Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Динамическая непрерывная экстракция крови из сердца крысы с помощью неинвазивного метода микродиализа

2.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64531

⸱

13 сентября 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Настоящий протокол описывает простой и эффективный метод динамического сбора крови сердца крысы в режиме реального времени с использованием метода микродиализа.

Аннотация

Динамический анализ компонентов крови имеет большое значение для понимания сердечно-сосудистых заболеваний и связанных с ними заболеваний, таких как инфаркт миокарда, аритмия, атеросклероз, кардиогенный отек легких, тромбоэмболия легочной артерии и церебральная эмболия. В то же время необходимо срочно прорваться через метод непрерывного забора сердечной крови у живых крыс, чтобы оценить эффективность терапии отличительной этнической медицины. В этом исследовании зонд для микродиализа крови был имплантирован в правую яремную вену крыс в точной и неинвазивной хирургической процедуре. Затем образцы сердечной крови собирали со скоростью от 2,87 нл/мин до 2,98 мл/мин путем подключения к онлайн-системе сбора образцов микродиализа. Еще важнее то, что полученные образцы крови могут временно храниться в контейнерах для микродиализа при температуре 4 °C. Основанная на микродиализе онлайн-программа непрерывного сбора крови из сердца крысы в значительной степени гарантировала качество образцов крови, продвигая и укрепляя научную рациональность исследований системных сердечно-сосудистых заболеваний и оценивая этномедицинскую терапию с точки зрения гематологии.

Введение

С ускорением темпа жизни и повышением психологического давления сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ), как правило, возникают у молодых, средних и пожилых людей 1,2. Заболеваемость и смертность от ССЗ высокие, с особенностями острого начала, быстрого прогрессирования и длительного течения заболевания, что серьезно влияет на безопасность пациентов3. Возникновение сердечно-сосудистых заболеваний может быть тесно связано с изменениями некоторых компонентов крови, таких как холестерин, липиды сыворотки крови, глюкоза крови, ферменты миокарда и протеинкиназыК4,5,6. Соответствующая ситуация пациента может быть решена наиболее быстро, проанализировав обычные пункты анализа крови. Следовательно, качество образцов крови определяет точность результатов теста. Однако традиционные методы забора крови имеют некоторые неизбежные недостатки, которые серьезно влияют на результаты эксперимента, такие как большая площадь травмы, малый объем забора крови, высокие требования к операторам, неспособность отражать изменения лекарств в режиме реального времени, громоздкая предварительная обработка образцов крови, большое потребление экспериментальных животных и несоблюдение этических требований животных 7,8,9 . Благодаря постоянному прогрессу в области медицинских технологий качество сбора крови также выдвигает более высокие требования. Поэтому необходимо срочно разработать новую технологию забора крови для преодоления вышеуказанных недостатков.

Микродиализ - это метод отбора проб in vivo, основанный на принципах диализа10. В неравновесных условиях измеряемые соединения диффундируют и перфузируются из ткани вдоль градиента концентрации в микродиализный зонд, встроенный в ткань, в диализат, который непрерывно удаляется вместе с диализатом, достигая цели отбора проб из живой ткани11,12. По сравнению с традиционными методами отбора проб метод микродиализа имеет великолепные преимущества в следующих аспектах13,14,15: непрерывное отслеживание изменений различных соединений в крови в режиме реального времени; отбор проб не требует утомительной предварительной обработки и может реально отражать концентрацию целевого соединения в месте отбора проб; зонды могут быть имплантированы в различные части тела для исследования поглощения, распределения, метаболизма, экскреции и токсичности целевых соединений; полученный образец не содержит биологических макромолекул (>20 кДа). Таким образом, более качественные образцы крови обеспечивают лучшую интерпретацию сердечно-сосудистых заболеваний и механизма, который лечится этнической медициной.

Микродиализные пробоотборные системы обычно состоят из микроинжекционных насосов, соединительных трубок, резервуаров для перемещения животных, микродиализных зондов и пробоотборников16. Являясь наиболее важной частью устройства системы микродиализа, обычные микродиализные зонды включают концентрические зонды, гибкие зонды, линейные зонды и шунтирующий зонд17. Среди них гибкие зонды представляют собой мягкие и неметаллические зонды, которые в основном используются для сбора образцов из кровеносных сосудов и периферических тканей, таких как сердце, мышцы, кожа и жир, бодрствующих и свободно движущихся или анестезированных животных13. При контакте с кровеносными сосудами или тканями зонд можно гибко согнуть, что позволяет избежать необратимого повреждения зонда или места отбора проб. С непрерывным развитием зондовых технологий применение технологии микродиализа в различных областях также углубляется. В этой статье кровь сердца крысы была динамически и непрерывно получена с помощью технологии неинвазивного микродиализа с помощью гибкого зонда, предназначенного для сбора крови.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протокол для животных был одобрен Административным комитетом Университета традиционной китайской медицины Чэнду (номер записи: 2021-11). Указанные свободные от патогенов крысы Sprague Dawley (SD) (8-10 недель, 260-300 г) были выращены в независимых вентиляционных клетках, поддерживая лабораторную среду при температуре 22 ° C и относительной влажности 65%, и были использованы для настоящего исследования. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). Все крысы были приучены к адаптивному кормлению в течение 1 недели со свободной водой и диетой в течение периода.

1. Экспериментальная подготовка

  1. Соберите оборудование, участвующее в микродиализе забора крови (см. Таблицу материалов), как показано на рисунке 1.
  2. В качестве перфузионной жидкости для забора крови при микродиализе готовят раствор декстрозы цитрата антикоагулянтного цитрата, содержащий 3,50 ммоль/л цитрата натрия, 7,50 ммоль/л цитрата натрия и 13,60 ммоль/л глюкозы (см. Таблицу материалов).
  3. Перед использованием отфильтруйте АКД с помощью мембранной фильтрующей установки 0,22 мкм и удалите пузырьки ультразвуковым способом. Держите ACD при 37 ° C, чтобы уменьшить стимуляцию крыс SD.

2. Проверка проходимости системы трубопроводов микродиализа

  1. Присоедините входное отверстие зонда диализного блока с иглой шприца, адаптером трубки и трубкой fep (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Синий конец зонда микродиализа предназначен для притока жидкости, а прозрачный конец - для оттока жидкости.
  2. Проверьте проходимость системы трубопроводов микродиализа путем перфузии ACD18 в систему трубопроводов со скоростью 2 мкл / мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если ACD вытекает из места сбора образцов, для дальнейшего сбора сердечной крови можно использовать беспрепятственную систему микродиализа. Если нет, необходимо проверить датчик крови на наличие нарушенных утечек или герметичность соединения трубы с трубой.

3. Имплантация микродиализного зонда

  1. Обезболивают крыс 2% изофлураном в воздушно-кислородной смеси 0,6 л/мин, прикрепляют крыс без сознания к операционному столу и поддерживают температуру тела на уровне 37 °C с помощью средства поддержания температуры животных (см. Таблицу материалов).
  2. Удалите мех с шеи электробритвой и продезинфицируйте место операции тремя чередующимися раундами бетадина и 70% спирта. Вводят крысе бупивакаин (1,5 мг/кг). Обнажают правую яремную вену путем тупого рассечения мягких тканей и периваскулярной фасции через разрез 1,5 см по средней линии шеи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические инструменты и инструменты, используемые в эксперименте, должны быть заранее стерилизованы автоклавированием. Используйте стерильные перчатки и хирургические простыни. Вся экспериментальная операция должна проводиться в стерильной среде. Следуйте местным рекомендациям по использованию животных для режима анестезии и обезболивания.
  3. Сделайте съемный скользящий узел, используя хирургический шов 4-0 в правой яремной вене на дистальном конце сердца, чтобы временно заблокировать кровоток, и сделайте разрез 1,5 см в правой яремной вене рядом с сердцем.
  4. Ввести игольчатый катетерный стилет (длина 25 мм, диаметр 0,7 мм, см. Таблицу материалов) в правую яремную вену по направлению к проксимальному концу сердца крысы, ввести зонд для микродиализа крови (общая длина зонда 24 мм, длина мембраны 10 мм) в катетер и имплантировать зонд глазными щипцами вдоль косого разреза катетерного стилета19.
  5. Извлеките направленный катетер-стилет и полностью погрузите полупроницаемую мембрану зонда (длина мембраны 10 мм, диаметр мембраны 0,5 мм) в правую яремную вену. Распутайте съемный узел на дистальном конце сердца, чтобы восстановить кровоток в правой яремной вене.
  6. Свяжите зонд с правой яремной веной с помощью хирургических швов 4-0 и подкожно проденьте хвостовую трубку зонда через заднюю часть шеи. На рисунке 2 показаны конкретные этапы имплантации зонда.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Молекулярная отсечка зондом для микродиализа крови, используемым в этом исследовании, составляет >20 кДа. Собранные образцы крови содержат вещества с молекулярной массой менее 20 кДа.

4. Микродиализный отбор проб

  1. Через неделю после имплантации микродиализного зонда крысы, выздоравливающие после хирургической травмы, проходят микродиализный отбор проб. Поместите бодрствующую крысу в свободно движущийся резервуар (см. Таблицу материалов) и подключите зонд к системе микродиализа. Уравновесьте зондовую диализную мембрану, орошая ACD со скоростью 2 мкл / мин в течение 1 часа.
  2. Соберите образцы крови для микродиализа со скоростью потока 2 мкл / мин и временно храните их во фракционном контейнере с температурой 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полученные образцы крови могут быть проверены непосредственно центрифугированием при 20 000 x g в течение 10 минут при комнатной температуре. Или его можно хранить при -80 ° C для следующего тестирования. При сборе образцов важно всегда следить за тем, не выпадает ли зонд и/или не вытекает ли он наружу.

5. Операция после отбора проб

  1. Обезболивают крыс SD 2% изофлураном в воздушно-кислородной смеси со скоростью 0,6 л/мин.
  2. Препарируйте, чтобы еще раз подтвердить, что зонд находится в правой яремной вене. Извлеките микродиализный зонд из правой яремной вены и поместите его в сверхчистую воду.
  3. Наконец, усыпляют крыс путем вдыхания 5% изофлурана.
  4. Подключите зонд к трубопроводу и промойте в течение ночи со скоростью 2 мкл / мин сверхчистой водой, чтобы полностью смыть остатки соли в трубе и зонде.
  5. Извлеките зонд и замочите его в сверхчистой воде. Хранить при температуре 4 °C, чтобы предотвратить сокращение диализной мембраны зонда.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если объем диализирующей жидкости не соответствует объему перфузионной жидкости, зонд может быть заблокирован свернувшейся кровью. Зонд может быть помещен в раствор белка поджелудочной железы до тех пор, пока видимое вещество не отслоится от кончика мембраны зонда.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Настоящий протокол позволил получить сердечную кровь от крыс, находящихся в сознании, в соответствии с параметрами отбора проб, установленными в микродиализном оборудовании. Нормальные образцы крови должны быть ярко-красными, в то время как животные с гипоксией, потенциальными сгустками крови или анемическим заболеванием могут иметь темно-фиолетовый или темно-красный цвет. Образцы, полученные с помощью метода микродиализа крови, бесцветны, прозрачны и прозрачны, что может быть использовано для анализа сывороточных маркер...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

ССЗ являются распространенным хроническим заболеванием в клиниках с постепенно растущей заболеваемостью в Китае, а возраст начала имеет тенденцию быть моложе, вызывая беспокойство и панику у большинства пациентов20,21. Будучи основной причиной смерти в мире, сердечно-сосудистые заболевания могут вызывать инфаркт головного мозга и другие заболевания с высокой смертностью, серьезно угрожая здоровой жизни пациентов22. Сердечно-сосудистые забо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам раскрывать нечего.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82104533), Китайским фондом постдокторантуры (2020M683273), Департаментом науки и технологий провинции Сычуань (2021YJ0175) и ключевым научно-исследовательским проектом Научно-технического плана провинции Сычуань (2022YFS0438). Между тем, авторы хотели бы поблагодарить г-на Юньчэн Хонга, старшего инженера по оборудованию в TRI-ANGELS D&H TRADING PTE. LTD. (г. Сингапур, Сингапур), за предоставление технических услуг по методам микродиализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Система анестезии для животныхRayward Life Technology Co., LtdR500IE
Устройство для поддержания температуры животныхRayward Life Technology Co., Ltd69020
Зонд для микродиализа крови  Катетер для микродиализа CMA ABT55347
  CMA Microdialysis ABT55347
ЦитратMerck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd251275
ЭлектробритваRayward Life Technology Co., LtdCP-5200
Fep трубка  CMA Microdialysis AB3409501
Бак для животных со свободным перемещением  CMA Microdialysis ABCMA120
GlucoseMerck Chemical Technology (Shanghai) Co., LtdG8270
Гемостатические щипцыRayward Life Technology Co., LtdF21020-16
IsofluranRayward Life Technology Co., LtdR510-22
МикроножницыBeyotime Biotechnology Co., LtdFS221
Микродиализ Коллекционный тубус  CMA Microdialysis AB7431100
Микродиализный коллектор  CMA Microdialysis ABCMA4004
Микродиализ in vitro stand  CMA Microdialysis ABCMA130
Микродиализный микроинъекционный насос  CMA Microdialysis AB788130
Шприц для микродиализа (1,0 мл) CMA Microdialysis AB8309020
адаптер для трубки для микродиализа  CMA Microdialysis AB3409500
Микропористая фильтрующая мембранаMerck Millipore Ltd.
Нерассасывающиеся хирургические шовные материалыShanghai Tianqing Biological Materials Co., LtdS19004
Операционный столYuyan Scientific Instrument Co., Ltd30153
Офтальмологические щипцыRayward Life Technology Co., LtdF12016-15
Цитрат натрияMerck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd 1613859
Спрэг Доули  (SD) крысыChengdu Dossy Experimental Animals Co., LtdSYXK(figure-materials-1)2019-049
Хирургические ножницыRayward Life Technology Co., LtdS14014-15
Хирургические ножницыShanghai Bingyu Fluid technology Co., LtdBY-103
Игла для шприца  CMA Microdialysis ABT55347
Ультразвуковой очистительGuangdong Goote Ultrasonic Co., LtdKMH1-240W8101
R0DB36622

Ссылки

  1. van Rensburg, W. J. J. Post-mortem evidence of a diverse distribution pattern of atherosclerosis in the South African population. Scientific Reports. 12 (1), 11366(2022).
  2. Katz, A. J., Chen, R. C., Usinger, D. S., Danus, S. M., Zullig, L. L. Cardiovascular disease prevention and management of pre-existent cardiovascular disease in a cohort of prostate cancer survivors. Journal of Cancer Survivorship. , (2022).
  3. Rødevand, L., Tesli, M., Andreassen, O. A. Cardiovascular disease risk in people with severe mental disorders: an update and call for action. Current Opinion in Psychiatry. 35 (4), 277-284 (2022).
  4. Izumi, Y., et al. Impact of circulating cathepsin K on the coronary calcification and the clinical outcome in chronic kidney disease patients. Heart and Vessels. 31 (1), 6-14 (2016).
  5. Wang, K., et al. Whey protein hydrolysate alleviated atherosclerosis and hepatic steatosis by regulating lipid metabolism in apoE-/- mice fed a Western diet. Food Research International. 157, 111419(2022).
  6. Angelone, T., Rocca, C., Pasqua, T. Nesfatin-1 in cardiovascular orchestration: From bench to bedside. Pharmacological Research. 156, 104766(2020).
  7. Bernardi, P. M., Barreto, F., Dalla Costa, T. Application of a LC-MS/MS method for evaluating lung penetration of tobramycin in rats by microdialysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 134, 340-345 (2017).
  8. Anderzhanova, E., Wotjak, C. T. Brain microdialysis and its applications in experimental neurochemistry. Cell and Tissue Research. 354 (1), 27-39 (2013).
  9. Joukhadar, C., Müller, M. Microdialysis: current applications in clinical pharmacokinetic studies and its potential role in the future. Clinical Pharmacokinetics. 44 (9), 895-913 (2005).
  10. Stangler, L. A., et al. Microdialysis and microperfusion electrodes in neurologic disease monitoring. Fluids and Barriers of the CNS. 18 (1), 52(2021).
  11. Young, B., et al. Cerebral microdialysis. Critical Care Nursing Clinics of North America. 28 (1), 109-124 (2016).
  12. O'Connell, M. T., Krejci, J. Microdialysis techniques and microdialysis-based patient-near diagnostics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 414 (10), 3165-3175 (2022).
  13. Hammarlund-Udenaes, M. Microdialysis as an important technique in systems pharmacology-a historical and methodological review. The AAPS Journal. 19 (5), 1294-1303 (2017).
  14. Stahl, M., Bouw, R., Jackson, A., Pay, V. Human microdialysis. Current Pharmaceutical Biotechnology. 3 (2), 165-178 (2002).
  15. Pierce, C. F., Kwasnicki, A., Lakka, S. S., Engelhard, H. H. Cerebral microdialysis as a tool for assessing the delivery of chemotherapy in brain tumor patients. World Neurosurgery. 145, 187-196 (2021).
  16. Sørensen, M., Jacobsen, S., Petersen, L. Microdialysis in equine research: a review of clinical and experimental findings. Veterinary Journal. 197 (3), 553-559 (2013).
  17. Dmitrieva, N., Rodríguez-Malaver, A. J., Pérez, J., Hernández, L. Differential release of neurotransmitters from superficial and deep layers of the dorsal horn in response to acute noxious stimulation and inflammation of the rat paw. European Journal of Pain. 8 (3), 245-252 (2004).
  18. Li, T., et al. Microdialysis sampling and HPLC-MS/MS quantification of sinomenine, ligustrazine, gabapentin, paracetamol, pregabalin and amitriptyline in rat blood and brain extracellular fluid. Acta Pharmaceutica Sinica. 55 (9), 2198-2206 (2020).
  19. Chauzy, A., Lamarche, I., Adier, C., Couet, W., Marchand, S. Microdialysis study of Aztreonam-Avibactam distribution in peritoneal fluid and muscle of rats with or without experimental peritonitis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (10), 01228(2018).
  20. Fang, X. X., Ardehali, H., Min, J. X., Wang, F. D. The molecular and metabolic landscape of iron and ferroptosis in cardiovascular disease. Nature Reviews. Cardiology. , 1-17 (2022).
  21. Samson, R., Ennezat, P. V., Le Jemtel, T. H., Oparil, S. Cardiovascular disease risk reduction and body mass index. Current Hypertension Reports. , (2022).
  22. Kim, M. H., et al. School racial segregation and long-term cardiovascular health among Black adults in the US: A quasi-experimental study. PLoS Medicine. 19 (6), 1004031(2022).
  23. Qin, Y. H., et al. Role of m6A RNA methylation in cardiovascular disease (Review). International Journal of Molecular Medicine. 46 (6), 1958-1972 (2020).
  24. Xu, C. M., Liu, C. J., Xiong, J. H., Yu, J. Cardiovascular aspects of the (pro)renin receptor: Function and significance. FASEB Journal. 36 (4), 22237(2022).
  25. Guvenc-Bayram, G., Yalcin, M. The intermediary role of the central cyclooxygenase / lipoxygenase enzymes in intracerebroventricular injected nesfatin-1-evoked cardiovascular effects in rats. Neuroscience Letters. 756, 135961(2021).
  26. Ahrens Kress, A. P., Zhang, Y. D., Kaiser-Vry, A. R., Sauer, M. B. A comparison of blood collection techniques in mice and their effects on welfare. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 61 (3), 287-295 (2022).
  27. Joshi, A., Patel, H., Joshi, A., Stagni, G. Pharmacokinetic applications of cutaneous microdialysis: Continuous+intermittent vs continuous-only sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 83, 16-20 (2017).
  28. Reyes-Garcés, N., et al. In vivo brain sampling using a microextraction probe reveals metabolic changes in rodents after deep brain stimulation. Analytical Chemistry. 91 (15), 9875-9884 (2019).
  29. Kho, C. M., Enche Ab Rahim, S. K., Ahmad, Z. A., Abdullah, N. S. A review on microdialysis calibration methods: the theory and current related efforts. Molecular Neurobiology. 54 (5), 3506-3527 (2017).
  30. Zhuang, L. N., et al. Theory and application of microdialysis in pharmacokinetic studies. Current Drug Metabolism. 16 (10), 919-931 (2015).
  31. Zhang, Y. F., Huang, X. X., Zhu, L. X. Metabonomics research strategy based on microdialysis technique. China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (1), 214-220 (2020).
  32. Carpenter, K. L., Young, A. M., Hutchinson, P. J. Advanced monitoring in traumatic brain injury: microdialysis. Current Opinion in Critical Care. 23 (2), 103-109 (2017).
  33. Brunner, M., Langer, O. Microdialysis versus other techniques for the clinical assessment of in vivo tissue drug distribution. The AAPS Journal. 8 (2), 263-271 (2006).
  34. Tettey-Amlalo, R. N., Kanfer, I., Skinner, M. F., Benfeldt, E., Verbeeck, R. K. Application of dermal microdialysis for the evaluation of bioequivalence of a ketoprofen topical gel. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 36 (2-3), 219-225 (2009).
  35. Dhanani, J. A., et al. Recovery rates of combination antibiotic therapy using in vitro microdialysis simulating in vivo conditions. Journal of Pharmaceutical Analysis. 8 (6), 407-412 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Динамическая непрерывная экстракция крови из сердца крысы с помощью неинвазивного метода микродиализа
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.