Анализ флуоресценции кальция с двойным добавлением для высокопроизводительного скрининга рекомбинантных рецепторов, связанных с G-белком

Caixing Xiong; Dwight Baker; Patricia Pietrantonio

doi:10.3791/64505

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Анализ флуоресценции кальция с двойным добавлением для высокопроизводительного скрининга рекомбинантных рецепторов, связанных с G-белком

2.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64505

⸱

2 декабря 2022 г.

Caixing Xiong¹ , Dwight Baker² , Patricia Pietrantonio¹

¹Department of Entomology, Texas A&M University, ²Department of Biochemistry and Biophysics, Texas A&M University

В этой статье

Краткое содержание

В этой работе описан высокопроизводительный внутриклеточный флуоресцентный анализ кальция для 384-луночных пластин для скрининга библиотек малых молекул на рекомбинантных рецепторах, связанных с G-белком (GPCR). Мишень, рецептор кинина от клеща лихорадки крупного рогатого скота, Rhipicephalus microplus, экспрессируется в клетках CHO-K1. Этот анализ идентифицирует агонисты и антагонисты, используя одни и те же клетки в одном анализе «двойного добавления».

Аннотация

Рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), представляют собой крупнейшее надсемейство рецепторов и являются мишенями многочисленных лекарств человека. Высокопроизводительный скрининг (HTS) случайных библиотек малых молекул против GPCR используется фармацевтической промышленностью для обнаружения целевых лекарств. В этом исследовании HTS был использован для идентификации новых низкомолекулярных лигандов специфических для беспозвоночных нейропептидных GPCR в качестве зондов для физиологических исследований векторов смертельных человеческих и ветеринарных патогенов.

Специфический для беспозвоночных рецептор кинина был выбран в качестве мишени, потому что он регулирует многие важные физиологические процессы у беспозвоночных, включая диурез, питание и пищеварение. Кроме того, фармакология многих беспозвоночных GPCR плохо характеризуется или не характеризуется вообще; таким образом, дифференциальная фармакология этих групп рецепторов по отношению к родственным GPCR у других метазоанов, особенно у людей, добавляет знания о структурно-активных отношениях GPCR как надсемейства. Анализ HTS был разработан для клеток в 384-луночных пластинах для открытия лигандов рецептора кинина от клеща лихорадки крупного рогатого скота или южного клеща крупного рогатого скота, Rhipicephalus microplus. Рецептор клещевого кинина стабильно экспрессировался в клетках CHO-K1.

Рецептор кинина при активации эндогенными нейропептидами кинина или другими агонистами малых молекул вызывает высвобождение Ca²⁺ из запасов кальция в цитоплазму. Этот анализ флуоресценции кальция в сочетании с подходом «двойного добавления» может обнаруживать функциональные агонисты и антагонисты, «поражающие» молекулы в одной и той же пластине анализа. Каждый анализ проводился с использованием лекарственных пластин, несущих массив из 320 случайных малых молекул. Был получен надежный Z'-фактор 0,7, и три молекулы агониста и два антагониста были идентифицированы, когда HTS находился в конечной концентрации 2 мкМ. Анализ флуоресценции кальция, представленный здесь, может быть адаптирован для скрининга других GPCR, которые активируют сигнальный каскад Ca²⁺ .

Введение

Рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), которые присутствуют от дрожжей к человеку, представляют собой крупнейшее надсемейство рецепторов во многих организмах¹. Они играют решающую роль в регулировании почти всех биологических процессов у животных. В геноме членистоногих насчитывается 50-200 GPCR, что означает, что они представляют собой самое большое надсемейство мембранных рецепторов². Они классифицируются на шесть основных классов, A-F, на основе их сходства последовательностей и функций³. GPCR трансдуцируют различные внеклеточные сигналы, такие как гормоны, нейропептиды, биогенные амины, глута....