Автоматизация анализа микроядер с помощью визуализационной проточной цитометрии и искусственного интеллекта

Summary

Анализ микроядра (MN) является хорошо зарекомендовавшим себя тестом для количественной оценки повреждения ДНК. Однако оценка анализа с использованием традиционных методов, таких как ручная микроскопия или анализ изображений на основе признаков, является трудоемкой и сложной. В этой статье описывается методология разработки модели искусственного интеллекта для оценки анализа MN с использованием данных проточной цитометрии визуализации.

Abstract

Анализ микроядра (MN) используется регулирующими органами во всем мире для оценки химических веществ на предмет генетической токсичности. Анализ может быть выполнен двумя способами: путем оценки MN в однажды разделенных, заблокированных цитокинезом бинуклеированных клетках или полностью разделенных моноядерных клетках. Исторически сложилось так, что световая микроскопия была золотым стандартом для оценки анализа, но она трудоемка и субъективна. Проточная цитометрия использовалась в последние годы для оценки анализа, но ограничена неспособностью визуально подтвердить ключевые аспекты клеточных изображений. Визуализирующая проточная цитометрия (IFC) сочетает в себе высокопроизводительный захват изображений и автоматический анализ изображений и успешно применяется для быстрого получения изображений и оценки всех ключевых событий в анализе MN. Недавно было продемонстрировано, что методы искусственного интеллекта (ИИ), основанные на сверточных нейронных сетях, могут быть использованы для оценки данных анализа MN, полученных IFC. В этом документе описываются все шаги по использованию программного обеспечения ИИ для создания модели глубокого обучения для оценки всех ключевых событий и применения этой модели для автоматической оценки дополнительных данных. Результаты модели глубокого обучения ИИ хорошо сравниваются с ручной микроскопией, что позволяет полностью автоматизировать оценку анализа MN путем объединения IFC и AI.

Introduction

Анализ микроядра (MN) имеет основополагающее значение в генетической токсикологии для оценки повреждения ДНК при разработке косметики, фармацевтических препаратов и химических веществ для использования человеком ^1,2,3,4. Микроядра образуются из целых хромосом или фрагментов хромосом, которые не включаются в ядро после деления и конденсируются в небольшие круглые тела, отделенные от ядра. Таким образом, MN можно использовать в качестве конечной точки для количественной оценки повреждения ДНК при тестировании на генотоксичность

Protocol

1. Сбор данных с помощью визуализирующей проточной цитометрии

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Rodrigues et ^al.16 со следующими изменениями, отмечая, что для оптимального захвата изображения, возможно, потребуется модифицировать области сбора данных с использованием IFC:

1. Для метода, отличного от Cyt-B, выполните подсчет клеток с использованием коммерчески доступного счетчика клеток, следуя инструкциям производителя (см. Таблицу материалов) на каждой культуре непосредственно перед культурой и сразу после периода восстановления.
2. При запуске образцов на проточном цитометре с одной ка....

Results

На рисунке 1 показан рабочий процесс использования программного обеспечения ИИ для создания модели для анализа MN. Пользователь загружает нужные файлы .daf в программное обеспечение ИИ, а затем назначает объекты классам наземных моделей истинности с помощью кластера с помощью ИИ (рис. 2) и алгоритмов прогнозирования (рис. 3). После того, как все классы наземных моделей будут заполнены достаточным количеством объектов, модель может б.......

Discussion

В представленной здесь работе описывается использование алгоритмов глубокого обучения для автоматизации скоринга анализа MN. Несколько недавних публикаций показали, что интуитивно понятные интерактивные инструменты позволяют создавать модели глубокого обучения для анализа данных изображений без необходимости глубоких вычислительных знаний^18,19. Протокол, описанный в этой работе с использованием программного пакета, управляемого пользовательским интерфейсом, был р.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Центрифужная пробирка 15 мл	Falcon	352096
Cleanser - Coulter Clenz	Beckman Coulter	8546931	Наполните контейнер 200 мл очищающего средства.  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
Colchicine	MilliporeSigma	64-86-8
Corning вакуумный фильтр на крышке бутылки	MilliporeSigma	CLS430769	0.22 &микро; m фильтр, 500 мл флакон
Цитохалазин B	MilliporeSigma	14930-96-2	5 мг флакон
Debubbler - 70% изопропанол	MilliporeSigma	1.3704	Наполните контейнер 200 мл Debubbler.  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
диметилсульфоксид (ДМСО)	MilliporeSigma	67-68-5
Фосфат Дульбекко буферизованный физиологический раствор 1X	EMD Millipore	BSS-1006-B	PBS Ca++MG++ Free
Фетальная бычья сыворотка	HyClone	SH30071.03
Формальдегид, 10%, без метанола, Ultra Pure	Polysciences, Inc.	04018	Это то, что используется для 4% и 1% формалина. ВНИМАНИЕ: Формалин/формальдегид токсичен при вдыхании и проглатывании. Раздражает глаза, дыхательную систему и кожу.  Может вызывать сенсибилизацию при вдыхании или контакте с кожей. Риск серьезного повреждения глаз. Потенциальная опасность рака.  http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Guava Muse Cell Analyzer	Luminex	0500-3115	Использовалась стандартная конфигурация Guava Muse Cell Analyzer.
Hoechst 33342	Thermo Fisher	H3570	10 мг/мл раствор
Mannitol	MilliporeSigma	69-65-8
MEM Заменимые аминокислоты 100X	HyClone	SH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark II	Luminex, a DiaSorin company	100220	A 2 камера ImageStreamX Mark II оснащена лазерами 405 нм, 488 нм и 642 нм.
Программное обеспечение для анализа MIFC - IDEAS	Luminex, a DiaSorin company	100220	"Image analysis sofware" Программное обеспечение-компаньон к программному обеспечению MIFC (ImageStreamX MKII)
MIFC - INSPIRE	Luminex, a DiaSorin company	100220	"Image acquisition software" Это программное обеспечение, которое работает под управлением программного обеспечения MIFC (ImageStreamX MKII)
Amnis AI	Luminex, a DiaSorin company	100221	Программное обеспечение для искусственного интеллекта" Это программное обеспечение, которое позволяет создавать модели искусственного интеллекта для анализа данных
Mitomycin C	MilliporeSigma	50-07-7
NEAA Mix 100x	Lonza BioWhittaker	13-114E
Раствор пениклена/стрептомицина/глютамина 100X	Gibco	15070063
хлорида калия (KCl)	Ополаскиватель MilliporeSigma	P9541
- Сверхчистая вода или деионизированная вода	NA	NA	Используйте любую сверхчистую воду или деионизированную воду. Наполните емкость 900 мл ополаскивателя.
РНКаза	MilliporeSigma	9001-99-4
RPMI-1640 Medium 1x	HyClone	SH30027.01
Тубус - PBS	MilliporeSigma	BSS-1006-B	Это то же самое, что и фосфатный буферный раствор Dulbecco 1x  Ca++MG++ бесплатно.  Наполните емкость 900 мл чехла.
Стерилизатор стерильной воды	HyClone	SH30529.01
- 0,4%– 0,7% гипохлорита	VWR	JT9416-1	Это обычно 10% отбеливатель Clorox, который можно получить, разбавив отбеливатель Clorox водой. Наполните емкость 200 мл Sterilzer.
Колба Т25	Falcon	353109
колба T75 Falcon		353136
ячейками TK6	MilliporeSigma	95111735