 16 (20), 2639-2649 (2002).
  6. Teixeira, L. K., et al. Cyclin E deregulation promotes loss of specific genomic regions. Current Biology. 25 (10), 1327-1333 (2015).
  7. Slater, M. L., Sharrow, S. O., Gart, J. J. Cell cycle of Saccharomyces cerevisiae in populations growing at different rates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (9), 3850-3854 (1977).
  8. McNeil, J. B., Friesen, J. D. Expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and General Genetics. 184 (3), 386-393 (1981).
  9. Vernis, L. Reconstitution of an efficient thymidine salvage pathway in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 31 (19), 120(2003).
  10. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  11. Bruschi, C. V., McMillan, J. N., Coglievina, M., Esposito, M. S. The genomic instability of yeast cdc6-1/cdc6-1 mutants involves chromosome structure and recombination. Molecular and General Genetics. 249 (1), 8-18 (1995).
  12. Feng, L., Wang, B., Wu, L., Jong, A. Loss control of Mcm5 interaction with chromatin in cdc6-1 mutated in CDC-NTP motif. DNA and Cell Biology. 19 (7), 447-457 (2000).
  13. Saner, N., et al. Stochastic association of neighboring replicons creates replication factories in budding yeast. Journal of Cell Biology. 202 (7), 1001-1012 (2013).
  14. Pasero, P., Braguglia, D., Gasser, S. M. ORC-dependent and origin-specific initiation of DNA replication at defined foci in isolated yeast nuclei. Genes & Development. 11 (12), 1504-1518 (1997).
  15. Lengronne, A. Monitoring S phase progression globally and locally using BrdU incorporation in TK+ yeast strains. Nucleic Acids Research. 29 (7), 1433-1442 (2001).
  16. Magiera, M. M., Gueydon, E., Schwob, E. DNA replication and spindle checkpoints cooperate during S phase to delay mitosis and preserve genome integrity. The Journal of Cell Biology. 204 (2), 165-175 (2014).
  17. Talarek, N., Petit, J., Gueydon, E., Schwob, E. EdU incorporation for FACS and microscopy analysis of DNA replication in budding yeast. Methods in Molecular Biology. 1300, 105-112 (2015).
  18. Ivanova, T., et al. Budding yeast complete DNA synthesis after chromosome segregation begins. Nature Communications. 11 (1), 2267(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

EdUSytox Green

Похожие статьи