Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Анализ индуцированного Т-клеточными рецепторами притока кальция в первичных мышиных Т-клетках методом проточной цитометрии полного спектра

5.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64526

⸱

16 декабря 2022 г.

 ,  , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado-Anschutz School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Приток кальция, мера передачи сигналов Т-клеток, является эффективным способом анализа ответов на стимуляцию Т-клеточных рецепторов. Этот протокол мультиплексирования Indo-1 с панелями антител, направленными на молекулы клеточной поверхности, использует преимущества очень гибких возможностей проточной цитометрии полного спектра.

Аннотация

Приток кальция в ответ на стимуляцию Т-клеточных рецепторов является общей мерой передачи сигналов Т-клеток. Было разработано несколько индикаторных красителей кальция для оценки передачи сигналов кальция с помощью полосовой проточной цитометрии. Этот протокол предназначен для измерения кальциевых реакций в первичных мышиных Т-клетках с использованием проточной цитометрии полного спектра. Общие спленоциты помечаются ратиометрическим индикаторным красителем кальция Indo-1 вместе с панелью флуорохром-конъюгированных антител к молекулам клеточной поверхности. Использование возможностей проточной цитометрии полного спектра обеспечивает платформу для использования широкого спектра окрашиваний клеточной поверхности в сочетании с Indo-1. Затем клетки анализируются в режиме реального времени при 37 ° C до и после добавления антитела против CD3 для стимуляции Т-клеточного рецептора. После смешивания спектральных сигналов рассчитывается отношение связанного с кальцием и свободного кальция Indo-1, которое может быть визуализировано с течением времени для каждой закрытой популяции спленоцитов. Этот метод может позволить проводить одновременный анализ кальциевых реакций в нескольких клеточных популяциях.

Введение

Индуцированный Т-клеточным рецептором (TCR) приток кальция является полезной мерой активации Т-клеток и часто используется для определения того, имеет ли популяция Т-клеток нарушенные ответы на проксимальных этапах сигнального путиTCR 1. Измерения притока кальция обычно выполняются путем предварительной маркировки Т-клеток одним или парой флуоресцентных индикаторных красителей кальция, а затем изучения флуоресцентных сигналов с использованием проточной цитометрии в режиме реального времени после сшивания TCR 2,3,4. Индо-1, соотношение-метрический краситель кальция, возбуждается УФ-лазером с пиковым излучением на двух разных длинах волн, зависящих от связываниякальция 5, и является широко используемым индикаторным красителем для анализа проточной цитометрии кальциевых реакций в живых лимфоцитах. Поскольку эмиссионный профиль Indo-1 довольно широк, может быть сложно совместить оценку Indo-1 с одновременным анализом нескольких маркеров клеточной поверхности с помощью полосовой проточной цитометрии. Это ограничение ограничивает использование проточного цитометрического анализа кальциевых ответов для предварительно очищенных популяций Т-клеток или для популяций, идентифицированных ограниченным набором молекул клеточной поверхности.

Чтобы устранить ограничения измерения кальциевых реакций на гетерогенных популяциях первичных лимфоцитов с использованием полосовой проточной цитометрии, был разработан протокол для измерения флуоресценции Indo-1 с использованием проточной цитометрии полного спектра. Этот метод позволяет мультиплексировать Indo-1 с панелями антител, направленными на молекулы клеточной поверхности, используя преимущества очень гибких возможностей проточной цитометрии полного спектра. Преимущество использования проточной цитометрии полного спектра по сравнению с обычной проточной цитометрией заключается в ее способности отличать флуоресцентные сигналы от сильно перекрывающихся красителей, тем самым увеличивая количество поверхностных маркеров, которые могут быть одновременно оценены в каждом образце. Традиционная проточная цитометрия использует полосовые фильтры и ограничена одним флуорохромом на детекторную систему6. Проточная цитометрия полного спектра собирает сигналы по всему спектру флуорохрома с помощью 64 детекторов на пятилазерной спектральной проточной цитометрической системе 7,8. Кроме того, для проточной цитометрии полного спектра используются детекторы APD (лавинные фотодиоды), которые имеют повышенную чувствительность по сравнению с лампочными детекторами фотоумножителя, присутствующими на обычных проточных цитометрах8. Следовательно, этот подход идеально подходит для гетерогенных клеточных популяций, таких как мононуклеарные клетки периферической крови или суспензии вторичных клеток лимфоидных органов у мышей, поскольку он устраняет необходимость выделения специфических популяций Т-клеток перед маркировкой кальциевым красителем. Вместо этого профили экспрессии маркеров клеточной поверхности и стробирование проточной цитометрии после сбора данных могут быть использованы для оценки кальциевых реакций в каждой интересующей популяции. Как показано в этом отчете, Indo-1 можно легко комбинировать с восемью флуорохром-конъюгированными антителами, в результате чего в общей сложности получается 10 уникальных спектральных сигнатур. Кроме того, этот метод может быть легко применен к смесям клеток из конгенно различных линий мышей, что позволяет проводить одновременный анализ кальциевых реакций в Т-клетках дикого типа по сравнению с таковыми из линии мышей, нацеленных на гены.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Мыши содержались в медицинском кампусе Университета Колорадо в Аншутце в соответствии с протоколами IACUC. Все мыши были усыплены в соответствии со стандартами AAALAC.

1. Получение иммунных клеток из селезенки мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Усыпляйте наивных мышей с помощью эвтаназии CO2 . Мыши C57BL/6, приобретенные в Jackson Laboratories и выведенные собственными силами, используются для экспериментов в возрасте 6-12 недель. Для экспериментов используются как самцы, так и самки мышей.

  1. Продезинфицируйте кожу мыши 70% этанолом, чтобы уменьшить вероятность попадания внешних загрязнений в образец.
  2. Рассекайте селезенку мыши с помощью инструментов для рассечения, хирургических ножниц и щипцов. Соберите селезенку и поместите отделенную селезенку в коническую пробирку объемом 50 мл с ~ 5 мл полной среды RPMI (cRPMI) на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полный RPMI состоит из 10% FBS, 2 мМ L-глютамина и 1% пенициллина/стрептомицина.
    1. Чтобы собрать селезенку мыши, сделайте ножницами 5-сантиметровый надрез на шерсти и коже вдоль левой стороны мыши на полпути между передней и задней лапами. Вскрывают полость тела ~5 см и удаляют селезенку с помощью щипцов. Селезенка имеет цвет фасоли и длиннее и более плоская, чем соседняя почка.
  3. Вылейте содержимое шага 1.2 на стерильный фильтр 70 мкм, прикрепленный к новой конической пробирке объемом 50 мл. Механически разделите селезенку на одноклеточную суспензию, проталкивая селезенку через фильтр с помощью поршня шприца объемом 5 мл до тех пор, пока на поверхности фильтра не останется пульпа селезенки.
  4. Гранулируйте спленоциты с помощью центрифуги на столешнице с поворотным ротором при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C.
  5. Аккуратно сцедите надосадочную жидкость. Гранулированные спленоциты остаются на дне конической пробирки объемом 50 мл.
  6. Для удаления эритроцитов повторно суспендировать гранулированные спленоциты в 1 мл буфера для лизиса ACK в течение 3 мин в соответствии с инструкциями производителя. Хорошо перемешайте.
  7. Погасите буфер лизиса ACK 15 мл cRPMI.
  8. Гранулируйте лимфоциты, как указано на шаге 1.4.
  9. Повторно суспендировать клеточную суспензию в 5 мл cRPMI в конической пробирке объемом 50 мл. Поместите образцы на лед.
    1. Чтобы подсчитать клетки, перенесите 10 мкл клеточной суспензии в микроцентрифужную пробирку объемом 0,6 мл и разбавьте в соотношении 1:1 раствором трипанового синего. Затем переведите на гемоцитометр или автоматизированную систему подсчета клеток.
  10. После подсчета, в зависимости от концентрации клеток в клеточной суспензии, как на этапе 1.9, гранулируют клетки в настольной центрифуге при 500 x g при 4 ° C в течение 5 мин, чтобы подготовиться к добавлению среды cRMPI, содержащей сложноэфирный краситель Indo-1 AM.
  11. Рассчитайте объем для повторной суспензии клеток, чтобы достичь 10-12 х10,6 клеток/мл. Это 2-кратная концентрация от общего количества клеток.
  12. Повторно суспендируйте ячейки в объеме cRPMI, рассчитанном на шаге 1.11. Поместите клетки при 37 ° C с 5% CO2 в коническую пробирку объемом 50 мл с вентилируемой крышкой или в пластину для культивирования тканей.

2. Маркировка ратиометрического красителя и флуоресцентных антител Indo-1

  1. В соответствии с инструкциями производителя добавьте 50 мкл ДМСО во флакон, содержащий 50 мкг Indo-1 AM. Концентрация исходного раствора составляет 1 мкг/мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ДМСО поставляется в микрофлаконах с набором для предотвращения окисления ДМСО.
  2. Разбавьте исходную аликвоту (1 мкг/мкл) в соответствующем экспериментальном объеме (установленном в 1.11) cRPMI в концентрации 6 мкг/мл, т.е. в 2-кратной концентрации. Не храните Indo-1 в водном растворе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие буферы с добавлением кальция могут быть использованы в зависимости от потребностей клетки.
  3. Отложите весь носитель с Indo-1 в сторону на водяной бане при температуре 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте минимальную концентрацию эфира Indo-1 AM, необходимую для получения адекватного сигнала. Это необходимо титровать для различных типов клеток. Как правило, достаточно концентрации в пределах 3-5 мкМ. Для первичных Т-клеток загрузка клеток Indo-1 в концентрации >5 мкг/мл увеличивает среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) выше log 6 на спектральных проточных цитометрах. Если это произойдет, уменьшите интенсивность УФ-лазера и титруйте Indo-1 до более низкой концентрации.
  4. Разбавьте предварительно подготовленную клеточную суспензию (на шаге 1.12), 1:1 в cRPMI, включая 2x среду Indo-1, изготовленную на шаге 2.2. Убедитесь, что клетки находятся в концентрации от 5-6 x 106 / мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не окрашивайте неокрашенные одиночные пятна или поверхностные маркеры с одиночными пятнами с помощью Indo-1. Добавление Indo-1 к контролю антител с одним окрашиванием создаст многоцветный образец из-за того, что Indo-1 добавлен к одиночным окрашенным клеткам. Включите индо-1 (без кальция) EGTA дополнительный контроль к планшету с образцом, созданному на шаге 2.6.
  5. Добавьте 1 мл клеток/лунки/экспериментального состояния в 12-луночную культуральную пластину.
  6. Создайте один окрашенный контроль для образца Indo-1 (без кальция), используя ранее загруженные красителем клетки Indo-1, и добавьте EGTA до конечной концентрации 2 мМ. EGTA хелатирует кальций в клеточной суспензии, давая более чистый контрольный образец.
    1. Создайте положительный контроль Indo-1 (связанный кальцием Indo-1), добавив 50 мкМ иономицина к клеточной суспензии, нагруженной красителем, на проточном цитометре. Иономицин представляет собой мембранопроницаемый ионофор кальция, который связывает ионы кальция и облегчает перенос ионов кальция в клетки.
  7. Создайте колодец для биологического негативного контроля без флуорофоров или красителя Indo-1.
  8. Создайте лунку для контроля одного окрашивания для любых дополнительных интересующих популяций клеток (антитела, определяемые пользователем), используя флуорофоры, конъюгированные антителами, в конструкции панели проточной цитометрии. Они не будут включать ратиометрический краситель Indo-1.
  9. Добавьте антитело, блокирующее Fc-рецептор (~ 2 мкг / 1 x 106 клеток) в соответствии с инструкциями производителя, прежде чем добавлять дополнительные флуорохром-конъюгированные антитела для окрашивания поверхности.
  10. Инкубируйте пластину в течение 45 минут при 37 °C с 5%CO2.
  11. Ресуспендируйте клетки в 12-луночную пластину, осторожно постукивая по пластине каждые 15 минут.
  12. Перемешайте и удалите весь объем ячеек, взвешенных в среде, с 12-луночной пластины. Затем добавьте клеточную суспензию в микроцентрифужные пробирки объемом 1,7 мл.
  13. Гранулируют клетки в микроцентрифуге при 500 x g в течение 5 мин при комнатной температуре. Сцедите надосадочную жидкость и промойте клетки, добавив 1 мл предварительно подогретого cRPMI. Снова гранулируйте и сцедите надосадочную жидкость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Промывание клеток удаляет все оставшиеся антитела, блокирующие FC.
  14. Ресуспендируют клетки в 1 мл cRPMI в микроцентрифужных пробирках объемом 1,7 мл и инкубируют каждую пробирку при 37 ° C в течение дополнительных 30 мин при 5% CO2, оставляя верхнюю часть пробирки слегка открытой, чтобы обеспечить газообмен. Это позволяет полностью деэтерификовать внутриклеточные эфиры AM.
  15. При необходимости перенесите клетки обратно в 12-луночную тарелку для культивирования тканей. Дополнительные определяемые пользователем титрованные флюорохром-конъюгированные антитела могут быть добавлены в фазе покоя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Маркеры, используемые на панели методов, включают: Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 и тетрамер CD1d/α-galcer. Маркеры выбираются для анализа подмножеств Т-клеток.
    1. Создайте основную смесь всех определяемых пользователем флуорохром-конъюгированных антител в соответствии с интересующими типами клеток в предварительно титрованном объеме в микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл.
    2. Добавьте рассчитанную мастер-смесь для 1 мл объема клетки, в зависимости от титруемых антител к покоящимся клеткам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Преимущество окрашивания на шаге 2.15 по сравнению с более поздним этапом 2.18 заключается в том, что окрашивание на шаге 2.15 уменьшит общее время инкубации для эксперимента. Однако окрашивание в общем объеме 1 мл на этапе 2.15 увеличивает использование антител.
  16. После отдыха гранулируйте клетки в 500 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки в 12-луночной пластине для культивирования тканей могут быть гранулированы в пластине с помощью пластинчатой центрифуги. В противном случае гранулируйте клетки в микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл.
  17. Промойте клетки, ресуспендировав гранулы в 1 мл при температуре 4 °C при холодной температуре cRPMI, и снова гранулируйте клетки, как показано на шаге 2.16. Поместите клетки на лед.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если поверхностное окрашивание клеток отдельно, после деэтерификации на этапе 2.18, требуется меньший объем антитела. Поверхностное окрашивание на этом этапе может быть выполнено после фазы покоя в буфере холодного потока (1x DPBS с добавлением 1% FBS) с использованием определяемых пользователем антител на льду в течение 30 минут. Промойте клетки после пятна в cRPMI, как показано на шаге 2.17.
    1. Добавляйте в образцы жизнеспособное пятно Ghost540, разбавленное в соотношении 1:7,500 в DPBS в соответствии с инструкциями производителя. Тепло убивает ячейки при 55 ° C на нагревательном блоке для контроля одиночного окрашивания живого / мертвого цвета.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Функциональное окрашивание красителем жизнеспособности для удаления мертвых клеток в проточном цитометрическом анализе проводится без FBS. FBS может взаимодействовать с аминовыми красителями в соответствии с инструкциями производителя.
  18. Повторно суспендировать отдельные образцы в 500 мкл cRPMI (без фенола красного) с помощью проточной трубки из полистирола объемом 5 мл с крышкой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки можно оставлять при температуре 4 °C на срок до часа.
  19. Нагревайте каждую пробирку объемом 5 мл, содержащую клетки, индивидуально, до 37 ° C с помощью ванны с шариками в течение 7 минут перед анализом на проточном цитометре, сохраняя время между образцами. Используйте таймер.

3. Трубка для ванны с шариками: поддержание температуры во время анализа потока кальция

  1. Добавьте шарики для ванны на небольшую водяную баню без добавления воды; прогреть до 37 °C.
  2. Аккуратно разрежьте лезвием бритвы коническую трубку объемом 50 мл пополам на отметке 25 мл; Выбросьте верхнюю часть трубки.
  3. Заполните разрезанную пополам трубку на 3/4 пути бусинами для ванны.
  4. Поместите трубку, созданную на шаге 3.2, в ванну с шариками, созданную на шаге 3.1. Доведите тюбик и бусины до 37 °C.
  5. Подключите ванну с шариками к электрической розетке рядом с проточным цитометром, чтобы поддерживать температуру при подготовке к анализу образца.
  6. Добавьте коническую стойку из пенополистирола объемом 50 мл, чтобы удерживать одну пробирку, чтобы расположить пробирку на месте во время работы на проточном цитометре. Это избавит от необходимости вручную удерживать трубку в течение всего времени анализа кривой.

4. Получение кальциевого притока с помощью проточного цитометрического анализа

  1. Войдите в программное обеспечение проточного цитометра на анализаторе потока.
  2. Перейдите на вкладку «Библиотека », чтобы добавить флуоресцентные теги Indo-1 (связанный с кальцием) и Indo-1 (без кальция). Выберите «Флуоресцентные метки » в меню программного обеспечения слева. Выберите УФ-лазер в разделе «Группы флуоресцентных тегов» и нажмите «+добавить », чтобы добавить имя флуоресцентной метки (Indo-1 (связанный с кальцием)/Indo-1 (без кальция)) в библиотеку. Выберите длину волны лазерного возбуждения и длину волны излучения, а затем нажмите «Сохранить». Перейдите к экспериментальной установке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Indo-1 возбуждается УФ-лазером на длине волны 355 нм. Длина волны излучения Indo-1 (связанная с кальцием) составляет 372 нм. Длина волны излучения Indo-1 (без кальция) составляет 514 нм.
  3. Перейдите на вкладку «Приобретение». Откройте/создайте новый эксперимент и добавьте в него нужные флуоресцентные метки.
  4. Создайте референтную группу и новые группы образцов для эксперимента. При необходимости пометьте как образцы, так и референсные группы.
  5. На вкладке «Приобретения» установите для записи событий максимум: 10 000 000.
  6. Установите максимальную громкость остановки: 3 000 мкл.
  7. Установите максимальное время остановки: 36 000 с.
  8. Приобретите одиночные окрашенные контрольные группы для определенных конъюгированных антител, включенных в многоцветную панель.
  9. Приобретите одиночный окрашенный контроль для функционального красителя Indo-1.
    1. Добавьте 50 мкМ иономицина к положительному контролю Indo-1, связанному с кальцием. Вихрь перемешать. Добавьте проточную трубку в порт впрыска образца и нажмите «Запись».
    2. Добавьте отрицательный контроль Indo-1 без кальция в проточный цитометр и нажмите « Запись». EGTA был добавлен на шаге 2.6.
    3. Размешивайте одиночные окрашенные элементы управления, нажав кнопку «Разъединить ».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все одиночные окрашенные контрольные элементы из всех конъюгированных антител и функциональных красителей должны быть зарегистрированы до смешивания образцов. Чтобы кнопка «Отменить микширование» функционировала, сначала необходимо записать все эталонные элементы управления. Разминирование может быть выполнено до или после отбора пробы.
  10. После завершения смешивания создайте последовательные графики с помощью несмешанного листа. SSC-A в сравнении с FSC-A, удаляющим мусор из образца, SSC-A в сравнении с SSC-H для удаления дублетов. За этим следуют ворота для очистки жизнеспособности, а также дальнейшее закрытие популяций, представляющих интерес. Чтобы создать ворота, нажмите на Участок. Добавьте график на лист и дважды щелкните внутри ворот, чтобы создать закрытое население, расположенное ниже по течению. Продолжайте до тех пор, пока не будут учтены все интересующие группы населения.
  11. Теплые одноразовые окрашенные контрольные образцы (от этапов 2.6-2.9 в секции Indo-1 ратиометрическая маркировка красителя и флуоресцентных антител) до 37 °C для последовательного анализа. Настройте программное обеспечение для проточной цитометрии.
  12. Нанесите деионизированную воду на цитометр в течение 2-3 минут, чтобы обеспечить жидкостную стабильность проточного цитометра.
  13. Настройте последовательные графики на несмешанном листе, создав ворота с помощью кнопок «Многоугольник», «Прямоугольник» или «Эллипс». Гейт для включения интересующей популяции (т.е. лимфоцитов, использующих SSC-A против FSC-A [различение по размеру/лимфоцитам]). Отрицательные популяции, по-видимому, сгруппированы вокруг нуля, тогда как положительные популяции можно визуализировать, увеличив MFI. Интересующие популяции будут определены пользователем на основе биологического вопроса.
  14. Дважды щелкните внутри созданного затвора и измените параметры осей Y и X на SSC-A против SSC-H (синглетная дискриминация). Завершите определение параметров оси, щелкнув левой кнопкой мыши по словам на оси.
  15. Создайте график с сигналом SSC-A в зависимости от жизнеспособности красителя (параметры затвора жизнеспособности). Ворота на живых клетках, которые отрицательны для окрашивания аминовым красителем. Живые клетки, отрицательные для окрашивания живыми мертвецами, будут группироваться на отметке 0 по осям Y и X.
  16. Дважды щелкните внутренний график, чтобы создать новый график, содержащий только одноклеточные живые лимфоциты. Измените ось Y на Indo-1 (связанный кальций) (V1) и/или Indo-1 (свободный кальций) (V7) в зависимости от времени на оси X для визуализации притока кальция.
  17. Поместите нагретый биологический образец в аппарат SIT и запустите образцы со скоростью 2,500-3,000 событий / с на среде, чтобы можно было визуализировать приток кальция в популяциях с ограниченным количеством клеток (например, iNKT).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При ресуспендировании клеток в концентрации 1 x 106 / мл клеточные события, собранные со скоростью потока среды, должны быть равны 2,500-3,000 событий / с. Уменьшите расход при контроле сбора, щелкнув раскрывающееся меню, или разбавьте образец, если суспензия ячейки имеет повышенную концентрацию. Запуск образцов с высокой скоростью потока может увеличить распространение сигнала от одного флуорофора к другим флуорофорам в панели.
  18. Добавьте следующую трубку в ванну с шариками, чтобы она нагрелась до 37 °C.
  19. В контроле сбора данных нажмите кнопку Запись, чтобы записать исходные данные в течение 30 с, чтобы получить базальный уровень кальциевой сигнализации в образце.
  20. В окне «Контроль сбора» нажмите «Стоп» и извлеките пробирку из порта впрыска образца (SIP).
  21. Добавьте 30 мкг неконъюгированного анти-CD3 непосредственно в пробирку для образца, чтобы инициировать приток кальция. Конечная концентрация на пробирку составляет 60 мкг/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После добавления анти-CD3 этап промывки не производится.
  22. Как можно быстрее поместите трубку обратно в SIP машины и нажмите «Запись» в программном обеспечении.
  23. Записывайте данные в течение 7 минут, наблюдая за временем, прошедшим под контролем сбора данных в программном обеспечении, чтобы наблюдать за временным ходом притока кальция в выборочных популяциях.
  24. Через 7 минут нажмите «Стоп» в программном обеспечении и добавьте 1 мкг/мл иономицина. Запись в течение 30 с для получения максимального кальциевого сигнала в интересующих клетках. Чтобы ограничить перенос иономицина в следующий образец, выполните две промывки SIT на приборе между образцами.
  25. Перейдите к следующему образцу и повторяйте рабочий процесс, пока не будут собраны все образцы.
  26. Сохраните эксперимент и нажмите на экспортный zip-файл. Несмешанные файлы (.fsc) загружаются во внешнее программное обеспечение для анализа проточной цитометрии.

5. Анализ кальциевой кривой

  1. Используя аналитическое программное обеспечение6 для проточной цитометрии, преобразуйте флуоресцентные сигналы Indo-1 в соотношение для покадровых измерений кальция. Выведите параметры на вкладке «Инструменты», вставив ссылки Indo-1 (связанный с кальцием)/Indo-1 (свободный кальций) с помощью линейной шкалы. Установите минимум на ноль и максимум в соответствии с соотношением притока кальция, обычно около 10. Максимальное соотношение зависит от типа ячейки и MFI Indo-1.
  2. Выделите выбранный параметр. В разделе «Инструменты» добавьте кинетический анализ, чтобы выбрать параметр, щелкнув вкладку « Кинетика ». Установите для оси Y значение производное.
  3. Выберите MFI (средняя интенсивность флуоресценции) на вкладке «Кинетика».
  4. При желании добавьте гауссово сглаживание. Чтобы добавить гауссово сглаживание, выберите этот параметр в выпадающем меню статистики в программном обеспечении для анализа потока. Гауссово сглаживание может быть добавлено для сглаживания визуализации кривой притока кальция при анализе.
  5. Создайте несколько диапазонов для статистики по временному ходу потока кальция для биологических сравнений в образцах.
  6. Перетащите образцы в редактор макетов и добавьте статистику по своему усмотрению. Статистический анализ варьируется в зависимости от биологического вопроса. Для целей публикации множественные реплики анализируются с использованием t-критерия или ANOVA.
  7. Для анализа времени установите затвор на определенный момент времени вдоль потока кальция. Изучите желаемые поверхностные маркеры и ворота на интересующей популяции; затем оцените двумерный точечный график Indo-1 (без кальция) по сравнению с Indo-1 (связанный с кальцием) для закрытых клеток в этот момент в области времени.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Экспериментальный рабочий процесс оценки кальциевых реакций в первичных мышиных Т-клетках с использованием ратиометрического красителя Indo-1 с мультиплексирующими поверхностными пятнами показан на рисунке 1. После сбора и обработки спленоцитов мыши в одноклеточную суспензию клетки окрашивают эфиром Indo-1 AM и окрашивают поверхность антителами, связанными с флуорохромом. После завершения загрузки красителя и окрашивания антител образцы лимфоцитов нагревают до биологической температуры (37 °...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом протоколе описывается оптимизированный анализ, предназначенный для измерения кальциевых реакций в первичных мышиных Т-клетках, загруженных титрованным индикаторным красителем Indo-1 ratiometric, с использованием проточной цитометрииполного спектра 7,8. Преимуществом проведения анализов потока кальция с использованием проточной цитометрии полного спектра является возможность мультиплексного окрашивания поверхностных клеточных маркеров в сочетании с оценкой ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конкурирующих интересов, о которых можно было бы заявить.

Благодарности

R01AI132419, CU | Общий ресурс AMC ImmunoMicro Flow Cytometry, RRID:SCR_021321, Большое спасибо нашим коллегам из Cytek за постоянные обсуждения полного спектрального цитометрического анализа в программном обеспечении Aurora и SpectroFlo. Фигуры были созданы с помощью BioRender.com.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
12 лунок обработанные TC планшетыCell Treat229111
50 мл коническийGreiner Bio141-12-17-0350 мл полипропиленовые центрифужные пробирки с крышкой
5 мл полиэфирные проточные трубкиCorning352052
шприц 5 мл шприцBD309646используется только поршень sheith отбрасывается
70 мкМ фильтрGreiner bio1542070
aCD3 (17A2)Biolegend100202
AKC лизис буферGibcoA1049201
Aurora Spectral Flowcytometerhttps://cytekbio.com/pages/aurora
Bath BeadscoleparmerАртикул # UX-06274-52
CD19 PETonbo50-0193-U100
CD1d Tetramer APCNIH
CD25 PECy7ebioscience15-0251
CD4 APC Cy7Tonbo25-0042-U100
CD8a FITCebioscience11-0081-85
Клеточный инкубаторФормальные научные
инструменты для вскрытия ЩипцыMcKesson#487593Тканевые щипцы McKesson Adson 4-3/4 дюйма длины офисного класса нержавеющая сталь нестерильная неблокирующая ручка для большого пальца 1 x 2 зуба
инструменты для пресечения ножницыMcKesson# 970135Операционные ножницы McKesson Argent™ 4-1/2 дюйма хирургическая нержавеющая сталь для пальца кольцо ручка прямой острый наконечник / острый наконечник
DPBS 1xGibco14190-136DPBS 
EGTAFisherNC1280093
FBSHyclondSH30071.03лот AE29165301
FlowJo Softwarehttps://www.flowjo.com/
Indo1-AM Ester Dyeebioscience65-085-39Кальциевая загрузка красителя 
иономицинMillipore407951-1mg
Live/Dead Ghost 540Tonbo13-0879-T100
Микроцентрифужные пробирки 1,7 млLight LabsA-7001
Пенициллин/стрептомицин/L-глутаминGibco10378-016
PRN694Med Chem ExpressHy-12688
Очищенный антимышиный CD16/CD32 (FC Shield) ( 2.4G2)Tonbo70-0161-M001FC Блок
RPMIGibco1875093 + фенол красный
RPMI фенол свободныйGibco11835030 -феноловый красный
Настольная центрифугаBeckman CoulterAllegra612
TCRβ PerCP Cy5.5ebioscience45-5961-82
TCRγ/δ Pe Cy5ebioscience15-5961-82
Vi-Cell Blu Reagent PackНомер продукта: C06019включает Tripan
Vi-Cell BluBeckman Coulter
водяная баняFisher Brand Сухая ванна

Ссылки

  1. Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).
  2. Huang, G. N. Cell calcium mobilization study (flow cytometry). Bio-Protocol. 2 (9), 171(2012).
  3. June, C. H., Moore, J. S. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. , Chapter 5, Unit 5.5 (2004).
  4. Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).
  5. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  6. McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).
  7. Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit1.27 (2013).
  8. Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801(2021).
  9. Zhong, Y., et al. Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694. The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).
  10. Gallagher, M. P., et al. Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118(2021).
  11. Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287(2010).
  12. Nakamura, Y. EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels. Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26(2019).
  13. Cytek Aurora Users Guide. Cytek. , Available from: https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf (2022).
  14. SpctroFlo Software. Cytek. , Available from: https://cytekbio.com/pages/spectro-flo (2022).
  15. FlowJo Software. Becton-Dickinson. , Available from: https://www.flowjo.com/solutions/flowjo (2022).
  16. Godfrey, D. I., Zlotnik, A. Control points in early T-cell development. Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).
  17. Vossen, A. C., et al. Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects. European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Приток кальция в Т-клеткахкальциевый индикаторный красительокрашивание Indo-1стимуляция анти-CD3анализ потока кальциямаркеры клеточной поверхностимногоцветная проточная цитометриясубпопуляции Т-клеток
Анализ индуцированного Т-клеточными рецепторами притока кальция в первичных мышиных Т-клетках методом проточной цитометрии полного спектра
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.