Методическая статья

Культивирование, замораживание, обработка и визуализация целых органоидов и сфероидов еще в гидрогеле

DOI:

10.3791/64563

⸱

23 декабря 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Research Institute for Health Sciences and Technologies (SABITA), Istanbul Medipol University, 2Cellorama, 3Cancer and Stem Cell Research Center, Maltepe University, 4Department of Histology and Embryology, School of Medicine, Maltepe University, 5Department of Medical Biology, School of Medicine, Maltepe University, 6School of Medicine, Koc University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящем исследовании описываются методологии культивирования, замораживания, оттаивания, обработки, окрашивания, маркировки и изучения целых сфероидов и органоидов под различными микроскопами, в то время как они остаются нетронутыми в гидрогеле в многоцелевом устройстве.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Органоиды и сфероиды, трехмерные растущие структуры в лабораториях клеточных культур, становятся все более признанными в качестве превосходных моделей по сравнению с двумерными моделями культур, поскольку они лучше имитируют человеческое тело и имеют преимущества перед исследованиями на животных. Тем не менее, эти исследования обычно сталкиваются с проблемами воспроизводимости и последовательности. Во время длительных экспериментальных процессов - с переносом органоидов и сфероидов между различными сосудами клеточной культуры, пипеткой и центрифугированием - эти восприимчивые и хрупкие 3D-растущие структуры часто повреждаются или теряются. В конечном счете, результаты существенно влияют, так как 3D-структуры не могут поддерживать те же характеристики и качество. Методы, описанные здесь, минимизируют эти стрессовые этапы и обеспечивают безопасную и последовательную среду для органоидов и сфероидов на протяжении всей последовательности обработки, пока они все еще находятся в гидрогеле в многоцелевом устройстве. Исследователи могут выращивать, замораживать, оттаивать, обрабатывать, окрашивать, маркировать, а затем исследовать структуру органоидов или сфероидов с помощью различных высокотехнологичных инструментов, от конфокальных до электронных микроскопов, используя одно многоцелевое устройство. Эта технология улучшает воспроизводимость, надежность и валидность исследований, сохраняя при этом стабильную и защитную среду для 3D-растущих структур во время обработки. Кроме того, устранение стрессовых шагов сводит к минимуму ошибки обработки, сокращает время и снижает риск загрязнения.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Будущее клеточных исследований и терапии лежит в 3D клеточных культурах 1,2,3. Органоидные и сфероидные модели сокращают разрыв между экспериментами in vitro и моделями на животных, создавая лучшие модели, которые имитируют развитие человеческого тела, физиологию и болезни 4,5,6,7,8,9. Однако воспроизводимость и повторяемость этих моделей остаются сложными. Кроме того, об....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Культивирование органоидов и сфероидов

  1. Поместите гидрогель на лед на ночь (в холодильник или холодную камеру) для размораживания.
  2. Поместите коммерчески доступное многоцелевое устройство (MD; см. Таблицу материалов) в инкубатор за 1 день до эксперимента (37 °C, 5% CO2) для нагревания.
  3. Поместите стерильные ширококонечные наконечники пипеток в холодильник при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 1.1-1.3 должны быть выполнены в День 0, а шаги 1.4-1.11 должны быть выполнены в День 1.
  4. Поместите гидрогель на лед в ламинарную вытяжку на 15 минут.
    1. Необязательно: Разбавьте гидрогель ....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящая статья представляет собой многоцелевое устройство (MD) и дополняющие методологии для культивирования, замораживания, оттаивания, гистологического окрашивания, иммуногистохимического окрашивания, иммунофлуоресцентной маркировки, покрытия и обработки целых органоидов или сфероидов, все еще находясь в гидрогеле в единой уникально спроектированной среде. Текущее исследование было разработано для приготовления сфероидов рака печени HepG2 в 35 каплях гидрогеля в 35 MD. Эксперименты проводились в трех экземплярах для .......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MD, дополняя описанные здесь составы и протоколы, способствует быстрому и спонтанному 3D-росту органоидов и сфероидов в более контролируемой среде и продолжает эксперимент в тех же условиях. Образец остается в одной и той же среде в течение всего процесса, и почти 100% 3D-архитектур выращивания остаются нетронутыми в контейнере. Это улучшает однородность во время последовательных экспериментов и позволяет продлить период культивирования. Кроме того, количество этапов обработки органоидов и сфероидов резко уменьшается по .......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ранан Гулхан Актас владеет патентными заявками MD, S-IHC, S-IF и FS. Ольгу Энис Ток принимал участие в разработке этих продуктов. Ольгу Энис Ток и Гамзе Демирель являются членами команды R&D компании под названием Cellorama. Юсуф Мустафа Саатчи, Зейнеп Акбулут и Озгеджан Каялар не имеют никаких конфликтов интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарны Дейлу Мертесу из Чикагского университета за подготовку диаграмм, доктору Мехмету Серифу Айдыну за его техническую поддержку в Стамбульском научно-исследовательском институте медицинских наук и технологий Университета Медипол и доктору Ране Каземи из Университета Малтепе за редактирование рукописи.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Абсолютный этанол (EtOH)Merck8187602500развести в dH2O до получения 30%, 50%, 70%, 80%, 90% и 96% раствора и хранить в RT
АцетонMerck8222512500Хранить в RT
Alexa агглютинин зародышей фтористой пшеницы и Hoechst  в сбалансированном солевом растворе Хэнка (HBSS)  InvitrogenI34406Image-IT LIVE, хранить при температуре -20 °°; C
альфа-1-фетопротеин (АФП) концентрированный и предварительно разведенный поликлональный антителоBiocare MedicalCP 028 Aхранить при +4 °°; C
Антиальбуминовое антителоAbcamEPR20195хранить при +4 ° C, Разведение: 1:50
Антитела против бета-галактозидазы, куриный поликлональныйAbcam134435Хранить при +4 °°; C, Разведение: 1:25
Анти-цитокератин 5Abcam53121Хранить при +4 °°; C, разведение: 1:100
концентрированное и предварительно разведенное моноклональное антитело аргиназы-1Biocare MedicalACI 3058 A, BХранить при +4 ° C, разбавление: 1:50
Кальция хлорид (CaCl2)SigmaC1016-500GРастворить в фиксаторе Карновского с получением 2 мМ CaCl2; хранить в
RT Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8)Abcamab28554
Центрифужные пробирки, 15 мл Nest601051
Центрифужные пробирки, 50 мл&nbл;Гнездо602052
Класс II Шкаф микробиологической безопасности Bio II Advance PlusTelstarEN12469
CO2 ИнкубаторPanasonicKM-CC17RU2
Copper Grids ElectronMicroscopy SciencesG100-CuУльтратонкие срезы, помещенные на решетки; 100 линий/дюйм квадратная ячейка
Осушитель для критических точекLeicaEM CPD300Для сушки биологических образцов для СЭМ в смеси растворов хромогена абсолютного ацетона
DAB/AEC  Sigma AldrichAEC101Магазин при +4 ° град; C
Алмазный ножDiatomeUltra 45°, 40-USИспользование для ультратонких секций для TEM
Диметилсульфоксид для молекулярной биологииBiofroxx67-68-5
Одноразовый пластиковый Pasteur PippettesNest
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco41966-029Хранить в +4 ° C
Эозин Y раствор спиртовойяркий слайд2.BS01-105-1000
Эпон смола Sigma45359-1EA-FНабор для встраивания эпоксидной смолы, хранение при температуре +4 °°; C
Фетальная бычья сыворотка с добавкой Укрепляющаясковорода BiotechP30-3304хранить при +4 °
C Замораживающий раствор (FS)CelloramaCellO-Fхранить при температуре +4 °°; C
Производитель стеклянных ножейLeicaEM KMR3Для изготовления стеклянных ножей толщиной 8 мм
Полоски стеклянных ножей (размер 8 мм x 25,4 мм x 400 мм)Leica7890-08Использование для ультра- или полутонких срезов для
водного раствора глутаральдегида TEM, класс EM, 25% Электронная микроскопия наук16210Развести в dH2O до получения 2,5% раствора и хранить при +4 °°;
C Раствор глицеринаSigma Aldrich56-81-5Хранить при -20 С, Разведение: 1:100
Козье антикуриное IgY (H+L) Вторичное антитело, Alexa, 647InvitrogenA32933Хранить в RT
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Вторичное антитело, DyLight, 488Invitrogen35502Хранить при +4 ° С,  Разведение: 1:50
Вторичное антитело козы против мыши IgG (H+L), DyLight, 550Invitrogen84540Хранить при +4 ° С,  Разведение: 1:50
Вторичное антитело козы против кролика IgG (H+L), DyLight, 488Invitrogen35552Хранить при +4 ° С,  Разведение: 1:50
Вторичное антитело козы против кролика IgG (H+L), DyLight, 550Invitrogen84541Хранить при +4 ° C
Гематоксилин Harris Bright Slide2.BS01-104-1000
Клетки HepG2ATCCHB-8065Хранение в азотном баке
Человек/Крыса OV-6 Антитела Моноклональная мышь IgG1 Клон # OV-6R& D SystemsMAB2020хранить при -20 °°; C
HydrogelCorning354248Matrigel, матрица базальной мембраны высокой концентрации (HC), без LDEV, 10 мл, хранить при температуре -20 °°С; C
HydrogelCorning354234Matrigel, матрица базальной мембраны, без LDEV, 10 мл, хранить при температуре -20 °°С; C
ГидрогельThermoFischer ScientificA1413201Geltrex, Матрица базальной мембраны без LDEV Material Membrane Hydrogel
Biotechne, R& D SystemsBME001-01Cultrex Ultramatrix RGF BME, хранить при -20 ° C
Фиксатор%2 PFA, %2,5 глутаральдегида в 0,15 М какодилатном буфере, 2 мМ CaCl<суб>2; готовить в свежем виде; использовать для ПЭМ и Образцы СЭМ
L-аспарагиновая кислотаSigma11189-100GХранить в РТ
растворРастворить 40 мг аспарагиновой кислоты в 10 мл ddH2O и добавить 66 мг нитрата свинца. Стабилизация раствора при 60 °°; C и отрегулировать pH до 5; готовим свежий
нитрат свинцаэлектронная микроскопия Sciences17900Магазин в RT
Leica Конфокальный микроскопLeicaDMi8
LSM 700 Лазерный сканирующий конфокальный микроскопZeiss
Микропланшетный ридерBiotek Synergy
Многоцелевое устройство (MD)CelloramaCellO-M
Ядерно-ДНК-красительInvitrogenH3569Hoechst 33258, Пентагидрат (бис-Бензимид) - 10 мг/мл раствор в воде, хранить при температуре +4 °deg; C
Окрашивание ядерной ДНКThermoFischer Scientific62248DAPI раствор, хранить при +4 °de; C
Тетраоксид осмия (OsO4) ,4%Electron Microscopy Sciences19190Развести в dH2O с получением 2% раствора; хранить при +4 ° C и в герметичном контейнере; защита легких
антител Ov6R& D системыMAB2020Хранить при +4 °de; C
Раствор параформальдегида (PFA), 4% Sigma1.04005.1000Растворить 4% PFA в dH2O и вскипятить, охладить и аликвотировать; хранить при -20°; C
Раствор параформальдегида 4% в PBS, 1 лSanta Cruz Biotechnologysc-281692Хранить при +4 ° C
фосфатный буферный раствор (PBS), таблеткиMP Biomedicals, LLC2810305
Постфиксационный раствор%2 OsO4, %2,5 Ферроцианид калия в dH2O; готовьте свежий
водный раствор ферроцианида калия, 5% Электронная микроскопияSciences 26603-01Магазин в RT
Primovert - Инвертированный светлопольный микроскоп - ZEISSZeissАртикул: 491206-0001-000
Микроцентрифужные пробирки с круглым дном, 2 млГнездо620611
сканирующая электронная микроскопия с насадкой STEMZeissGeminiSEM 500Для сканирования электронных микрофотографий мы используем детектор вторичных электронов (SE) Inlens на 2-3 кВ и детектор aSTEM на 30 кВ на 30 кВ.
SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab PackScyTek LaboratoriesSHP125Хранить при +4 ° C
Буфер для какодилата натрия, 0,4 м, pH 7,2Электронная микроскопия Sciences11655Развести в dH2O до 0,2 М и хранить при +4 °°; C
Натрий/калий-АТФаза антитела альфа-1 [M7-PB-E9]GeneTexGTX22871хранить при -20 °deg; C
раствор для иммунофлуоресцентного мечения (S-IF)CelloramaCellO-IFхранить при температуре +4 °°;
С раствор для иммуногистохимии (S-IHC)CelloramaCellO-Pхранить при +4 °deg; C
Устройство для обрезки образцовLeicaEM TRIM2Для подготовки эпона блок до ультрамикротома
Sputter coater CoaterLeicaEM ACE200Покрытие образцов SEM 6 нм золото/палладий в течение 90 с
Тиокарбогидразид (ТЧ)Sigma223220-5GРазведите в dH2O до получения 0,5% раствора и отфильтруйте с 0,22 &; м мембранный фильтр; магазин в RT; приготовить свежий
Trypan Blue Solution, 0,4%Gibco15250061
Ultra gel супер клейPattexPSG2CДля приклеивания полимеризованного эпонового блока с образцом к держателю эпон
UltramicrotomeLeicaEM UC7Для приготовления высококачественных ультра- или полутонких срезов для просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ)
Универсальные наконечники для пипеток, 10 & микро; LNest171215-1101
Универсальные наконечники для пипеток, 1000 & микро; LIsolabL-002
Универсальные наконечники для пипеток, 200 & микро; Л Nest110919HA01
Уранилацетатэлектронная микроскопия науки22400Разбавить в dH2O до получения 2% раствора и отфильтровать с 0,22 &m; м мембранный фильтр; хранить плотно закрытую тару хранилища в РТ
Набор для маркировки плазматических мембран и ядер Карновского аспартата свинца

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  2. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  3. Nath, S., Devi, G. R.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи