Оценка влияния биотоксинов на функции иммунных клеток у рыбок данио

Краткое содержание

Этот протокол описывает проточные цитометрические анализы, которые могут оценить влияние воздействия токсина на эндоцитарные функции различных субпопуляций лейкоцитов рыбок данио. Использование специфических функциональных ингибиторов в анализе позволяет дифференцировать измененные эндоцитарные механизмы.

Аннотация

Различные биологические токсины могут присутствовать в вредных количествах в водной среде. Цианобактерии — это разнообразная группа прокариотических микроорганизмов, которые производят цианотоксины в водной среде. Эти биотоксины могут быть гепатотоксинами, дерматоксинами или нейротоксинами и могут поражать рыб и млекопитающих. При высоких концентрациях эти соединения приводят к летальному исходу. На нелетальных уровнях они действуют коварно и влияют на функции иммунных клеток. Биотоксины, вырабатываемые водорослями, включают микроцистин и анатоксин А. Водные животные также могут проглатывать вещество, загрязненное ботулиническим нейротоксином Е (BoNT/E), вырабатываемым Clostridium botulinum, что также приводит к смерти или снижению иммунных функций. Рыбок данио можно использовать для изучения того, как токсины влияют на функции иммунных клеток. В этих исследованиях воздействие токсинов может быть выполнено in vivo или in vitro. Исследования in vivo подвергают рыбок данио воздействию токсина, а затем клетки изолируют. Этот метод демонстрирует, как тканевая среда может влиять на функцию лейкоцитов. В исследованиях in vitro клетки сначала изолируют, а затем подвергают их воздействию токсина в культуральных лунках. Лейкоциты получают путем экстракции почечного мозга с последующим центрифугированием с градиентом плотности. То, как лейкоциты интернализуют патогены, определяется эндоцитарными механизмами. Анализ фагоцитоза проточной цитометрии показывает, были ли эндоцитарные механизмы изменены воздействием токсина. Исследования с использованием изолированных лейкоцитов для определения того, как токсины вызывают иммунную дисфункцию, отсутствуют. Процедуры, описанные в этой статье, позволят лабораториям использовать рыбок данио для изучения механизмов, которые воздействуют, когда токсин окружающей среды снижает эндоцитарные функции иммунных клеток.

Введение

Существует множество видов биотоксинов окружающей среды и иммуносупрессивных агентов. Цветение водорослей, содержащих бактериальные токсины, происходит во внутренних водах, а также может происходить в виде биопленок¹. Цианобактерии (сине-зеленые водоросли) в природе встречаются во всех пресноводных экосистемах. Цветение цианобактерий в пресноводных системах значительно возросло². В определенные моменты времени цианобактерии могут вырабатывать токсины, которые вредны для водных и наземных животных. Эти токсины могут поражать печень, кожу, слизистые оболочки и/или нервную систему. Два соединения, продуцируемые цианобактериями, являются микроцистином и анатоксином А. Микроцистин представляет собой циклический гептапептид³. Анатоксин А является алкалоидом⁴. Ботулинический нейротоксин Е (BoNT/E) является еще одним токсином, который встречается в водных системах. Он вырабатывается Clostridium botulinum и может употребляться в пищу водными животными⁵.

Воздействие токсинов окружающей среды влияет на рыб, а также может влиять на здоровье животных и увеличивать заболеваемость⁶. Понимание того, как эти токсины влияют на иммунные клетки, имеет основополагающее значение для определения рисков, связанных с воздействием этих веществ. Рыбки данио являются отличной моделью для изучения влияния токсинов окружающей среды на иммунные клетки⁷. Разработка метода, использующего проточную цитометрию и лейкоциты рыбок данио, очень полезна. Рыбки данио имеют физиологическое значение для человека, и этот метод может быть применен в широком спектре областей исследований, от фундаментальной токсикологии и иммунологии до разработки лекарств и биологии развития. Поскольку рыбки данио относятся к водным организмам, они особенно подходят для изучения воздействия токсинов окружающей среды, переносимых через воду⁷. Использование рыбок данио дешевле, чем других моделей позвоночных, и их использование вызывает меньше этических проблем.

Белые кровяные тельца, или лейкоциты, являются первой линией клеточной защиты от болезнетворных организмов. Эндоцитоз — это процесс, при котором клетка поглощает или усваивает жидкость или частицу, которая находится вне клетки. Это достигается за счет того, что клетка заключает соединение в везикулу⁸. Лейкоциты используют этот процесс в качестве первого шага в уничтожении патогенов и подготовке защиты от болезней. Фагоцитоз является разновидностью эндоцитоза и был одним из первых методов, использованных для исследования влияния загрязнителей окружающей среды на здоровье рыб⁹. Лаборатория Петри-Хансона разработала методы с использованием лейкоцитов рыбок данио для скрининга биотоксинов на предмет их потенциальной способности вмешиваться в эндоцитарные и фагоцитарные функции лейкоцитов и влиять на иммунную защиту. К типам эндоцитоза, включенным в эти методы, относятся пиноцитоз, фагоцитоз, кальцийзависимый рецептор-опосредованный фагоцитоз и маннозно-рецепторный фагоцитоз. Методы проточной цитометрии на рыбках данио были впервые описаны^{в лаборатории} Петри-Хансона9 и регулярно используются для исследования водных токсинов и патогенов. Rag1^-/- мутантные данио-рерио не имеют Т- и В-клеток¹⁰ и могут быть использованы для специфического исследования механизмов врожденных иммунных клеток.

Проточная цитометрия основана на лазере и может быть использована для определения физических свойств клеток. Прямое рассеивание, или значение FSC, отображается на оси X и представляет собой размер ячейки. Боковое рассеяние, или SSC, отображается на оси Y и представляет собой цитоплазматическую зернистость клетки. Полученный график демонстрирует популяции клеток со схожими физическими характеристиками, сгруппированных вместе, при этом различные типы клеток появляются в разных местах на точечной диаграмме. Эти популяции могут менять свое местоположение на диаграмме рассеяния по мере изменения физических характеристик клеток⁹. Использование этой методики с лейкоцитами рыбок данио позволяет исследователям оценить изменения в клеточных популяциях в ответ на различные стимулы, включая токсины окружающей среды.

Проточный цитометр является многомерным, и для дальнейшей характеристики клеток и их активности можно использовать несколько типов флуорофоров. В анализах, описанных в этом протоколе, эндоцитоз характеризуется измерением количества флуоресцентного материала, усвоенного клеткой. Влияет ли воздействие токсина на эндоцитарные механизмы и как это можно определить, сравнив способность клеток, подвергшихся воздействию токсина, поглощать материал по сравнению со способностью клеток, не подвергшихся воздействию токсина, с помощью проточной цитометрии. Эндоцитарные процессы, которые могут быть оценены таким образом, включают пиноцитоз, рецептор-опосредованный эндоцитоз и фагоцитоз.

Пиноцитоз – это поглощение растворимых компонентов, при этом не используются клеточные рецепторы. Поглощение включает в себя цитоплазматическую перестройку микрофиламентами и микротрубочками с образованием небольших вакуолей. Люцифераза желтая (LY) — флуоресцентный краситель, используемый для измерения поглощения жидкости неселективным пиноцитозом¹¹. Рецепторно-опосредованный эндоцитоз включает в себя избирательное поглощение крупных молекул. Для оценки этого процесса можно использовать флуоресцеин (FITC), меченный декстраном (DX) 40. Фагоцитоз — это форма эндоцитоза, при которой частицы размером более 0,5 микрометра поглощаются. Этот процесс исследуется с помощью процедур с использованием FITC-DX70 и FITC-Eschericia coli. DX40 и DX70 имеют молекулярные массы 40 000 и 70 000 соответственно. FITC-E. coli является стандартным лабораторным штаммом E. coli , связанным с фтором, который можно измерить с помощью проточного цитометра. Многие формы рецептор-опосредованного эндоцитоза требуют кальция в качестве сигнальной молекулы и для перестройки цитоскелета⁹. Другим типом рецептор-опосредованного эндоцитоза является эндоцитоз, опосредованный маннозным рецептором (МР). Маннозные рецепторы представляют собой трансмембранные белки, которые распознают формы маннана на поверхности микробных клеток⁹. Для оптимизации этих процедур для каждого токсина должна быть создана кривая реакции на дозу, чтобы определить дозы, которые будут использоваться. Для оценки правильной концентрации следует провести кривую насыщения для LY, FITC-DX40, FITC-DX70 и FITC-E. coli .

Механизмы, используемые лейкоцитами для интернализации различных частиц, могут различаться. Чтобы предположить, на какой компонент процесса может влиять воздействие токсина, можно добавить ингибиторы для блокирования фагоцитарных механизмов. Цитохалазин D (CCD) подавляет движение микротрубочек и, следовательно, пиноцитоз. CCD не влияет на рецептор-опосредованный эндоцитоз¹¹. ЭДТА блокирует кальций-зависимый рецептор-опосредованный эндоцитоз. Маннан является природным лигандом для МРТ. Маннан используется в качестве ингибитора рецептора маннозы для оценки того, является ли фагоцитоз или пиноцитоз опосредованным рецептором маннозы⁹.

Целью данного протокола является демонстрация процедур определения того, повлияло ли воздействие токсина на способность фагоцитарных лейкоцитов поглощать патогены. Эти протоколы также могут определить, поражен ли конкретный эндоцитарный механизм. Выполнение этих анализов на проточном цитометре позволяет проводить дальнейшую дискриминацию путем отбора популяций лейкоцитов на основе размера и зернистости цитоплазмы, чтобы определить, были ли субпопуляции лейкоцитов поражены дифференциально. Этот метод основан на электронном стробировании клеточных популяций.

Протокол

Этот протокол был одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Университета штата Миссисипи (MSU-IACUC). Все рыбки данио, использованные в этом исследовании, были выведены из гомозиготной колонии мутантных рыбок данио-рерио, ранее созданной в специальном инкубатории, свободном от патогенов, в Колледже ветеринарной медицины Университета штата Миссисипи (MSU)¹⁰. В этом инкубаторе также размножались дикие данио-рерио. В этих исследованиях воздействие токсинов может быть выполнено in vivo или in vitro. Исследования in vivo подвергают рыбок данио воздействию токсина, после чего лейкоциты изолируются, что указывает на то, как токсин и микроокружение тканей могут взаимодействовать и влиять на функцию лейкоцитов. В исследованиях in vitro изолируют лейкоциты, а затем подвергают клетки воздействию токсина в культуральных лунках.

1. Приготовление реагентов и растворов

1. Буфер для сортировки флуоресцентных активированных клеток (FACS): (Сбалансированный раствор соли Хэнкса без кальция или магния (HBSS) + 0,05% бычьего сывороточного альбумина (BSA)) (см. Таблицу материалов). Приготовьте его в свежем виде перед изоляцией клеток.
2. Питательные среды для тканевых культур (ТКМ): Используйте RPMI-1640 с добавлением глутамакса и 10% фетальной бычьей сыворотки (см. Таблицу материалов).
3. Цитохалазин D (CCD): Приготовьте исходный раствор путем ресуспендирования коммерчески доступного продукта (см. Таблицу материалов) в 1 мл абсолютного этанола с температурой 200 градусов. Приготовьте рабочий раствор, добавив 20 μL исходной CCD к 980 μL буфера FACS, чтобы получить конечную концентрацию 2,5 μг/мл.
4. ЭДТА: Исходный раствор составляет 1 мг/мл. Приготовьте рабочий раствор, добавив 100 мкл стокового раствора в 900 мкл буфера FACS, чтобы получить конечную концентрацию 1 мМ.
5. Маннан: Приготовьте исходный раствор в дозе 1 мг/мл (см. Таблицу материалов). Далее готовят рабочий раствор, добавляя 100 мкл стокового раствора в 900 мкл буфера FACS, чтобы получить конечную концентрацию 500 мкг/мл.
6. Приготовьте Люцифер Желтый (10 мкг/мл) (LY, флуоресцентный краситель), Декстран-40 (DX-40, 500 мкг/мл) и Декстран-70 (DX-70, 500 мкг/мл) отдельно, сделав раствор 1 мг/мл каждого из них, повторно суспендируя имеющиеся в продаже реагенты (см. Таблицу материалов) в стерильной воде.
7. Флуоресцеиновые бактерии (FITC): выращивают Escherichia coli DH5α (см. Таблицу материалов) с встряхиванием в среде Luria Bertani (LB) объемом 100 мл с добавлением 50 мкг/мл FITC в течение ночи при 37 °C в защищенной от света среде, получают оптическую плотность (OD) 0,8 при 540 нм.
   1. Промойте бактерии (3 раза) фосфатным буферным раствором (PBS) центрифугированием в течение 10 минут при 1000 x g с последующим нагреванием до 60 °C в течение 20 минут. Постирайте еще 1 раз, затем отрегулируйте концентрацию бактерий до OD₅₄₀ 0,8. Это будет стоковое решение.
   2. Приготовьте рабочий раствор, разбавив стоковый раствор в соотношении 1:100 (1 мл стока: 99 мл буфера FACS). Отрегулируйте конечную концентрацию до 1,8 x 10⁸ клеток/мл.

2. Уход за данио рерио

1. Поддерживайте рыбок данио в однопроходной проточной системе на дехлорированной муниципальной воде и скармливайте рыбную муку с высоким содержанием белка и живую артемию до полного насыщения.
2. В возрасте 6 месяцев извлеките разнополых данио-рерио из аквариумов и перевезите их в исследовательскую лабораторию для использования в эксперименте. Это лучший возраст для выделения оптимального количества лейкоцитов из почечного мозга⁹.

3. Выделение клеток

1. Усыпьте 10 рыбок данио в трикаине (~100 мл 4 мг/мл фосфатного буферного сульфоната метана трикаина/литр рыбьей воды) (см. Таблицу материалов) в соответствии с установленными методами⁹.
2. Поместите клеточный фильтр 40 μм в коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл.
3. Удалите ткани почечного мозга⁹ и поместите их в С-образную трубку с 3 мл питательных сред для тканевых культур и гомогенизируйте ткань с помощью диссоциатора тканей. Это предпочтительная процедура.
4. В качестве альтернативы можно разрушить ткани с помощью резинового конца шприца объемом 3 мл в клеточном фильтре. После того, как ткань гомогенизируется (или разрушена), вылейте суспензию через клеточное сетчатое фильтр 40 мкм, помещенное поверх конической трубки объемом 50 мл.
5. Отфильтрованную суспензию центрифугировать при температуре 500 x g в течение 5 минут при 16 °C. Слейте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в 3 мл ТКМ. Повторите этот шаг дважды.
6. Тщательно выложите клетки на 3 мл стерильно отфильтрованной среды с градиентом плотности (1,077 г/мл) при комнатной температуре.
7. Затем центрифугируйте при 800 x g в течение 20 мин при 16 °C. Убедитесь, что тормоз находится на самом низком уровне, чтобы элементы не подвешивались при остановке центрифуги.
8. Снимите непрозрачный баффовый слой с интерфейса на пробирку с круглым дном объемом 14 мл.
9. Промойте ячейки, добавив 5 мл ТКМ и перемешав с помощью пастеровской пипетки. Центрифугируйте при 300 x g в течение 5 мин при 16 °C.
10. Повторите этот шаг, отбросив надосадочную жидкость и повторно суспендируя клеточную гранулу в ТКМ, чтобы получить примерно 1 x 10⁶ клеток/мл.

4. Анализ жизнеспособности клеток

1. Чтобы контролировать жизнеспособность клеток, оцените их гибель с помощью окрашивания йодидом пропидия (PI).
   1. Добавьте PI (200 мкг/мл) в концентрации 5 мкл/мл анализируемых клеток. Читайте на канале PE/Texas Red.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Йодид пропидиума диффундирует через отверстия в мембранах мертвых клеток, тем самым, окрашивая их. Оцененная жизнеспособность составила 85% для настоящего исследования.

5. Инкубация токсинов

1. Аликвоту 200 мкл клеток из изолированной клеточной суспензии в каждую лунку 6-луночного тканевого культурального планшета (3 лунки для контроля и 3 лунки для воздействия токсина). Это позволяет выполнять репликации в трех экземплярах.
2. Добавьте по 2 мл ТКМ в каждую лунку.
3. Добавьте токсин (~2,5 мкг/мл) в три лунки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация токсина должна быть оптимизирована до начала эксперимента и будет зависеть от токсина, используемого для анализа.
4. Инкубируйте планшет для культивирования тканей для получения желаемого времени воздействия. Желаемое время воздействия должно быть оптимизировано до начала эксперимента и будет зависеть от токсина, используемого для анализа. В настоящем исследовании время экспозиции составило ~1 ч.
5. После воздействия поместите планшет для культивирования тканей на лед на 10 минут.
6. Осторожно проводите пипетки в каждой лунке вверх и вниз, чтобы удалить все прилипшие клетки с пластины.
7. Извлеките ячейки из планшета в пробирку для центрифуги с круглым дном объемом 14 мл.
8. Центрифугируйте ячейки при 300 x g в течение 5 минут при 16 °C. Ресуспендируйте клетки в 3 мл буфера FACS. Повторите этот шаг дважды.
9. Ресуспендируйте клетки в 1,5 мл буфера FACS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для исследований in vivo подвергните рыбок данио воздействию токсина (в концентрации, аналогичной упомянутой выше), а затем изолируйте клетки.

6. Анализ на эндоцитоз

1. Аликвота 100 мкл клеток на пробирки проточной цитометрии объемом 5 мл. Пробирки пометьте следующим образом, указав по четыре повторяющиеся пробирки из каждой лунки: (1) LY, (2) DX40, (3) DX70, (4) FITC-E. coli.
2. Добавьте флуоресцентный краситель, как указано в шаге 1.6 и шаге 1.7, в соответствующие пробирки: 50 мкл LY в пробирку (1), 50 мкл DX40 в пробирку (2); 50 мкл DX70 к пробирке (3); 50 мкл FITC-E. coli в трубку (4).
3. Инкубировать в течение 1 ч. Добавьте 200 μL буфера FACS в каждую пробирку.
4. Центрифугируйте клетки при давлении 400 x g в течение 5 минут при 16 °C. Слейте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 200 мкл буфера FACS. Повторите этот шаг три раза. Проведите проточный цитометрический анализ.

7. Проточная цитометрия

1. Выполняйте проточную цитометрию для визуализации клеточных популяций и сбора данных. Обратитесь к Hohn et ^al.9 для получения подробной информации.
2. Определите целевые популяции клеток на первом этапе. Используйте боковое рассеяние (SSC) (обычно вертикальную ось) для удаления мусора и небольшие пикнотические ячейки на крайней левой стороне и прямое рассеивание (FSC) (обычно горизонтальная ось) для удаления того же мусора в нижней части графика.
3. Исключите дублетные чтения (ячейки, подсчитанные дважды). Это выполняется с помощью строба импульсной геометрии (FSC-H x FSC-A).
4. Определение фонового сигнала. Запускайте в клетках только контроль флуоресценции и контроль изотипа флуоресценции для каждого используемого флуорохрома, чтобы определить фоновые уровни флуоресценции.
   Примечание: Каждый флуорохром имеет свой уникальный уровень фоновой флуоресценции, на который влияет автофлуоресценция клеток и неспецифическое связывание. При этом проводится различие между истинными положительными сигналами и фоновой флуоресценцией. При идентификации и гейтировании клеточных популяций на основе флуоресценции эти контрольные значения вычитаются из числа положительных событий, и полученное число является числом, используемым для анализа.
5. Прогоните образцы и определите популяции клеток, которые необходимо проверить. Используйте FSC и SSC для морфологической характеристики и идентификации различных клеточных популяций в смеси клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: FSC в первую очередь связан с размером ячейки. Большие ячейки будут рассеивать больше света в прямом направлении, что приведет к более высоким значениям FSC, в то время как меньшие ячейки будут рассеивать меньше света и иметь более низкие значения FSC. Ячейки разных размеров будут группироваться в кластеры. Например, лимфоциты, будучи меньше, могут выступать в виде отдельного кластера с более низкими значениями FSC по сравнению с гранулоцитами. SSC связан с зернистостью, сложностью и внутренней структурой клетки. Клетки с большей цитоплазматической зернистостью будут иметь более высокие значения SSC. Похожие клетки будут группироваться вместе. Например, нейтрофилы имеют цитоплазматические гранулы и будут кластеризоваться при более высоком значении SSC, чем лимфоциты.
6. Прогоните все образцы и на основе FSC/SSC примените вентили к популяциям клеток для дальнейшего анализа. Закрытые зоны применяются в зависимости от плотности клеток и популяций, представляющих интерес.
7. Нанесите стробированные области на гистограммы для анализа средней интенсивности флуоресценции (MFI) FITC в каждом затворе для флуоресценции на длине волны 495 нм / 519 нм с помощью синего лазера.
8. Количество экспортных ячеек в соответствии с программным обеспечением, чтобы преуспеть в программе анализа.
9. Анализируйте данные в статистическом программном комплексе (см. Таблицу материалов).
10. Сравните MFI каждой популяции контрольных клеток с MFI популяций клеток, подвергшихся воздействию токсина.

8. Влияние токсина на эндоцитарные механизмы и эффекты ингибиторов CCD, ЭДТА и маннана на эндоцитарные механизмы

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы всасывать жидкости или частицы, цитоплазма клетки активно движется. Это движение требует множества структурных элементов и сигнальных путей. Биотоксины могут влиять на любой из этих элементов или путей. Сравнение эффектов специфических характерных ингибиторов может быть использовано для того, чтобы помочь понять, как биотоксин может действовать¹¹.

1. Выполните выделение клеток, как описано в шаге 3.
2. Аликвота 100 мкл клеток на проточные цитометрические пробирки объемом 5 мл (с четырьмя реплицирующимися пробирками из каждой лунки).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пометьте трубки следующим образом: (5) CCD + LY (CCD ингибирует пиноцитоз, подавляя перегруппировку микрофиламентов и микротрубочек; LY используется для оценки поглощения жидкости микропиноцитозом)⁹. (6) ЭДТА + DX40 (ЭДТА блокирует фагоцитоз, опосредованный зависимым рецептором^Ca2+ , и микропиноцитоз; измерение того, участвует ли поглощение в кальций-зависимом механизме). (7) ЭДТА + DX70. (8) ЭДТА + FITC-E. coli. (9) Маннан + DX40 (маннан ингибирует специфическое поглощение рецептором маннозы, измеряя МР-зависимый эндоцитоз⁹). (10) Маннан + DX70. (11) Маннан + FITC-E. coli.
3. Добавьте ингибиторы: 1 мкл CCD в пробирку (5); 10 мкл ЭДТА в пробирки (6-8); 100 мкл маннана в пробирки (9-11). Следите за концентрациями, как указано в шаге 1. Выдерживать в течение 5 минут.
4. Добавьте флуоресцентную вторичную жидкость в соответствующие пробирки: 50 мкл LY в пробирку (1) и (5); 50 мкл DX40 в трубку (2), (6) и (9); 50 мкл DX70 в пробирку (3), (7) и (10); 50 мкл FITC-E. coli в пробирку (4), (8) и (11). Выдерживать в течение 30 минут.
5. Добавьте 200 μL буфера FACS в каждую пробирку. Центрифуга при 400 x g при 16 °C в течение 5 минут.
6. Слейте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 200 мкл буфера FACS. Повторите шаги 8.5-8.6 два раза.
7. Запустите образцы на проточном цитометре, следуя шагу 7.

Результаты

В анализах эндоцитоза используются смешанные лейкоциты, выделенные из градиентов и заторбированные для фагоцитов и лимфоцитов, чтобы определить, были ли изменены конкретные клеточные механизмы под воздействием токсинов. Во-первых, клетки стробируются на основе размера и зернистости¹⁰. Мертвые, фрагментированные или умирающие клетки визуализируются в левом нижнем углу диаграммы рассеяния и устраняются, а не анализируются на фагоцитоз. Ворота фагоцитов включают макрофаги, естественные киллеры (NK-клетки) и гранулоциты, в то время как ворота лимфоцитов включают лимфоциты, фагоцитарные В-клетки и неспецифические цитотоксические клетки (НКК) (рис. 1).

Фагоцитоз определяется по поглощению частиц, меченных FITC, как показано при считывании флуоресценции на длине волны 495 нм / 519 нм с помощью синего лазера. Фоновая автофлуоресценция и неспецифическая связывающая флуоресценция исключаются путем учета средней интенсивности флуоресценции (MFI), излучаемой контрольными клетками и контролем изотипа. Для определения используемых концентраций следует провести кривую "доза-реакция" для каждого ингибитора. Если результаты проточной цитометрии клеток, подвергшихся воздействию тестируемого токсина, такие же, как и результаты клеток, подвергшихся воздействию ингибитора, то токсин вызывает аналогичный эффект и может ингибировать этот эндоцитарный механизм. Если реакции токсина и ингибитора являются аддитивными, это говорит о том, что токсин может ингибировать эндоцитоз по другому механизму, чем ингибитор.

Сравнивают клетки, которые не подвергались лечению, и клетки, обработанные исследуемым токсином (рисунок 2), клетки, обработанные токсином или ингибитором (рисунок 3A), и клетки, обработанные только ингибитором (рисунок 3B). Репрезентативные результаты показывают, что клетки, обработанные микроцистином, были ингибированы, подобно клеткам, обработанным CCD. Эти результаты показывают, что микроцистин ингибирует поглощение жидкости микропиноцитозом. Закрытые клетки анализируют с помощью одностороннего ANOVA, и результаты должны быть представлены как среднее количество клеток, положительных на FITC.

Рисунок 1: Репрезентативная диаграмма рассеяния проточной цитометрии лейкоцитов, выделенных из ткани почек рыбок данио дикого типа, на основе характеристик прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC). Ворота фагоцитов включают макрофаги/моноциты и гранулоциты (23% затворенных клеток). Ворота лимфоцитов включают лимфоциты, фагоцитарные В-клетки и неспецифические цитотоксические клетки (НКК) (26% закрытых клеток). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) фагоцитарных клеток, закрытых на рисунке 1 , после воздействия токсина. В пробирке (1) показаны неокрашенные клетки, в то время как клетки в пробирке (2) излучают флуоресценцию за счет поглощения LY. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) фагоцитов, зависимых на рисунке 1. Поглощение желтого люцифера (LY) без присутствия ингибитора цитохалазина D (CCD) (А); поглощение LY с наличием CCD. В пробирке (1) видны неокрашенные клетки, в то время как клетки в пробирке (2) излучают флуоресценцию за счет поглощения LY. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Обзор этапов, включенных в протокол. *Продолжительность и степень воздействия биотоксина на рыб будут варьироваться в зависимости от конкретного используемого биотоксина, а также от правил и протоколов по уходу за животными и биобезопасности различных учреждений. ** Желаемая используемая концентрация и время воздействия должны быть оптимизированы до начала эксперимента и будут зависеть от используемого токсина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Использование проточной цитометрии с лейкоцитами рыбок данио предлагает мощный и универсальный подход к детальному изучению иммунной системы, оценке воздействия токсинов окружающей среды и содействию токсикологическим исследованиям. Он дает возможность быстро и эффективно оценить влияние токсинов на иммунные клетки и иммунный ответ. Результаты выявляют вовлеченные гуморальные факторы и позволяют предположить, как физиология и метаболизм рыб взаимодействуют с биотоксинами окружающей среды. Обзор протокола представлен на рисунке 4.

Однако у этих методов есть ограничения. Подготовка лейкоцитов рыбок данио к проточной цитометрии может быть более сложной по сравнению с другими моделями. Небольшие размеры рыбок данио рерио могут ограничивать количество крови и количество лейкоцитов, доступных для анализа ^9,10. Эти процедуры требуют диссоциации тканей для получения суспензий одиночных клеток, и жизнеспособность клеток может повлиять на точность результатов. По сравнению с такими моделями, как мыши, диапазон доступных иммунологических инструментов, таких как антитела, специфичные к маркерам клеток данио-рерио, более ограничен для рыбок данио-рерио. Это ограничение может ограничивать глубину анализа, который может быть проведен на лейкоцитах рыбок данио. Кроме того, интерпретация данных проточной цитометрии требует специальных знаний, особенно при работе со сложными иммунными реакциями. Неправильная интерпретация данных может привести к неправильным выводам, особенно в контексте воздействия токсинов в окружающую среду.

Результаты образцов клеток без добавления ингибиторов можно сравнить с образцами клеток с ингибиторами. Результаты образцов клеток с добавлением токсина следует сравнивать с образцами клеток с ингибиторами. Если была нарушена перестройка цитоскелета, поглощение LY будет ограничено. Если токсин ингибирует поглощение DX-40 или DX-70, частицы разных размеров не будут фагоцитироваться. Если клетки не поглощают FITC-E. coli, то токсин ингибирует фагоцитоз.

Подводя итог, можно сказать, что рыбки данио служат отличной моделью для изучения влияния токсинов окружающей среды на иммунные клетки. В этом протоколе описывается метод, использующий проточную цитометрию и лейкоциты рыбок данио-рерио для скрининга биотоксинов, с особым акцентом^{на процессы} эндоцитоза и фагоцитоза. Цель данного исследования состоит в том, чтобы выяснить, влияет ли воздействие токсинов на способность фагоцитарных лейкоцитов поглощать патогены, а также выявить потенциальное воздействие на конкретные эндоцитарные механизмы.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
10% фетальная бычья сыворотка	Gibco	A3160501
14 мл круглого дна центрифужные пробирки	BD Biosciences	352059
40 &микро; m клеточный штаммер	Corning	07-201-430
мл пробирки для проточной цитометрии	BD Biosciences	352235
50 мл коническая центрифужная пробирка	Corning	14-959-49A
Абсолютный этанол	Fisher	BP2818-500
Автоматизированный счетчик клеток	Life Technologies Countess II FL		для изучения жизнеспособности клеток
крупного рогатого скота сывороточный альбумин (БСА)	Сигма	А3059
цитохалазин D (CCD)	Сигма	С8273-5МГ
Декстран 40	Сигма	FD40-100MG
Декстран 70	Сигма	46945-100MG-F
Escherichia coli DH5&альфа; (или другой лабораторный штамм бактерий)	New England Biolabs	C29871
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)	Sigma	ED4SS
Программное обеспечение для анализа потока	Novoacea программное обеспечение
Проточный цитометр	Novocyte 3000
Флуоресцеин	Fluka BioChemica	46950
ганкса сбалансированный раствор соли без кальция или магния	Sigma	H4891
Histopaque 1077	Sigma	10771-100ML
Люцифер желтый	Sigma	L0259-25MG
Mannan	Sigma	M7504-250MG
Фосфат буферизированный физиологический раствор	Sigma	P3813
RPMI-1640 с GlutaMax	Gibco	61870036
Статистическое программное обеспечение	SPSS
Токсин
трикейн	Western Chemical Inc	NC0342409