Представлен быстрый и эффективный протокол выделения пластоглобулы липидных капель, связанных с различными фотосинтезирующими организмами. Успешное получение изолированных пластоглобул является важным первым шагом, который предшествует подробным молекулярным исследованиям, таким как протеомный и липидомический анализы.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение пластоглобулы липидных капель из ткани листьев растений и цианобактерий
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Капли липидов пластоглобул являются динамическим субкомпоном растительных хлоропластов и цианобактерий. Считается, что они повсеместно встречаются среди фотосинтезирующих видов и играют центральную роль в адаптации и ремоделировании тилакоидной мембраны в быстро меняющихся условиях окружающей среды. Способность выделять пластоглобулы высокой чистоты значительно облегчила их изучение с помощью протеомных, липидомных и других методологий. С пластоглобулами высокой чистоты и выхода можно исследовать их липидный и белковый состав, ферментативную активность и топологию белка, среди других возможных молекулярных характеристик. В данной статье представлен быстрый и эффективный протокол выделения пластоглобул из хлоропластов ткани листьев растений и представлены методологические вариации выделения пластоглобул и связанных с ними липидных капельных структур из листьев кукурузы, высохшей листовой ткани воскрешающего растения Eragrostis nindensis и цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803. Изоляция зависит от низкой плотности этих богатых липидами частиц, что облегчает их очистку флотации плотности сахарозы. Эта методология окажется полезной при изучении пластоглобул различных видов.
Введение
Современное понимание состава и функции пластоглобул появилось благодаря подробным протеомным и липидомическим исследованиям 1,2,3,4,5. Таким исследованиям в значительной степени способствовал быстрый и эффективный метод изоляции, который опирается на их очень низкую плотность для эффективного разделения с использованием градиентов сахарозы. Первоначальные методы выделения пластоглобул были достигнуты из таких видов, как буковое дерево (Fagus sylvatica), шотландский веник (Sarothamnus scoparius....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Выделение сырой пластоглобулы
- Извлечение сырой пластоглобулы из ненапряженной ткани листьев кукурузы
- Приобретите шесть здоровых саженцев кукурузы примерно в возрасте 3 недель и почти на стадии роста V5, весом около 120 г.
- Отрежьте все листья у основания стебля, быстро окуните их в ледяную ванну и транспортируйте в холодное помещение.
- Работая под зеленой лампой безопасности, извлеките листья кукурузы из ледяной ванны и разрежьте их на более мелкие кусочки (около 5 см х 5 см) с помощью ножниц.
- Аккуратно, но тщательно измельчите половину обрезанной ткани листа в коммерческом блендере в 350 мл измельчаю....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
По завершении этапа 1 протокола следует легко увидеть значительное количество пластоглобулы/липидного капельного материала, плавающего на верхнем слое сахарозной подушки (или рядом с ним) (рис. 1В-С). Другие фракции также могут быть собраны на этом этапе. Например, тилакоиды будут гранулированы и могут быть повторно суспендированы со средой R 0,2 для последующих анализов. После последующего центрифугирования очищенные пластоглобулы будут получены на поверхно.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Чтобы свести к минимуму физиологические/биохимические изменения материала и защитить определенные фото- и термолабильные прениллипидные пигменты, которые являются богатым компонентом пластоглобул, крайне важно выполнить изоляцию при 4 °C и защитить от света. Как указано выше, начальные этапы выполняются в холодном помещении под предохранительной лампой с использованием зеленой лампочки. Последующие этапы, выполняемые в лаборатории, проходят при приглушенном освещении и используют лед или охлажденную центрифугирование. По.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Никаких конфликтов интересов для декларирования.
Благодарности
Исследования в лабораторной группе Лундквиста поддерживаются грантами NSF (MCB-2034631) и USDA (MICL08607) P.K.L. Авторы благодарят доктора Кэрри Хизер (МГУ) за поддержку в разработке метода выделения цианобактериальных пластоглобул.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| AEBSF | Milipore Sigma | P7626 | |
| Antipain.2HCl | Bachem | H-1765.0050BA | |
| Апротинин | Milipore Sigma | A6106 | |
| Аскорбат | BDH | BDH9242 | |
| Бестатин | Sigma Aldrich | B8385 | |
| бета-глицерофосфат. 2Na5H2O | EMD Millipore | 35675 | |
| Бычья сыворотка Альбумин | Пролиант Биологический | 68700 | |
| Химостатин | Sigma Aldrich | C7268 | |
| Eragrostis nindensis | N N/A | N/A | |
| E-64 | Milipore Sigma | E3132 | |
| French Pressure Cell (модель FA-079) | SLM/Aminco | N / A | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Лейпептин | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Хлорид магния | Sigma Aldrich | M8266 | |
| Мультитронный встряхивающий инкубатор | Infors HT | N/A | |
| Фосфо-рамидон.2 Na | Sigma Aldrich | R7385 | |
| Гидроксид калия | Fisher Chemicals | M16050 | |
| Восстановленный цистеин | MP биохимикаты | 101444 | |
| фторидом натрия | Sigma Aldrich | S7920 | |
| Ортванадат натрия | Sigma Aldrich | 450243 | |
| пирофосфат натрия · 10H2O | Sigma Aldrich | 3850 | |
| сорбит | Sigma Aldrich | S3889 | |
| Сахароза | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sylvania 15 Вт люминесцентная лампочка Gro-Lux лампочка на трубке, 18" | Walmart | N/A | |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | N/A | /A | |
| Optima MAX-TL Ультрацентрифуга | Beckman Coulter | A95761 | |
| Waring Blender (1,2 л) | VWR | 58977-227 | Коммерческий блендер |
| Зеа Мэйс | Н/Д | Н/Д |
Ссылки
- Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. Lipid droplets throughout the evolutionary tree. Progress in Lipid Research. 78, 101029(2020).
- Lundquist, P. K., et al. The functional network of the Ara....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
