Методическая статья

Метод электропорации для преобразования риккетсии spp. с флуоресцентным белково-экспрессирующим челночным вектором в клеточных линиях клещей

DOI:

10.3791/64562

⸱

11 октября 2022 г.

 ,  ,  , 
1Department of Entomology, University of Minnesota

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Электропорация — это быстрый, широко распространенный метод введения экзогенной ДНК в род Rickettsia. Данный протокол обеспечивает полезный метод электропорации для трансформации облигатных внутриклеточных бактерий рода Rickettsia.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Риккетсиозы вызываются широким спектром облигатных внутриклеточных бактерий, принадлежащих к роду Rickettsia , которые могут передаваться позвоночным хозяевам через укус инфицированных членистоногих векторов. На сегодняшний день возникающие или вновь возникающие эпидемические риккетсиозы остаются риском для здоровья населения из-за трудностей в диагностике, поскольку методы диагностики ограничены и не стандартизированы или общедоступны. Ошибочный диагноз, возникающий в результате отсутствия распознавания признаков и симптомов, может привести к задержке лечения антибиотиками и плохим результатам для здоровья. Всестороннее понимание характеристик риккетсии в конечном итоге улучшит клиническую диагностику, оценку и лечение с улучшенным контролем и профилактикой заболевания.

Функциональные исследования риккетсиальных генов имеют решающее значение для понимания их роли в патогенезе. В данной работе описана процедура электропорации штамма Rickettsia parkeri Tate's Hell с челночным вектором pRAM18dSFA и селекция трансформированного R. parkeri в культуре клеток клещей с антибиотиками (спектиномицин и стрептомицин). Также описан способ локализации трансформированного R. parkeri в клещевых клетках с использованием конфокальной иммунофлуоресцентной микроскопии, полезной методики проверки трансформации в векторных клеточных линиях. Подобные подходы подходят и для трансформации других риккетсий.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Риккетсиозы вызываются широким спектром облигатных внутриклеточных бактерий, которые принадлежат к роду Rickettsia (семейство Rickettsiaceae, отряд Rickettsiales). Род Rickettsia классифицируется на четыре основные группы на основе филогенетических характеристик 1,2: группа пятнистой лихорадки (SFG), которая содержит те риккетсии, которые вызывают наиболее тяжелые и смертельные клещевые риккетсиозы (например, Rickettsia rickettsii, возбудитель пятнистой лихорадки Скалистых гор), группа тифа (TG, например, Rickettsia prowazekii, возбудитель эпидемического тифа), переходная группа (TRG, например, Rickettsia felis, возбудитель пятнистой лихорадки, переносимой блохами), и предковая группа (AG, например, Rickettsia bellii).

Среди старейших известных трансмиссивных заболеваний риккетсиозы в основном приобретаются после передачи патогенов через укусы инфицированных членистоногих переносчиков, включая клещей, блох, вшей и клещей 3,4. Хотя открытие эффективных антибиотиков улучшило результаты лечения, возникающие и вновь возникающие эпидемические риккетсиозы продолжают бросать вызов традиционным стратегиям профилактики и контроля. Таким образом, всестороннее понимание взаимодействия риккетсии/хозяина/вектора в конечном итоге создаст прочную основу для разработки новых подходов к профилактике и лечению этих древних заболеваний.

В природе горизонтальный перенос генов (HGT) у бактерий происходит путем конъюгации, трансдукции и трансформации5. Бактериальная трансформация in vitro использует эти концепции HGT, хотя внутриклеточная природа риккетсий представляет некоторые проблемы. Ограниченные условия роста и плохо изученные системы конъюгации и трансдукции у разных видов риккетсий препятствовали применению методов конъюгации и трансдукции у риккетсий 6,7,8. По сравнению с другими облигатными внутриклеточными бактериальными родами (например, Chlamydia, Coxiella, Anaplasma и Ehrlichia), род Rickettsia отличается в отношении стратегий роста и репликации в цитоплазме клеток, что создает специфические проблемы для генетической модификации риккетсий из-за их уникальных особенностей образа жизни9.

Первоначальное препятствие, которое необходимо преодолеть при попытке генетической модификации риккетсий, заключается в достижении успешной трансформации. Таким образом, разработка осуществимого подхода с высокой эффективностью трансформации была бы чрезвычайно ценной для разработки генетических инструментов для риккетсий. Здесь мы сосредоточимся на электропорации, широко признанном методе трансформации, который был использован для успешного введения экзогенной ДНК в несколько видов риккетсий, включая Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii и Rickettsia buchneri 10,11,12 ,13,14,15,16.

В данной статье описывается процедура электропорации штамма R. parkeri Tate's Hell (присоединение: GCA_000965145.1) с челночным вектором pRAM18dSFA, полученным из штамма Rickettsia amblyommatis AaR/SC плазмиды pRAM18, спроектированного для кодирования mKATE, дальнекрасого флуоресцентного белка, и aadA, придающего резистентность к спектиномицину и стрептомицину 13,15,20. Трансформированные R. parkeri жизнеспособны и стабильно поддерживаются при выделении антибиотиков в клеточных линиях клещей. Кроме того, показано, что локализация трансформированного R. parkeri в живых клетках клещей с помощью конфокальной микроскопии может быть использована для оценки качества скоростей трансформации в векторных клеточных линиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Размножение и очистка R. parkeri из культуры клещевых клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры культивирования клеток должны выполняться в шкафу биобезопасности класса II.

  1. Подготовка R. parkeri-инфицированные клетки клещей
    1. Выращивайте клетки ISE6 в колбах для культивирования клеток размером25 см2 при 34 °C в 5 мл среды L15C30017, дополненных 5% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 5% триптозно-фосфатным бульоном (TPB) и 0,1% липопротеиновым концентратом (LPC).
      ПРИМЕЧАНИЕ: ISE6 (клеточная линия эмбриона Ixodes scapularis) является клеточной линией клещей, широко используемой во многих лабораториях и, таким образом, является важной моделью для изучения взаимодействия клещей и патогенов 17,18,19. Скорость роста клеток ISE6 медленнее, чем у клеток млекопитающих, со временем удвоения популяции ≥72 ч. Например, клеткам ISE6, субкультивированным из 100% сливающейся культуры в соотношении 1:5, потребуется 3-4 недели, чтобы восстановить 100% слияние. Здоровые клетки ISE6, как правило, округляются с многочисленными прилипшими нитями17.
    2. Подсчитайте клетки ISE6 с помощью гемоцитометра под световым микроскопом. Использовать в концентрации ~106 клеток/мл (100% слияние).
      1. Осторожно промойте клетки из колбы средой и рассейте клетки путем пипетирования, чтобы получить однородную клеточную суспензию. Добавьте 20 мкл клеточной суспензии между гемоцитометром и накройте стекло, чтобы подсчитать клетки с помощью гемоцитометра.
    3. Добавьте бесклеточный хозяин дикого типа R. parkeri20 (среднее число: 5 × 107-10 × 107) в клеточные культуры ISE6 в колбах для клеточных культурпо 25 см2 . Инкубируют инфицированные культуры клеток R. parkeri при 34 °C в 5 мл полной среды, состоящей из среды L15C300, 10% FBS, 5% TPB, 0,1% LPC, 0,25% бикарбоната натрия (NaHCO3) и 25 мМ HEPES до заражения 90%-100% клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Уровень инфицирования R. parkeri в клетках ISE6 определяется окрашиванием Giemsa, а время инкубации для достижения 90%-100% инфекции колеблется в среднем от 5 дней до 7 дней.
    4. Определите скорость заражения с помощью окрашивания Giemsa.
      1. В шкафу биобезопасности повторно суспендируют инфицированные клеточные культуры и переносят 50 мкл суспензии в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
      2. Разбавить суспензию полной средой (разведение 1:5) и центрифугу 100 мкл на предметные стекла микроскопа с помощью центрифуги при 113 × г в течение 5 мин. Чтобы сохранить живое R. parkeri , используйте центрифугу с герметичным ротором, который предназначен для удаления из центрифуги. Это позволяет транспортировать герметичный ротор внутрь и из капота.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку R. parkeri все еще живы до центрифугирования, образец необходимо содержать до тех пор, пока риккетсии не будут убиты. Таким образом, центрифуга, используемая для вращения культуры R. parkeri на слайде, должна иметь герметичный ротор, который предназначен для поднятия из центрифуги. С ротором в ламинарной проточной вытяжке загрузите образцы в узел слайда воронкообразного микроскопа, повторно запечатайте ротор и поместите герметичный ротор обратно в центрифугу. Затем включите центрифугу, и образцы осаждаются на предметные стекла микроскопа. После завершения пробега снимите герметичный ротор с центрифуги и поместите его в ламинарную вытяжку. Там откройте крышку ротора и разгрузите затвор воронки-микроскопа внутри капота. После высыхания погрузите стекла микроскопа в абсолютный метанол, который убивает все патогены. Воронки и металлические носители погружены в разбавленный DMQ, который убивает R. parkeri.
      3. Высушите горки на воздухе и зафиксируйте в абсолютном метаноле на 5 мин при комнатной температуре (RT).
      4. Окрашивайте слайды пятном Giemsa (4% в буфере Соренсона, рН 6,6) в течение 30 мин при 37 °C и смывайте водой в течение 5 с.
      5. Определить процент заражения (количество клеток, инфицированных риккетсиями/100 клеток) с помощью световой микроскопии.
        ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показаны типичные результаты окрашивания Giemsa.
  2. Приготовление бесклеточного R. parkeri
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда 90%-100% клеток в культуре инфицированы, риккетсии должны быть выделены из клеток ISE6 и должна быть выполнена электропорация.
    1. Добавьте стерильную зернистость из карбида кремния 60-90 в стерильные микроцентрифужные трубки объемом около 0,2 мл.
    2. Удалите 2 мл среды из 100% R. parkeri-инфицированных культур (шаг 1.1.3) и повторно суспендируйте клетки в оставшихся 3 мл среды.
    3. Переложите равные части этой суспензии в трубы, подготовленные на этапе 1.2.1.
    4. Вращайте каждую трубку на высокой скорости в течение 30 с, а затем поместите трубки на лед. Дайте песку осесть в течение нескольких секунд под действием силы тяжести.
    5. В шкафу биобезопасности класса II иметь готовый стерильный шприц Luer-lock объемом 5 мл с вытянутым плунжером и концом плунжера, закрепленным в полистирольной основе для конических труб объемом 15 мл.
    6. Используя стерильный, 1 мл барьерный наконечник пипетки, установленный на подходящем пипеторе, удалите супернатант вихревого лизата ячейки из трубки, следя за тем, чтобы не аспирировать песок. Вставьте наконечник пипетки в отверстие ступицы шприца и вытолкните содержимое в шприц с мягким давлением. В качестве альтернативы используйте стерильную барьерную пипетку Пастера 2 мл, управляемую резиновой колбой.
    7. Прикрепите стерилизованный фильтр размером пор 2 мкм к шприцевому концентратору и фильтруйте культуру R. parkeri со стадии 1,2,6 в стерильные пробирки объемом 1,5 мл.
    8. Соберите R. parkeri путем центрифугирования при 13 600 × г при 4 °C в течение 5 мин и выбросьте супернатант.
    9. Повторно суспендируют гранулу в 1,2 мл ледяной сахарозы 300 мМ и центрифугу снова при 13 600 × г при 4 °C в течение 5 мин. Повторите ресуспензию и центрифугирование в общей сложности две промывки сахарозы.
    10. Смешайте гранулы R. parkeri в одну охлажденную стерильную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл в 50 мкл ледяной сахарозы 300 мМ на трансформацию. Поскольку одна колба R. parkeri размером25 см2 обеспечивает достаточное количество риккетсий для двух-трех превращений, добавляют 100-150 мкл 300 мМ холодной сахарозы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При желании количество риккетсий может быть рассчитано с помощью счетной камеры Петроффа-Хауссера. При использовании начальной прививки 5 × 107 -10 × 107 бесклеточных R. parkeri, в среднем потребуется 5-7 дней, чтобы достичь 90%-100% инфекции, в результате чего будет примерно 5 × 107-10 × 1010 бесклеточных R. parkeri.
    11. Аккуратно повторно суспендируйте гранулу путем пипетки до тех пор, пока она не будет полностью диспергирована. Разделите образец на порции по 50 мкл в охлажденных, стерильных микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При желании жизнеспособность риккетсии может быть оценена с помощью проточной цитометрии после окрашивания флуоресцентным красителем 21.

2. Трансформация R. parkeri с плазмидой pRAM18dSFA

  1. На льду добавьте 3 мкг свободной от эндотоксинов плазмиды pRAM18dSFAДНК 13,15,20 в каждую трубку, содержащую 50 мкл суспензии R. parkeri, и осторожно, но тщательно перемешайте смесь кончиком пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При получении плазмидной ДНК используйте набор для очистки, который включает в себя этап удаления эндотоксинов для получения плазмидной ДНК23 без эндотоксинов. Мы обнаружили, что диапазон плазмидных концентраций от 1 мкг до 3 мкг на 50 мкл суспензии R. parkeri приводил к успешным превращениям, тогда как увеличение количества плазмиды до 10 мкг ингибировало трансформацию.
  2. Переложите вышеуказанную смесь ДНК и R. parkeri в охлажденную, стерильную электропорационную кювету с зазором 0,1 см (осторожно постучите по кювете до равномерного распределения смеси) и дайте ей постоять на льду в течение 10-30 мин.
  3. Удалите среду из 100% сливающейся культуры клеток ISE6 и повторно суспендируйте клеточные слои в 1,5 мл свежей среды с буфером NaHCO3 и HEPES (описанным выше на этапе 1.1.3). Используйте одну колбу сливающихся клеток для каждого преобразования.
  4. Перенесите повторно суспендированные клетки в стерильную микроцентрифужную трубку объемом 2 мл (одна трубка на 25см2 колбы клеток ISE6).
  5. Электропорат смеси R. parkeri/pRAM18dSFA при 1,8 кВ, 200 Ом, 25 мкФ с помощью электропоратора.
  6. Используя стерильную, удлиненную передаточную пипетку с тонким наконечником, переведите небольшое количество клеточной суспензии ISE6 (этап 2.4) в кювету и осторожно потяните жидкость вверх и вниз, чтобы промыть кювету. Переложите смесь в микроцентрифужную трубку объемом 2 мл, содержащую оставшуюся часть клеточной суспензии ISE6, и осторожно смешайте трансформационную смесь с клетками.
  7. Центрифугируйте преобразованные образцы при 700 × g в течение 2 мин при RT, а затем увеличьте скорость центрифугирования до 13 600 × g в течение 1 мин больше при RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Две скорости центрифугирования способствуют риккетсиальному связыванию с клетками и входу в них: 700 × g используется для вытягивания клеток ISE6, в то время как 13 600 × g используется для вытягивания риккетсий.
  8. Дайте образцам постоять при RT или 34 °C в течение 15 мин до 1 ч.
  9. Повторное суспендирование трансформантов (два или три) в ячейках ISE6 с помощью стерильного 2 мл барьерного наконечника пипетки, установленного на пипетке, и перенос в две или три колбы для культивирования клетокразмером 25 см2 , содержащие 3,5 мл свежей среды с буфером NaHCO3 и HEPES. В качестве альтернативы используйте стерильную барьерную пипетку Пастера 2 мл, управляемую резиновой колбой.
  10. Раскачать колбы, чтобы равномерно распределить смесь, а затем инкубировать при 34 °C.
  11. Через 16-24 ч добавляют 10 мкл спектиномицина (50 мг/мл) и 10 мкл стрептомицина (50 мг/мл) в каждую колбу на стадии 2.10.

3. Наблюдение за трансформированным Р. Паркери

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте эпифлуоресцентный микроскоп с фильтрами родамина/TRITC для наблюдения за колбами, приготовленными на этапе 2.11 через 3-7 дней. Как только бляшки проявляются в культурах (5-14 дней), можно увидеть трансформированные R. parkeri , которые экспрессируют красный флуоресцентный белок mKATE, кодируемый на плазмиде pRAM18dSFA.

  1. Конфокальная микроскопия
    1. Повторно суспендируют клеточные культуры из колб стадии 2,11 и смешивают 100 мкл этих клеточных культур с 5 мкл раствора Hoechst 33342 в течение 10-30 мин при РТ в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Hoechst 33342 представляет собой клеточно-проницаемое ядерное контрокрашение, которое связывается с ДНК живых клеток клещей и испускает синюю флуоресценцию.
    2. Центрифугу 50 мкл смеси наносят на стекла микроскопа с помощью центрифуги при 5 × г в течение 3 мин.
    3. Добавьте 3 мкл 1x PBS к месту клеток, нанесенных на слайде, наложите на него крышку и посмотрите с помощью конфокального микроскопа (объектив 60x). Для флуоресцентной визуализации используют следующие параметры возбуждения и излучения: для 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI), возбуждение при 350 нм, излучение при 470 нм; для тетраметилродамина (TRITC) возбуждение при 557 нм, эмиссия при 576 нм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Морфология R. parkeri в клетках ISE6 под световым микроскопом после окрашивания Giemsa показана на рисунке 1. На рисунке 2 трансформированный R. parkeri , экспрессирующий красный флуоресцентный белок в клетках ISE6, показан с использованием конфокальной микроскопии. Наблюдается существенное увеличение скорости инфицирования трансформированного R. parkeri (красного) в клетках ISE6 (синий, соответствует ядрам) с (А) дня ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы демонстрируем метод введения экзогенной ДНК, закодированной на челночной плазмиде pRAM18dSFA, в риккетсии с использованием электропорации. В этой процедуре бесклеточные риккетсии были очищены от клеток-хозяев, преобразованы риккетсиальным челночным вектором и выпущены на клещевые клетки для инфекции. Также описана конфокальная процедура иммунофлуоресценции для обнаружения экспрессирующего белка красного флуоресценции R. parkeri в клетках клещей. Аналогичные методы применимы к другим видам риккетсий<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Конфликт интересов не декларируется.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Тимоти Куртти и Бенджамина Калла за их проницательные дискуссии и предложения. Это исследование было финансово поддержано грантом U.G.M. от NIH (2R01AI049424) и грантом U.G.M. от Миннесотской сельскохозяйственной экспериментальной станции (MIN-17-078).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ген пульсатора с зазором 0,1 см электропорационная кюветаBio-Rad1652083
2 мкм; m фильтр по размеру пор GE Healthcare Life Sciences Whatman6783-2520
5 мл шприц с люэровским замком BD309646
60-90 зернистость из карбида кремния LORTONE, вкл  591-056
Абсолютный метанолFisher ScientificA457-4
Бактотриптозофосфатный бульон BD260300
Центрифуга Cytospin4Thermo Fisher ScientificA78300003Ротор съемный, поэтому весь ротор может быть помещен в колпак для загрузки инфекционных образцов
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)QIAGEN12362используется для получения плазмиды pRAM18dSFA без эндотоксинов расширенный
перенос тонкого наконечника пипетки Perfector ScientificTP03-5301
фетальная бычья сыворотка Gemini Bio900-108Партия FBS должна быть протестирована, чтобы убедиться, что клетки ISE6 будут хорошо расти в ней.
Электропоратор Gene Pulser II с импульсным контроллером PLUSBio-Rad165-2105 & 165-2110
гемоцитометрThermo Fisher Scientific267110
HEPESMillipore-SigmaH4034
ImageJНациональный институт здравоохранениянеобработанных изображений
KaryoMAX Giemsa stain Gibco  2021-10-30
Leibovitz's L-15 mediumGibco41300039
концентрат липопротеинов MP Biomedicals191476
Nikon DiaphotNikonэпифлуоресцентный микроскоп
NucBlue Live ReadyProbes Reagent Thermo Fisher ScientificR37605
Дисковый сканирующий модуль (DSU) Olympus) конфокальный микроскоп Счетная камера Olympus
Petroff-HausserHausser Scientific  Камера 3900
бикарбонат натрияMillipore-SigmaS5761
VortexFisher Vortex Genie 212-812
Фиджи редактирование

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gillespie, J. J., et al. Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis. PLoS One. 2 (3), 266(2007).
  2. Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution. Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).
  3. Parola, P., Paddock, C. D., Raoult, D. Tick-borne rickettsioses around the world: Emerging diseases challenging old concepts. Clinical Microbiology Reviews. 18 (4), 719-756 (2005).
  4. Fang, R., Blanton, L. S., Walker, D. H. Rickettsiae as emerging infectious agents. Clinics in Laboratory Medicine. 37 (2), 383-400 (2017).
  5. Von Wintersdorff, C. J., et al. Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer. Frontiers in Microbiology. 7, 173(2016).
  6. Winkler, H. H. Rickettsia species (as organisms). Annual Review of Microbiology. 44 (1), 131-153 (1990).
  7. Wood, D. O., Azad, A. F. Genetic manipulation of rickettsiae: A preview. Infection and Immunity. 68 (11), 6091-6093 (2000).
  8. Perlman, S. J., Hunter, M. S., Zchori-Fein, E. The emerging diversity of Rickettsia. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1598), 2097-2106 (2006).
  9. McClure, E. E., et al. Engineering of obligate intracellular bacteria: Progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 544-558 (2017).
  10. Rachek, L. I., Tucker, A. M., Winkler, H. H., Wood, D. O. Transformation of Rickettsia prowazekii to rifampin resistance. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2118-2124 (1998).
  11. Troyer, J. M., Radulovic, S., Azad, A. F. Green fluorescent protein as a marker in Rickettsia typhi transformation. Infection and Immunity. 67 (7), 3308-3311 (1996).
  12. Kim, H. K., Premaratna, R., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Rickettsia conorii O antigen is the target of bactericidal Weil-Felix antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (39), 19659-19664 (2019).
  13. Burkhardt, N. Y., et al. Development of shuttle vectors for transformation of diverse Rickettsia species. PLoS One. 6 (12), 29511(2011).
  14. Welch, M. D., Reed, S. C., Lamason, R. L., Serio, A. W. Expression of an epitope-tagged virulence protein in Rickettsia parkeri using transposon insertion. PloS One. 7 (5), 37310(2012).
  15. Oliver, J. D., Burkhardt, N. Y., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. Motility characteristics are altered for Rickettsia bellii transformed to overexpress a heterologous rickA gene. Applied and Environmental Microbiology. 80 (3), 1170-1176 (2014).
  16. Kurtti, T. J., Burkhardt, N. Y., Heu, C. C., Munderloh, U. G. Fluorescent protein expressing Rickettsia buchneri and Rickettsia peacockii for tracking symbiont-tick cell interactions. Veterinary Sciences. 3 (4), 34(2016).
  17. Oliver, J. D., Chávez, A. S., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. An Ixodes scapularis cell line with a predominantly neuron-like phenotype. Experimental and Applied Acarology. 66 (3), 427-442 (2015).
  18. Grabowski, J. M., Gulia-Nuss, M., Kuhn, R. J., Hill, C. A. RNAi reveals proteins for metabolism and protein processing associated with Langat virus infection in Ixodes scapularis (black-legged tick) ISE6 cells. Parasites & Vectors. 10 (1), 1-4 (2017).
  19. Al-Rofaai, A., Bell-Sakyi, L. Tick cell Lines in research on tick control. Frontiers in Physiology. 11, 152(2020).
  20. Wang, X. R., et al. Mitochondrion-dependent apoptosis is essential for Rickettsia parkeri infection and replication in vector cells. mSystems. 6 (2), 01209-01220 (2021).
  21. Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
  22. Riley, S. P., Macaluso, K. R., Martinez, J. J. Electrotransformation and clonal isolation of Rickettsia species. Current Protocols in Microbiology. 39, 1-20 (2015).
  23. Burkhardt, N. Y., et al. Examination of rickettsial host range for shuttle vectors based on dnaA and parA genes from the pRM plasmid of Rickettsia monacensis. Applied and Environmental Microbiology. 88 (7), 00210-00222 (2022).
  24. Kurtti, T. J., et al. Rickettsia buchneri sp. nov., a rickettsial endosymbiont of the blacklegged tick Ixodes scapularis. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 965(2015).
  25. Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Formulation of medium for tick cell culture. Experimental & Applied Acarology. 7 (3), 219-229 (1989).
  26. Bell-Sakyi, L. Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum. The Journal of Parasitology. 77 (6), 1006-1008 (1991).
  27. Mattila, J. T., Burkhardt, N. Y., Hutcheson, H. J., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Isolation of cell lines and a rickettsial endosymbiont from the soft tick Carios capensis (Acari: Argasidae: Ornithodorinae). Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1091-1101 (2007).
  28. Bell-Sakyi, L., Růžek, D., Gould, E. A. Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata. Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

RickettsiaRickettsia parkeri

Похожие статьи