Иммуномаркировка аномального прионного белка с использованием протоколов иммуногистохимии требует специфического образца и методологий подготовки антител против PrP. В настоящем протоколе описаны ключевые этапы демаскировки эпитопов для обеспечения надлежащей иммуномаркировки PrP и минимизации неспецифического фонового окрашивания. Также при таком подходе учитываются меры биобезопасности при проведении иммуногистохимических исследований с прион-инфицированными тканями.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Обнаружение аномального прионного белка методом иммуногистохимии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Аномальные прионные белки (PrPSc) представляют собой ассоциированную с заболеванием изоформу клеточного прионного белка и диагностические маркеры трансмиссивных губчатых энцефалопатий (TSE). Эти нейродегенеративные заболевания поражают людей и несколько видов животных и включают скрепи, зоонозную губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота (BSE), хроническую истощающую болезнь шейки матки (CWD) и недавно выявленную прионную болезнь верблюда (CPD). Диагностика TSE основана на иммунодетекции PrPSc с применением методов иммуногистохимии (ИГХ) и западного иммуноблоттинга (WB) на тканях головного мозга, а именно на стволе мозга (уровень obex). ИГХ является широко используемым методом, при котором используются первичные антитела (моноклональные или поликлональные) против интересующих антигенов в клетках среза ткани. Связывание антитела с антигеном может быть визуализировано с помощью цветовой реакции, которая остается локализованной в области ткани или клетки, где было нацелено антитело. Таким образом, при прионных заболеваниях, как и в других областях исследований, методы иммуногистохимии используются не только в диагностических целях, но и в исследованиях патогенеза. Такие исследования включают выявление паттернов и типов PrPSc из ранее описанных для идентификации новых прионных штаммов. Поскольку BSE может инфицировать людей, рекомендуется, чтобы лабораторные объекты биобезопасности уровня 3 (BSL-3) использовались для работы с крупным рогатым скотом, мелкими жвачными животными и образцами цервидов, включенными в эпиднадзор TSE. Кроме того, рекомендуется, когда это возможно, использовать защитную оболочку и оборудование, предназначенное для использования прионов, чтобы ограничить загрязнение. Процедура PrPSc IHC состоит из этапа демаскирования эпитопа муравьиной кислоты, который также действует как мера инактивации прионов, поскольку ткани, фиксированные формалином и залитые парафином, используемые в этом методе, остаются инфекционными. При интерпретации результатов необходимо соблюдать осторожность, чтобы отличить неспецифическую иммуномаркировку от целевой маркировки. С этой целью важно распознать артефакты иммуномаркирования, полученные у известных TSE-отрицательных контрольных животных, чтобы дифференцировать их от специфических типов иммуномечения PrPSc , которые могут варьироваться между штаммами TSE, видами-хозяевами и генотипом prnp , далее описанными в настоящем описании.
Введение
Согласно прионной гипотезе, аномальная изоформа (PrPSc) является первичным или единственным компонентом инфекционного агента при трансмиссивных губчатых энцефалопатиях (TSE). Подтверждение диагноза TSE основано на иммунодетекции PrPSc с применением протоколов иммуногистохимии (ИГХ) и/или западных иммуноблоттинговых методов (WB) тканей головного мозга1.
ИГХ представляет собой метод, использующий моноклональные или, в некоторых случаях, поликлональные антитела (в качестве первичных антител) в качестве первого шага в иммуноокрашивании специфически целевых антигенов, представляющих интерес, расположенных в клетках среза ткани. Любое эффективное первичное связывание антитело-антиген затем визуализируется с использованием вторичных антител, специфичных к первичным антителам. Эти вторичные антитела конъюгированы с ферментами, такими как пероксидаза хрена (HRP) или щелочная фосфатаза (AP). Затем визуализация достигается путем добавления субстрата к этим ферментам, образуя нерастворимые цветные продукты, локализованные в областях, где первичные антитела связаны с целевыми антигенами. Улучшенная визуализация может быть достигнута путем контрокрашивания, при котором краситель используется для создания контраста между иммуномеченой и неиммуномеченной тканью2.
При ИГХ с использованием фиксированных формалином тканей, встроенных в парафин (FFPE), фиксация формалина может свести на нет эффективность первичных антител из-за сшивания формальдегидом, а также нагревания и обезвоживания во время заделки парафина. Они изменяют конформацию белков, разрушая, денатурируя или маскируя эпитопы, тем самым уменьшая или отменяя их обнаружение3. Таким образом, это требует поиска антигена (AR). Методы AR нарушают сшивание химических групп, связанных с формальдегидом, в антигенных молекулах, тем самым восстанавливая или демаскируя исходную конформацию антиген-белок. Это приводит к восстановлению сродства антитело-антиген (эпитоп) к иммуномаркировке. Конечная эффективность АР зависит от качеств целевого антигена и/или первичного антитела2.
Термоиндуцированный поиск антигена (эпитопа) (HIER) является одной из процедур AR3 и обычно используется для обнаружения PrPSc IHC, как описано в настоящем документе. ИГХ необходим для диагностики и используется в исследовательских лабораториях для определения тканевого распределения антигена, связанного с патологией. Он широко используется, в частности, для диагностики и исследования рака, неврологии и инфекционных заболеваний4. Для TSE ИГХ играет важную роль в диагностике и исследованиях для подтверждения и исследования распределения PrPSc в естественных хозяевах и экспериментальных моделях. ИГХ способствует изучению прионного патогенеза и анализу типов и паттернов отложения PrPSc , а именно в нервных тканях5, для выявления отклонений от обычно описанных инфекций и выявления предполагаемых новых прионных штаммов.
Поскольку прионы губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота (BSE) могут инфицировать людей, некоторые лабораторные протоколы, связанные с работой с BSE, могут потребовать использования оборудования и методов BSL-36. К ним относятся использование герметичного вторичного контейнера для транспортировки потенциальных образцов тканей, инфицированных BSE, в институте и лаборатории. Это также включает в себя обозначение зон локализации и оборудования, предназначенного для исследований и анализа BSE, когда это возможно. Это делается для предотвращения загрязнения за пределами рабочей зоны и обеспечения замкнутого пространства, поскольку процедуры дезактивации становятся необходимыми.
Соответственно, Лаборатория патологии INIAV следует рекомендуемым объектам и практикам уровнябиобезопасности 3 (BSL-3) 6 для управления потенциально инфицированными прионами образцами тканей крупного рогатого скота, мелких жвачных животных и цервидов, связанных с эпиднадзором TSE.
Ткани, закрепленные формалином и залитые парафином, включенные в диагностические или исследовательские процедуры TSE, особенно в центральной нервной системе, могут быть потенциально инфекционными. Следовательно, эти фиксированные ткани должны быть обработаны муравьиной кислотой, чтобы уменьшить инфекционность прионов, если они присутствуют, перед обработкой ткани. Это выполняется путем помещения фиксированных, обрезанных тканей (толщиной примерно 2-4 мм) в обрабатываемую кассету. Затем кассету погружают в 98% муравьиную кислоту (на 1 ч). После погружения кассеты с салфетками промывают в проточной водопроводной воде в течение 30 мин, а перед дальнейшей обработкой возвращают в фиксатор. Если срезы тканей не обработаны перед обработкой, постмикротомные срезы тканей должны быть погружены в неразбавленную муравьиную кислоту не менее чем на 5 мин перед гистологическим окрашиванием7. Протокол IHC для PrPSc включает в себя рутинную стадию демаскировки эпитопа муравьиной кислоты, также служащую для инактивации прионов7. После этих этапов инактивации прионов полученные фиксированные ткани могут быть обработаны в BSL-2 с использованием стандартных методов BSL-2.
Минимальным требованием к выборке тканей для диагностики TSE у любого животного, включенного в наблюдение TSE, является сбор ствола мозга (на уровне обекса). Кроме того, для выявления атипичных BSE и царапин рекомендуется также собрать часть мозжечка 1,8. Для диагностики CWD следует тестировать как ствол головного мозга (obex), так и ретрофарингеальные лимфатические узлы, поскольку PrP Sc может быть обнаружен в лимфоидных тканях без обнаруживаемого PrPSc в obex9, рассмотренный Machado et al.10.
Обексная часть ствола мозга включает диагностические целевые участки TSE, а именно дорсальное ядро блуждающего нерва (DVN), ядро солитарного тракта (STN) и ядро спинномозгового тракта тройничного нерва (V). В этих областях последовательно присутствует двустороннее накопление PrPSc даже на ранних стадиях BSE и классического скрепи. В клинических случаях прогрессирующей TSE все области серого вещества в стволе мозга демонстрируют широко распространенное распределение PrPSc 11.
Перед секционированием и обработкой образцы мозга оценивают (рис. 1), чтобы определить уровень аутолиза и наличие каких-либо повреждений тканей, которые могут поставить под угрозу пригодность образца для подтверждающего диагноза на основе ИГХ8. Для проверки целостности препаративных протоколов и результатов анализа положительные и отрицательные образцы тканей TSE включаются в качестве контроля в сочетании с подготовкой тканей из тестовых случаев в каждом анализе.
Рисунок 1: Процедура PrPSc IHC. Представление, демонстрирующее пошаговую последовательность процедуры PrPSc IHC от депарафинизации срезов ткани до возможного иммуноокрашивания и обнаружения (FFPE - Формалин-фиксированный парафин-встраиваемый; Mab - моноклональное антитело; DAB - 3,3' диаминобензидин). Эта фигура была создана в BioRender.com году. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Описанная в настоящем документе процедура IHC является компонентом исследовательского проекта FAIRJ-CT98-7021 «Создание европейской сети по надзору за жвачными животными TSE, а также стандартизация и гармонизация процесса и критериев для выявления подозрительных случаев». Он соответствует диагностическим критериям, определенным Всемирной организацией по охране здоровья животных, WOAH (ранее называвшейся Международным бюро эпизоотий, МЭБ)1 и Европейской референс-лабораторией по TSEживотных 8,11. Описанная процедура IHC также аккредитована в соответствии с NPISOIEC17025 (общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий) с 2008 года. Такая аккредитация подразумевает высококачественную систему менеджмента, включающую стандартные оперативные процедуры, квалифицированный персонал, точно откалиброванное оборудование, строгий контроль данных и реагентов, участие в межлабораторных квалификационных анализах, несоответствующую работу и оценку рисков для повышения эффективности системы менеджмента, достижения улучшенных результатов и предотвращения лабораторных опасностей. Контроль над инфицированными прионами тканями с BSE, классическим скрепи, атипичным скрепи и CWD собирали (фиксированные формалином, встроенные в парафин, FFPE) из различных источников. Секции крупного рогатого скота и овец взяты из случаев, диагностированных в рамках программы эпиднадзора за животными TSE. Срезы CWD взяты из контрольных образцов, любезно предоставленных профессором Стефани Цуб (Канадское агентство по инспекции пищевых продуктов, Национальный центр болезней животных) в 2003 году, и из квалификационных испытаний CWD 2008 года, организованных Европейской референс-лабораторией по TSE (APHA, Weybridge).
1. Сечение тканей и подготовка предметного стекла
- Вырезают срезы тканей, закрепленных формалином и залитых парафином (FFPE), толщиной 3-5 мкм с помощью микротома.
- Всплывают секции на очищенную воду с температурой примерно на 10 °C ниже температуры плавления используемого парафина. Поднимите срезы из воды на специально обработанные предметные стекла микроскопа (см. Таблицу материалов). Дайте воде полностью стечь с горок.
- Инкубируйте предметные стекла в течение ночи при 50 ° C, чтобы улучшить адгезию тканей к предметному стеклу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно подготавливать свежесрезанные ткани для протоколов IHC, хотя положительные и отрицательные контрольные срезы TSE могут быть подготовлены заранее и сохранены. Шаги со 2 по 4 должны выполняться в химическом вытяжном шкафу.
2. Депарафинизация и регидратация
- Поместите предметные стекла с тканевыми срезами в корзину для окрашивания из нержавеющей стали (см. Таблицу материалов). Погрузите корзину в ванну с ксилолом (емкость для окрашивания из нержавеющей стали) на 3 минуты, извлеките и снова погрузите.
- Удалите ксилол и регидратируйте срезы, погрузив их в ванну с абсолютным этанолом на 3 минуты. Снимите и погрузите еще раз.
- Высушите срезы на воздухе и поместите в ванну с 90% этанолом на 1 мин. Переведите в ванну с 70% этанолом еще на минуту, а затем окончательно перенесите в ванну с 50% этанолом на 1 минуту. При каждой процедуре ванны с этанолом осторожно перемешивайте скользящую корзину дважды и сливайте воду из корзины перед следующей передачей.
3. Поиск эпитопов
- Аккуратно погрузите срезы тканей в 98% муравьиную кислоту комнатной температуры на 30 мин. Промойте срезы в водопроводной воде в течение 5 мин, после чего дважды ополосните в дистиллированной воде.
ВНИМАНИЕ: Муравьиная кислота обладает высокой коррозионной активностью. Необходимо надевать защитные очки и перчатки. - Выполните термоиндуцированное извлечение антигена (HIER), выполнив следующие действия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап выполняется путем гидратированного автоклавирования при 121 ° C в течение 30 мин в специальной барокамере (см. Таблицу материалов).- Предварительно нагрейте цитратный буфер (10 мМ, рН 6,1, см. Таблицу материалов) при 98 ° C в течение примерно 20 мин в контейнере для окрашивания из нержавеющей стали, помещенном в барокамеру, заполненную 500 мл дистиллированной воды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования заданное значение программы составляло 1 (SP1) для конкретного используемого оборудования. - После того, как сигнал тревоги укажет, что оборудование достигло запрограммированного времени и температуры, погрузите корзину с предметными стеклами и запустите программу до заданной точки 2 (121 ° C в течение 30 минут). В целях контроля качества поместите на корзину участок клейкой индикаторной ленты автоклава для контроля температуры и давления, а также запишите начальное и конечное давление этой программы.
- Если количество предметных стекол, подлежащих иммуноокрашиванию, не достигает емкости корзины, используйте чистые пустые предметные стекла, чтобы занять любые пустые места. После завершения программы разрешите пассивное возвращение камеры к давлению окружающей среды (не менее 30 мин).
ПРИМЕЧАНИЕ: Более длительная продолжительность может уменьшить неспецифическое окрашивание фона. - Осторожно перенесите скользящую корзину в емкость для окрашивания из нержавеющей стали, наполненную дистиллированной водой, на 5 минут.
- Предварительно нагрейте цитратный буфер (10 мМ, рН 6,1, см. Таблицу материалов) при 98 ° C в течение примерно 20 мин в контейнере для окрашивания из нержавеющей стали, помещенном в барокамеру, заполненную 500 мл дистиллированной воды.
4. Инактивация эндогенной пероксидазы
- Погрузите корзину, содержащую срезы образца, в ванну с 3% перекисью водорода (H2O2) в метаноле на 30 мин. Промойте срезы под проточной водой (5 мин). Слейте воду и погрузите срезы в 1x физиологический раствор с трис-буфером (TBS) еще на 5 минут.
5. Иммунодетекция
ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании иммунодетекцию проводили с использованием формата7 капиллярного промежутка с использованием коммерчески доступной системы сборки зажима слайда (см. Таблицу материалов). Также применимы другие системы иммуногистохимических слайдов.
- Поместите каждое предметное стекло на имеющийся в продаже держатель крышки (см. Таблицу материалов), предварительно смоченный TBS, избегая пузырьков, так, чтобы тканевая сторона была обращена к держателю, а края предметного стекла совпадали с двумя нижними точками держателя.
- Удерживайте узел держателя затвора между большим и указательным пальцами, один палец должен находиться поверх предметного стекла образца, а другой — в нижней части держателя. Затем поместите сборку в галерею системы.
- Чтобы убедиться, что набор хорошо собран, заполните лунку между предметным стеклом и держателем TBS, которая не должна сразу переполняться. С этого момента убедитесь, что между держателем и предметным стеклом должно удерживаться примерно 80 мкл TBS. Не допускайте высыхания срезов.
- Попав в систему, чтобы уменьшить фоновое окрашивание перед обработкой первичным антителом (анти-PrP, см. Таблицу материалов), предварительно инкубируйте предметные стекла образца с 20% нормальной сывороткой того же вида, что и вторичный хозяин антитела, используемый для иммуноокрашивания (в данном случае, лошадиная сыворотка) в течение 30 мин в TBS.
- Разморозьте количество аликвот антител, которые будут использоваться в соответствии с анализируемым видом животных, количество исследуемых срезов образца и количество рабочего разведения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов используйте 10% нормальную сыворотку того же вида, что и источник вторичных антител и первичных растворов антител. Если возможно, для достижения наилучших результатов источник хозяина нормальной сыворотки и вторичного антитела должны быть одного и того же вида. - Не промывая срезы, наносят раствор первичного антитела непосредственно (200 мкл) в каждую лунку набора предметных стекол и выдерживают в течение 60 мин при комнатной температуре.
- Для промывки заполните лунки наборов держателей слайдов TBS и подождите 5 мин. Повторите дважды.
- Разбавьте биотинилированное вторичное антитело (моноклональный антимышиный Horse Ab, см. Таблицу материалов) на 1/200 в TBS с 10% конской сывороткой. Подготовьте необходимый объем в зависимости от количества обрабатываемых участков.
- Нанесите раствор вторичных антител (200 мкл) на каждую лунку набора держателей предметных стекол. Инкубировать 30 мин при комнатной температуре.
- Постирайте, как описано в шаге 5.5.
- Для инкубации с авидин-биотиновым комплексом пероксидазой (комплекс ABC/HRP, см. Таблицу материалов) готовят реагент за 30 мин до применения. Нанесите комплексный раствор ABC/HRP (200 мкл) в каждую лунку набора держателей скользящих пластин. Инкубировать 30 мин при комнатной температуре.
- Постирайте, как описано в шаге 5.5.
6. Разработка с помощью хромогена DAB
ВНИМАНИЕ: DAB является потенциальным канцерогеном. В результате при работе с этим реагентом необходим соответствующий уход, включая защиту глаз, лабораторные халаты, перчатки и хорошие лабораторные процедуры. Утилизируйте в соответствии с местными правилами.
- Разбавляйте хромоген в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов) непосредственно перед использованием. Нанесите раствор хромогена (400 мкл) на каждую лунку набора слайд-пластин.
- Инкубировать до 30 мин при комнатной температуре. В положительных срезахPrP Sc обычно достаточно 10-минутного инкубационного периода.
- Удалите остаточный раствор хромогена, промыв предметные стекла в дистиллированной воде. Снимите слайды с держателей крышки и поместите их в пластиковый контейнер с дистиллированной водой.
7. Противоокрашивание гематоксилином
- Погрузите корзину для окрашивания из нержавеющей стали с секциями в ванну с раствором гематоксилина (см. Таблицу материалов) на 1 мин. Осторожно промойте в холодной проточной воде в течение 10 минут или в теплой воде в течение 5 минут.
- Обезвоживают срезы, помещая их в 90% этанол на 1 мин, а затем одну ванну в абсолютном этаноле в течение 1 мин. Затем поместите горки в ксилольную ванну на 1 мин.
- Монтируйте секции с помощью имеющегося в продаже монтажного носителя (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти этапы выполняются в химическом вытяжном шкафу при комнатной температуре (19 °C -24 °C). Эта процедура включает в себя протокол испытаний (дополнительный файл 1) для записи завершения всех этапов, используемого оборудования и лаборанта. Кроме того, был разработан рабочий лист (дополнительный файл 2) для простого определения объемов реагентов в соответствии с количеством секций в каждом анализе, рабочими разбавлениями и инструкциями производителя, а также для записи комнатной температуры, оборудования и партий реагентов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Учитывая, что неспецифическая целевая иммуномаркировка возможна, важно выяснить уровень неспецифической иммуномаркировки у известных TSE-отрицательных контрольных животных. Это важный шаг для правильной интерпретации специфической иммуномаркировки PrPSc 7 (рис. 2). Было отмечено, что нецелевое мечение антителами против PrP происходит в виде дискретного внутринейронального окрашивания мелкодисперсными частицами (более очевидного в подъязычном ядре ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
TSE являются потенциальными зоонозными заболеваниями. После появления BSE в 1986 году в Соединенном Королевстве Португалия стала одним из государств-членов Европейского Союза с более высокой заболеваемостью этим заболеванием14,15. Для борьбы с этим заболеванием Генеральным директоратом по пищевым и ветеринарным продуктам (DGAV) и Национальным институтом сельскохозяйственных и ветеринарных исследований, IP (INIAV), который проводит диагностику TSE в качестве Нацио...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам раскрывать нечего.
Благодарности
Эта статья была профинансирована проектом POCI-01-0145-FEDER-029947 «Оценка риска хронического истощения в Португалии» при поддержке FCT (Fundação para a Ciência e a Tecnologia) - FEDER -Balcão2020. Кроме того, авторы исследовательского подразделения CECAV получили финансирование от FCT в рамках проекта UIDB/CVT/0772/2020.Мы благодарим Брюса К. Кэмпбелла, директора по исследованиям (в отставке), Западный региональный исследовательский центр, Министерство сельского хозяйства США, за его помощь.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Абсолютный этанол | Labchem | LB0507-9010 | |
| Разведенные на 90%, 70% и 50% в дистиллированной воде | |||
| Авидин-биотиновый комплекс и пероксидаза Vectastain Elite ABC kit Peroxidase | Vector Laboratories | PK-6100 | Приготовьте и аккуратно перемешайте за 30 минут до использования в соответствии с инструкциями набора. Не перемешивайте после стояния. |
| Биотинилированное вторичное антитело (Horse anti-mouse IgG H+L) | Vector Laboratories | BA-2000-1.5 | Развести на 1/200 в TBS с 10% лошадиной нормальной сывороткой. Подготавливайте необходимый объем в зависимости от количества секций. |
| Хромоген Диаминобензидин-DAB, набор субстрата, пероксидаза | Vector Laboratories | SK-4100 | Подготовьте перед использованием в соответствии с инструкциями набора. Используйте 400 &микро; Л раствора на секцию. |
| Барокамера DakoCytomation Pascal | DAKO | S2800 | |
| Ehrlich' s Гематоксилин: | |||
| Гематоксилин | Merck | 115938 | Растворите 2 г гематоксилина в 100 мл абсолютного этанола. Добавьте 100 мл дистиллированной воды, 10 мл ледяной уксусной кислоты и 15 г квасцов калия при постоянном помешивании. Добавьте 100 мл глицерина. Естественный процесс окисления занимает 2 месяца, перед использованием. |
| Абсолютный этанол | Labchem | LB0507-9010 | |
| Ледяная уксусная кислота | Merck | 101830 | |
| Квасцы калия | Merck | 1.01047.1000 | |
| Глицерин | Merck | 1.04091.1000 | |
| Раствор блока эндогенной пероксидазы (3% концентрация H2O2): | 40 мл перекиси водорода (30% w/w) в 360 мл метанола. Подготовьте перед применением | ||
| Перекись водорода (30% w/w) | Scharlau | HI0136 | |
| Метанол | Sigma Aldrich | 322415-2L | |
| Муравьиная кислота 98% | Merck | 1.00264.1000 | Неразбавленный |
| микротом | Микротом Shandon-AS325 | Шаньдон-AS325 | |
| Монтажный носитель Entellan | Merck | 107960 | Готовый к использованию. |
| Нормальная сыворотка (20% ) блокирует раствор при ТБС: Лошадиная нормальная сыворотка | Gibco | 16050-122 | Подготовьте окончательный объем в соответствии с количеством секций в пробе<бр/> (200 & микро; л раствора на секцию). |
| Первичное антитело против PrP мыши MAb 2G11 | BIORAD | MCA2460 | PrP 146-R154R171182 Овцы, включая атипичных скрейпи, цервин, кошачьих. Не подходит для крупного рогатого скота. В зависимости от количества срезов в анализе (200 &m; L раствора на секцию) и разведении антител, готовьте окончательный объем в TBS с добавлением 10% нормальной сыворотки от видов, в которых было выращено вторичное антитело (лошадиная нормальная сыворотка) Обычное разведение антител: MAb 2G11 1/100, но рабочее разведение должно быть установлено в каждой новой партии, чтобы получить концентрацию, позволяющую получить самую сильную маркировку с наименьшим фоном. Для хранения заморозьте аликвотные объемы минимум 10 мкм; L в стерильные микропробирки. Разморозьте и используйте по одной аликвоте за раз. |
| Первичное антитело против PrP мыши MAb 12F10 | Каймановы острова Химическая компания | 189710 | PrP142-160 Крупный рогатый скот, не подходит для баранины Обычное разведение антител: 1/200, но также следует установить рабочее разведение. Подготовьте как MAb 2G11 |
| Shandon Cover plateTM камеру | Thermo Scientific | ||
| Shandon Sequenza® Центр иммуноокрашивания | Thermo Scientific | 73300001 | |
| Shandon Sequenza® Иммуноокрашивающий штатив для предметных стекол | Thermo Scientific | 73310017 | |
| раствор цитратного буфера (10 мМ pH 6,1): | 2,55 г дигидрата три-цитрата натрия и 0,255 г лимонной кислоты на один литр очищенной воды.<бр/> Отрегулируйте рН рабочего раствора до 6,1 с помощью 10 мМ раствора лимонной кислоты (1,05 г лимонной кислоты в 500 мл очищенной воды)<бр/> Приготовьте в день анализа. | ||
| Тринатрия цитрата дигидрат | Sigma-aldrich | S4641-500G | |
| Лимонная кислота | Sigma Aldrich | C0759 | |
| Баночка и корзина для окрашивания | Deltalab | 19360 | |
| 19361 | |||
| Предметные стекла микроскопа Superfrost Plus | VWR | 631-0108 | |
| Трис-буферизованный солевой раствор (TBS) (50 мМ основание ТРИЗМА; 0,8% NaCI; pH 7,6): | 10xTBS (стоковый раствор 0,5 м основание тризмы; 8% NaCI; pH 7,6): ТРИЗМАТИЧЕСКОЕ ОСНОВАНИЕ 60,57 г и NaCl 80 г в 800 мл очищенной воды. Отрегулируйте pH исходного раствора с помощью соляной кислоты 37% и конечный объем до одного литра с очищенной водой (держите 5&mn; 3°); C до 2 месяцев) Разведенный стоковый раствор TBS 1/10 в день анализа. | ||
| БАЗА ТРИЗМА | Sigma Aldrich | T6066-1KG | |
| Хлорид натрия (NaCl) | Merck | 106404 | |
| ксилол | Реагенты Panreac Applied Chem ITW | 251769 | неразбавленном |
Ссылки
- WOAH, Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals Online Access. Chapter 3.4.5.-Bovine Spongiform Encephalopathy (Version May 2021) and Chapter 3.8.11. - Scrapie (Version May 2022). , Available from: https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/ (2022).
- Ramos-Vara, J. A. Principles and methods of immunohistochemistry. Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).
- Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-Induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Immunocytochemical Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Oliver, C., Jamur, M. 588, 103-119 (2010).
- Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry). Journal Pharmacy Bioallied Sciences. 4, Suppl 2 307-309 (2012).
- Orge, L., et al. Neuropathology of Animal Prion Diseases. Biomolecules. 11 (3), 466(2021).
- US Department of Health and Human Services Public Health Service Centres for Disease Control and Prevention National Institutes of Health. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 6th Edition Revised June 2020. , Available from: https://www.cdc.gov/labs/pdf/SF_19_308133-A_BMBL6_00-BOOK-WEB-final-3.pdf (2022).
- APHA. Fixation, tissue processing, histology and immunohistochemistry procedures for diagnosis of animal TSE (BSE, scrapie, atypical scrapie, CWD). Histo & IHC protocols for TSE diagnosis_Rev_Jan2019.pdf. TSEglobalNet - International Reference Laboratory for TSE. , via.gov.uk (2022).
- Sample requirements for TSE testing and confirmation. Version 1.0. TSE EURL. , Available from: https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html (2019).
- TSE EU Reference Laboratory Guidelines for the detection of Chronic Wasting Disease in cervids. Version 1.0. TSE EURL. , Available from: https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html (2019).
- Machado, C. N., et al. TSE Monitoring in Wildlife Epidemiology, Transmission, Diagnosis, Genetics and Control. Wildlife Population Monitoring. IntechOpen. , (2019).
- APHA. Neuropathology: Confirmatory diagnosis of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) in cattle and small ruminants. Confirmatory (Histo & IHC) diagnostic criteria Rev_Jan2019.pdf. TSEglobalNet - International Reference Laboratory for TSE. , via.gov.uk (2019).
- Ryder, S. J., Spencer, Y. I., Bellerby, P. J., March, S. A. Immunohistochemical detection of PrP in the medulla oblongata of sheep: The spectrum of staining in normal and scrapie-affected sheep. The Veterinary Record. 148 (1), 7-13 (2001).
- Simmons, M. M., et al. Experimental classical bovine spongiform encephalopathy: definition and progression of neural PrP immunolabeling in relation to diagnosis and disease controls. Veterinary Pathology. 48 (5), 948-963 (2011).
- Orge, L., et al. Identification of H-type BSE in Portugal. Prion. 9 (1), 22-28 (2015).
- Orge, L., Simas, J. P., Fernandes, A. C., Ramos, M., Galo, A. Similarity of the lesion profile of BSE in Portuguese cattle to that described in British cattle. Veterinary Record. 147 (17), 486-488 (2000).
- Pires, M. A., Travassos, F. S., Gärtner, F. Atlas of veterinary pathology. Biopathology. Lidel VII. 195 (6), 179-180 (2004).
- Pires, M. A., et al. Immunology protocols, didactic series. Applied Sciences. , 357(2010).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
