Культивирование, замораживание, обработка и визуализация целых органоидов и сфероидов еще в гидрогеле

Будущее клеточных исследований и терапии лежит в 3D клеточных культурах ^1,2,3. Органоидные и сфероидные модели сокращают разрыв между экспериментами in vitro и моделями на животных, создавая лучшие модели, которые имитируют развитие человеческого тела, физиологию и болезни 4,5,6,7,8,9. Однако воспроизводимость и повторяемость этих моделей остаются сложными. Кроме того, обработка, сбор, перенос и центрифугирование этих структур с помощью современных технологий приводит к потере или повреждению органоидов и сфероидов во многих условиях, что значительно влияет на результаты.

Несмотря на множество протоколов гистологического окрашивания, иммуногистохимического окрашивания, иммунофлуоресцентной маркировки и криоконсервации, не существует универсального подхода, связанного со стандартизацией экспериментальных условий, обработкой и обработкой этих деликатных структур без их потери или повреждения. Современные протоколы также невероятно длинные, чередующиеся от нескольких дней до нескольких недель, и включают в себя сложные процедуры с различными реагентами 10,11,12,13,14. Кроме того, сбор, пипетка, центрифугирование и перенос 3D-растущих структур между сосудами клеточной культуры и криовиалами вызывают изменения в позиционировании структур и механических сил и в конечном итоге влияют на дифференцировку и созревание органоидов и сфероидов. Сообщалось, что топология тканей, позиционирование клеток и механические силы значительно влияют на дифференцировку и созревание клеток 6,15,16,17.

Поэтому желательно усовершенствовать современные традиционные технологии получения органоидов и сфероидов со стабильным качеством. Способ/устройство, которое пропустит центрифугирование и другие этапы, описанные выше, и обеспечит материал в единой безопасной среде от начала до конца нескольких процессов, было бы полезно для получения наиболее последовательных и надежных данных. Кроме того, это сократит временные, трудовые и финансовые ограничения.

Многоцелевое устройство (MD), описанное здесь, обеспечивает единую безопасную среду для нескольких процессов органоидов и сфероидов (дополнительный рисунок 1). Это устройство и дополняющие его протоколы исключают этапы сбора, пипетирования, передачи и центрифугирования. Органоиды и сфероиды остаются в своей среде in vitro во время последовательных процессов. Эта среда в основном содержит природные или синтетические компоненты внеклеточного матрикса, такие как коммерчески доступные гидрогели. Другими словами, методы, описанные здесь, позволяют обрабатывать, исследовать и замораживать целый образец органоидов / сфероидов, все еще находясь в капле гидрогеля.

Биосовместимое устройство устойчиво к температурам от 60 °C до -160 °C, что позволяет восстанавливать органоиды/стероиды в резервуаре с жидким азотом при -160 °C или готовить смоляные блоки для электронной микроскопии при 60 °C. Ниша в устройстве была разработана для определения ограниченного пространства для 3D-растущих структур и стимулирования образования сфероидов или органоидов на основе предыдущих исследований 18,19,20,21,22,23. Эта часть устройства прозрачна и содержит специфический пластик, который обеспечивает высокое оптическое качество (показатель преломления: 1,43; значение аббе: 58; толщина: 7,8 мил [0,0078 дюйма или 198 мкм]). Как ниша, так и окружающая «боковая» часть вызывают автофлуоресценцию. Прозрачная ниша в центре имеет площадь 80^мм2, в то время как боковая часть составляет 600^мм2. Глубина контейнера составляет 15 мм, а толщина – 1,5 мм. Эти особенности, помимо размеров и конструкции прибора, позволяют производить наблюдения под разными типами высокотехнологичных микроскопов и готовить образцы к электронно-микроскопическим исследованиям (рисунок 2). Система закрытия устройства обеспечивает два положения, одно из которых герметично в морозильной камере, а другое позволяет потоку газа в инкубаторе. Анализы пролиферации и цитотоксичности CCK8 демонстрируют аналогичное воздействие на клетки по сравнению с традиционными чашками для клеточной культуры (дополнительный рисунок 2). Тест на исключение синего трипана демонстрирует высокую жизнеспособность клеток (94%) во время клеточной культуры в MD (рисунок 3).

Процессы, которые могут быть выполнены для одного образца в одном устройстве, включают (1) культивирование, (2) гистологическое окрашивание, (3) иммуноокрашивание, включая иммуногистохимическую и иммунофлуоресцентную маркировку, (4) замораживание, (5) оттаивание, (6) исследование под оптическими микроскопами, такими как микроскопы яркого поля, темного поля, флуоресценции, конфокальные микроскопы и микроскопы сверхвысокого разрешения, (7) покрытие и исследование непосредственно под сканирующим электронным микроскопом или (8) подготовку к просвечивающей электронной микроскопии ( Рисунок 2).

Существуют различные методологии для гистологического окрашивания, иммуногистохимической маркировки или флуоресцентной маркировки органоидов и сфероидов 10,11,12,13,14,24,25. Сбор их из гидрогеля является первым и основным этапом современной технологии. После этого этапа некоторые методы позволяют полностью установить иммуномаркировку. Извлеченные органоиды встроены в парафин, разделены и помечены для окрашивания и иммуноокрашения в других. Однако разделы могут не представлять весь образец и предоставлять только ограниченные данные, связанные с 3D-архитектурой структуры. Кроме того, повреждение этих 3D-структур и потеря антигенности являются хорошо известными побочными эффектами этих технологий.

Дополняющие новые протоколы микроскопических исследований в этой статье позволяют анализировать цельномонтные образцы, все еще находящиеся в гидрогеле. Протоколы, описанные здесь, включают два недавно разработанных состава: раствор для иммуногистохимии (S-IHC) и раствор для иммунофлуоресцентной маркировки (S-IF). Методы с этими решениями позволяют исследователям получать более точные данные, поскольку нет вредных последствий традиционных рабочих процессов, таких как центрифугирование, пипетка и перенос деликатных структур. Протокол, описанный здесь, также устраняет необходимость в сборах, блокировании, очистке и извлечении антигенов и сокращает всю процедуру до 6-8 ч. Кроме того, методика позволяет одновременно добавлять от одного до трех антител к одному и тому же S-IF. Таким образом, можно получить результаты в один и тот же день даже после нескольких экспериментов по маркировке, что является еще одним преимуществом протокола, описанного здесь; Традиционные протоколы маркировки иммунофлуоресценции обычно занимают от 3 дней до нескольких недель 10,11,12,13,14.

Встраивание парафина, еще один вредный шаг, снижающий антигенность, также опущено. 3D-структура остается в своей среде in vitro от начала до конца микроскопического исследования. Поскольку 3D-структура остается в условиях выращивания, данные экспрессии и локализации белка лучше имитируют условия in vivo. Ожидаются более точные результаты, поскольку методология исключает этапы, влияющие на экспрессию антигена образца. В таблицах 1 и 2 показано, как эти новые протоколы устраняют этапы, экономят время и трудозатраты в лаборатории, а также снижают затраты и отходы по сравнению с традиционными рабочими процессами.

В дополнение к критическим шагам, описанным выше, другой проблемой является обеспечение криоконсервационной среды и метода сохранения 3D-структуры образца с более высокими показателями жизнеспособности клеток 26,27,28,29,30,31. Криоконсервация необходима для создания стабильной модельной системы и обеспечения биобанкинга органоидов и сфероидов^32,33. Биобанкинг всей оригинальной 3D-структуры позволит более точно повторить естественное состояние здоровья или болезни. Ключевыми соображениями являются удобство и надежность криоконсервации и оттаивания органоидов/сфероидов. Восстановление органоидов после оттепели очень низкое в большинстве современных технологий, часто менее 50%. Тем не менее, недавние исследования показали многообещающие результаты с улучшенными показателями выживаемости ^26,27,28,29. Lee et al. продемонстрировали, что 78% сфероидных клеток выжили после криоконсервации, когда они использовали раствор Университета Висконсина, содержащий 15% DMSO²⁸. Коэффициент выживаемости клеток увеличился до 83% в исследовании Arai et ^al.29. Тем не менее, результаты после криоконсервации значительно влияют, поскольку 3D-структуры не могут поддерживать те же характеристики и качество. Кроме того, безсывороточные реагенты необходимы для надлежащей производственной практики в фармацевтических и диагностических учреждениях. Традиционные рабочие процессы используют среду, содержащую фетальную бычью сыворотку (FBS) и диметилсульфоксид (DMSO) для метода медленного замораживания, оба из которых связаны с инвалидностью. FBS является продуктом животного происхождения и может иметь варианты партии. ДМСО является очень успешным криопротектором, но длительное воздействие, особенно во время оттаивания, может вызвать цитотоксические эффекты^30,31.

В этой статье также описывается методология замораживания / оттаивания целых органоидов или сфероидов, все еще находящихся в гидрогеле. В исследовании используются две формулы для замораживания органоидов и сфероидов: (1) 10% ДМСО, содержащий традиционный морозильный раствор (ФС) и (2) безкриоконсервационная среда без сыворотки и ДМСО. Эта криоконсервационная среда содержит компоненты внеклеточного матрикса, которые отличаются от современных формул. Внеклеточный матрикс содержит два основных класса макромолекул, протеогликанов и волокнистых белков, которые необходимы для физического формирования каркасов для клеточных компонентов, но также инициируют процессы, необходимые для морфогенеза, дифференцировки и гомеостаза 34,35,36,37,38,39,40 . Коллагены обеспечивают прочность на растяжение, регулируют адгезию клеток, поддерживают хемотаксис и миграцию, а также направляют развитие тканей³⁷. Кроме того, волокна эластина обеспечивают отдачу тканям, которые подвергаются повторному растяжению³⁸. Третий фиброзный белок, фибронектин, направляет организацию интерстициального внеклеточного матрикса и играет решающую роль в опосредовании прикрепления клеток и функционирует как внеклеточный механорегулятор³⁹. Du et al. продемонстрировали криопротекторное действие гидролизата куриного коллагена на естественную модельную систему⁴¹ актомиозина. Их результаты показывают, что гидролизат коллагена может ингибировать рост кристаллов льда, уменьшать замораживание-денатурацию и окисление белка аналогично коммерческим криопротекторам и обеспечивать лучшую структуру геля после циклов замораживания-оттаивания. Таким образом, добавление компонентов внеклеточного матрикса в криоконсервационную среду обеспечивает более безопасную и защитную среду для образца и поддерживает заживление живых структур после замораживания-оттаивания.

Кроме того, настоящее исследование описывает простой протокол для маркировки цитоплазматических мембран и ядер живых органоидов и сфероидов, пока они все еще находятся в гидрогеле.

1. Культивирование органоидов и сфероидов

1. Поместите гидрогель на лед на ночь (в холодильник или холодную камеру) для размораживания.
2. Поместите коммерчески доступное многоцелевое устройство (MD; см. Таблицу материалов) в инкубатор за 1 день до эксперимента (37 °C, 5% CO₂) для нагревания.
3. Поместите стерильные ширококонечные наконечники пипеток в холодильник при температуре 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 1.1-1.3 должны быть выполнены в День 0, а шаги 1.4-1.11 должны быть выполнены в День 1.
4. Поместите гидрогель на лед в ламинарную вытяжку на 15 минут.
   1. Необязательно: Разбавьте гидрогель в культуральной среде холодных клеток в соответствии с рекомендацией производителя.
5. Поместите на лед трубку, содержащую гранулу клеток HepG2 (коммерчески полученная клеточная линия гепатоцеллюлярной карциномы; см. Таблицу материалов).
6. Пластина 30-35 мкл 100% гидрогеля в нише предварительно разогретого устройства для создания капли геля.
7. Поместите 10 000 клеток HepG2 в середину верхней части каждой капли гидрогеля (рисунок 2) и инкубируйте в течение 15 мин при 37 °C.
8. Покройте каплю гидрогеля 200 мкл модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM) 10% фетальной бычьей сывороткой.
9. Закройте крышку MD в правильном положении, чтобы обеспечить поток газа, и поместите устройство в инкубатор.
10. Кормите клетки 200 мкл DMEM с 10% FBS через день.
11. Проверьте рост сфероидов под перевернутым микроскопом (рисунок 3). Образование сфероидов начинается после^3-го дня. На видео 1 показано расположение сфероидов на разных уровнях в гидрогелевом куполе.
    ПРИМЕЧАНИЯ: Настоятельно рекомендуется осторожно аспирировать жидкость, окружающую гидрогель, и медленно добавлять новую жидкость в окружающую среду, чтобы предотвратить повреждение капель гидрогеля.

2. Окрашивание гематоксилином и эозином целых органоидов/сфероидов в гидрогель

1. Прогреть фиксатор (4% параформальдегид; PFA), PBS и гематоксилин (см. Таблицу материалов) до 37 °C.
2. Аспирировать среду, окружающую каплю гидрогеля, пипеткой, добавить 100-200 мкл 4% PFA для фиксации и инкубировать в течение 15-20 мин при 37 °C.
3. Аспирировать 4% PFA и добавить 200 мкл PBS для промывки 3x в течение 5 мин каждый при 37 °C. Затем аспирируют PBS и инкубируют с 200 мкл раствора гематоксилина в течение 15-20 мин при 37 °C.
4. Аспирировать гематоксилин и добавить 200 мкл dH_2Oдля промывки 3x в течение 10 мин при 37 °C. Аспирировать dH_2Oи инкубировать с 200 мкл этанола в течение 5-10 мин при 37 °C.
5. Аспирировать этанол и инкубировать с 200 мкл Эозина (см. Таблицу материалов) в течение 10 мин при 37 °С. Аспирировать Эозин и добавить 200 мкл dH_2Oдля промывки в течение 5 мин при комнатной температуре (RT).
6. Аспирировать dH_2Oи добавить 100 мкл глицерина, чтобы покрыть каплю гидрогеля в качестве монтажной среды.
7. Дополнительно: Установите нишу с помощью крышки. Этот шаг может быть опущен, чтобы избежать сжатия органоидов / сфероидов значительного размера.
8. Плотно закройте крышку MD, чтобы избежать высыхания до осмотра. Образец стабилен для исследования не менее 6 месяцев.

3. Иммуногистохимия цельногорных органоидов/сфероидов в гидрогеле

1. Нагреть коммерчески полученный раствор для иммуногистохимии (S-IHC; см. Таблицу материалов) до 37 °C.
2. Инкубируют органоиды или сфероиды в гидрогеле с 3% перекисью водорода (_H2O2) в 200 мкл dH_2Oв течение 5 мин при 37 °C.
3. Аспирировать раствор перекиси водорода и промыть в dH_2Oв течение 5 мин при 37 °C. Аспирировать dH_2Oи инкубировать дважды со 100 мкл S-IHC при 37 °C в течение 10 мин каждый.
4. Аспирировать S-IHC и инкубировать со 100 мкл первичных антител (см. Таблицу материалов), разбавленных в S-IHC в течение 1-2 ч при 37 °C (в соответствии с рекомендациями производителя относительно рабочего разбавления).
5. Аспирировать раствор первичного антитела и инкубировать со 100 мкл S-IHC 3x в течение 5 мин каждый при 37 °C.
6. Аспират 100 мкл S-IHC и инкубат с биотинилированным вторичным антителом (см. Таблицу материалов) в течение 10 мин при 37 °C.
7. Аспирировать раствор вторичного антитела и инкубировать со 100 мкл S-IHC 3x в течение 5 мин каждый при 37 °C. Аспирировать S-IHC и инкубировать со 100 мкл пероксидазы хрена (HRP), меченной стрептавидином (см. Таблицу материалов) в течение 10 мин при 37 °C.
8. Аспирировать HRP меченый стрептавидин и инкубировать со 100 мкл S-IHC 3x в течение 5 мин каждый при 37 °C.
9. Аспирировать S-IHC и инкубировать со 100 мкл смеси растворов хромогена DAB/AEC (см. Таблицу материалов) в течение 5-10 мин при 37 °C.
10. Контролируйте интенсивность окрашивания под световым микроскопом.
11. Стирайте с dH₂O 3x в течение 2 мин каждый.
12. Необязательно: Инкубировать со 100 мкл гематоксилина (см. Таблицу материалов) для ядерного контрокрашивания в течение 5 мин при 37 °C.
13. Аспирировать гематоксилин и промыть в dH_2Oв течение 5 мин.
14. Аспирировать dH_2Oи покрыть каплю гидрогеля 100 мкл глицерина в качестве монтажной среды.
15. Плотно закройте крышку МД до микроскопического исследования.
    ПРИМЕЧАНИЯ: Этапы извлечения антигена и блокирования белка в этом протоколе опущены, поскольку S-IHC исключает эти шаги.

4. Иммунофлуоресцентная маркировка целых органоидов/сфероидов в гидрогеле

1. Разогрейте следующие материалы до 37 °C: 4% PFA, PBS, S-IF, раствор первичных антител в S-IF, раствор вторичных антител в S-IF, ядерное пятно и глицерин (см. Таблицу материалов).
2. Аспирировать клеточную культуральную среду и зафиксировать 200 мкл 4% PFA в течение 15-30 мин при 37 °C. Аспирировать фиксатор и мыть в S-IF 3x в течение 10 мин каждый при 37 °C.
3. Добавьте dH₂O в сторону, окружающую нишу, чтобы обеспечить влажность во время следующих шагов.
4. Аспирировать S-IF, окружающий каплю гидрогеля, и инкубировать каплю гидрогеля со 100 мкл раствора первичного антитела (см. Таблицу материалов) в S-IF в течение 30-60 мин при 37 °C.
5. Аспирировать раствор первичных антител и промывать в S-IF 3x в течение 10 мин каждый при 37 °C.
6. Аспирировать S-IF и инкубировать со 100 мкл раствора вторичных антител (см. Таблицу материалов) в S-IF в течение 30-60 мин при 37 °C в темноте.
7. Аспирировать раствор вторичных антител и промыть PBS 3x в течение 10 мин каждый при 37 °C в темноте.
8. Аспирировать PBS и инкубировать со 100 мкл ядерно-ДНК-пятна, содержащего монтажную среду или глицерин при 37 °C в темноте.
9. Заполните нишу глицерином, чтобы избежать высыхания.
10. Необязательно: Накройте нишу чехлом. Этот шаг может быть опущен, чтобы избежать сжатия органоидов / сфероидов.
11. Плотно закройте MD. Образцы в MD могут храниться при 4 °C в темноте в течение не менее 6 месяцев с минимальной потерей флуоресценции.
12. Используйте следующие настройки для конфокального микроскопического исследования: установите значение точечного отверстия всех каналов равным 20,1, удерживайте постоянную мастера усиления на уровне 550 для 488 нм, 485 для 550 нм и 450 для 594 нм, сохраняйте постоянную мощность лазера для всех экспериментов и самый низкий процент в 2,0.
    ПРИМЕЧАНИЯ: Первичные антитела: Анти-Na-K АТФаза (1:100), Антиаргиназа (1:50), Антиальбумин (1:50), Анти-Бета-галактозидаза (1:25), Антимитохондриальное антитело (1:100), Анти-Гольджи Антитело (1:50), Анти-Цитокератин 5 (1:100), Антитело Ov6 (1:100). Вторичные антитела: Козий анти-Кролик IgG (H + L) - 488, Коза против Кролика IgG (H + L) - 550, Коза против Мыши IgG (H + L) -488, Коза против Мыши IgG (H + L) -550, Коза против Курицы IgY (H + L) -647. Разведение для всех вторичных антител составляет 1:100. Кроме того, также используется FITC-Фаллоидин (1:100), конъюгированное антитело (см. Таблицу материалов).

5. Плазматическая мембрана и маркировка ядра живых органоидов и сфероидов в гидрогеле

1. Приготовьте раствор для маркировки, содержащий агглютинин зародышей пшеницы Alexa (5,0 мкг/мл) и Hoechst (2 мкМ) в сбалансированном растворе соли Хэнка (HBSS), согласно рекомендациям производителя (см. Таблицу материалов), и прогрейте до 37 °C.
2. Аспирировать клеточную культуральную среду и добавить 100 мкл маркировочного раствора, чтобы покрыть каплю гидрогеля. Инкубировать в течение 15-30 мин при 37 °C.
3. Снимите раствор для маркировки и дважды промойте в PBS 2x в течение 10 мин каждый при 37 °C. Необязательно: Фиксировать с 200 мкл 4% формальдегида в течение 15 мин при 37 °C.
4. Накройте каплю гидрогеля глицерином в качестве монтажной среды. Дополнительно: Установите нишу с помощью защитного стекла.
5. Плотно закройте крышку MD и держите его в холодильнике в темноте до флуоресценции / конфокального микроскопического исследования. Он стабилен в течение не менее 6 месяцев.

6. Замораживание и размораживание цельномонтных органоидов/сфероидов в гидрогеле

1. Заморозьте органоиды, выполнив следующие действия.
   1. Разогрейте коммерчески полученный морозильный раствор (ФС; см. Таблицу материалов) до 37 °C.
   2. Мягко аспирируйте клеточную культуральную среду, окружающую купол гидрогеля.
   3. Осторожно добавьте 200 мкл FS. Инкубировать образец с FS при 37 °C в течение 1 ч.
   4. Плотно закройте крышку устройства и поместите его в пенопластовую коробку. Поместите эту пенопластовую коробку в другую пенопластовую коробку, как показано на дополнительном рисунке 3. Плотно закройте оба пенопластовых ящика. Два пенопластовых ящика внутри друг друга обеспечивают диапазон градиента охлаждения температуры от 1 до 2°С/мин образца в морозильной камере с температурой -20 °C.
   5. Поместите коробку при -20 °C в течение 2 ч. Переложите коробку в морозильную камеру при температуре -80 °C и оставьте на ночь.
   6. Достаньте образец из коробок. Образец в MD можно хранить в морозильной камере -80 °C в течение 6 месяцев.
   7. Перенесите MD, содержащий образец, в резервуар для жидкого азота для долгосрочного хранения.
2. Разморозьте органоиды, следуя приведенным ниже шагам.
   1. Извлеките МД, содержащий образец, из морозильной камеры/азотного резервуара и поместите его непосредственно в инкубатор при температуре 37 °C. Инкубировать в течение 1 ч при 37 °C.
   2. Добавьте в нишу 200 мкл теплой питательной среды (отношение FS к клеточной культуральной среде составляет 1:1) и инкубируйте в течение 30 мин при 37 °C.
   3. Добавьте в нишу больше теплой питательной среды (отношение ФС к клеточной культуральной среде составляет 1:2) и инкубируйте в течение 30 мин при 37 °C.
   4. Аспирируйте смесь среды и ФС осторожно. Приступают к сканирующей электронной микроскопии (стадия 7) и просвечивающей электронной микроскопии (стадия 8) визуализации органоидов/сфероидов в гидрогеле.

7. Сканирующая электронная микроскопия целых органоидов/сфероидов

1. Разогрейте фиксирующий и постфиксативный раствор Карновского (см. Таблицу материалов) до комнатной температуры (RT).
2. Аспирировать клеточную культуральную среду, окружающую гидрогель в МД. Поместите образец в MD на льду в ламинарную вытяжку на 15 минут.
3. Очень мягко аспирируйте сжиженный гидрогель, окружающий органоиды/сфероиды. Ограниченное количество матригеля может оставаться в нише, чтобы избежать повреждения и потери образца.
4. Фиксатор Карновского (2% PFA, 2,5% глутаральдегида в буфере 0,15 М какодилата и 2 мМ CaCl₂; см. Таблицу материалов) при РТ в течение 1 ч.
5. Аккуратно аспирировать фиксатор и промыть дистиллированной водой (dH₂O) 3x в течение 15 мин каждый.
6. Аспирировать dH_2Oосторожно и зафиксировать постфиксативным раствором (1% водный тетроксид осмия [OsO₄]; см. Таблицу материалов) при РТ в течение 1 ч.
7. Осторожно аспирировать постфиксирующее средство и промыть дистиллированной водой (dH₂O) 3x в течение 15 мин каждый.
8. Обезвоживание в градуированном ряду этанола (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%), смеси этанола/ацетона (1:1; 1:2) и абсолютного ацетона при РТ в течение 15 мин каждый.
9. Высушите сушилкой критической точки.
10. Покройте образец в устройстве 6-нм золотом/палладием с помощью напыляющего коатера (см. Таблицу материалов) в течение 90 с.
11. Наблюдать под сканирующим электронным микроскопом с помощью вторичного электронного детектора в линзе при 2-3 кВ в вакуумном режиме (5 х ^10-6 мА). Делайте снимки с рабочим расстоянием 8,1–8,2 мм и увеличением 675x, 1050x и 1570x.
    ПРИМЕЧАНИЯ: Все шаги выполняются в MD. Используйте 200-250 мкл раствора для каждого шага.

8. Просвечивающая электронная микроскопия цельномонтовых органоидов/сфероидов в гидрогеле

1. Разогрейте фиксатор Карновского до 37 °C. Аспирировать клеточную культуральную среду, окружающую гидрогель в МД.
2. Зафиксируйте образец фиксатором Карновского на RT в течение 1 ч. Стирайте с dH₂O 3x в течение 15 мин каждый.
3. Постфиксируют с 2% водным раствором OsO₄ и 2,5% ферроцианида калия на RT в течение 45 мин. Стирайте с dH₂O 3x в течение 10 мин каждый.
4. Инкубировать в 0,5% тиокарбогидразида (ТКП; см. Таблицу материалов) при РТ в течение 30 мин. Стирайте с dH₂O 3x в течение 10 мин каждый.
5. Инкубировать в 2% водном растворе OsO₄ при RT в течение 30 мин. Стирайте с dH₂O 3x в течение 10 мин каждый.
6. Инкубировать в 2% растворе уранилацетата (см. Таблицу материалов) на РТ в течение 1 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе сфероиды можно хранить при температуре 4 °C в течение ночи.
7. Инкубировать в растворе аспартата свинца (см. Таблицу материалов) при 60 °C в течение 45 мин. Стирайте с dH₂O 3x в течение 10 мин каждый.
8. Обезвоживание в градуированной серии этанола (50%, 70%, 90%, 100% [x2]) и абсолютного ацетона на RT в течение 15 мин каждый.
9. Обрабатывайте смесью (1:1; 1:2) ацетона/эпоновой смолы и чистой эпоновой смолы (см. Таблицу материалов) при РТ в течение 2 ч каждая.
10. Полимеризуйте смолу при 60 °C в течение ночи (минимум 16 ч). После полимеризации удалите смоляной блок из MD, как показано на дополнительном рисунке 4.
11. Прикрепите смоляной блок к более крупному с помощью смоляного клея. Обрежьте блок и доберитесь до расположения органоидов или сфероидов.
12. Получайте полутонкие (1000 нм) и ультратонкие сечения (60 нм) с помощью ультрамикротома (см. Таблицу материалов).
13. Поместите ультратонкие срезы на 100-сетчатые медные решетки и наблюдайте под сканирующим электронным микроскопом с детектором STEM при ускоряющем напряжении 30 кВ. Снимайте изображения с рабочим расстоянием 44 мм и увеличением 2580x, 5020x и 6060x.
    ПРИМЕЧАНИЯ: Используйте 200-250 мкл раствора для каждого этапа. Шаги 8.1-8.10 выполняются в MD.

Настоящая статья представляет собой многоцелевое устройство (MD) и дополняющие методологии для культивирования, замораживания, оттаивания, гистологического окрашивания, иммуногистохимического окрашивания, иммунофлуоресцентной маркировки, покрытия и обработки целых органоидов или сфероидов, все еще находясь в гидрогеле в единой уникально спроектированной среде. Текущее исследование было разработано для приготовления сфероидов рака печени HepG2 в 35 каплях гидрогеля в 35 MD. Эксперименты проводились в трех экземплярах для обеспечения точности. Кроме того, органоиды легких в MD были иммунофлуоресцентно помечены в качестве примера для демонстрации результатов текущих методологий для исследований органоидов.

На рисунке 1 показан пристальный взгляд на устройство, содержащее купол гидрогеля. Размер и форма ниши предназначены для обеспечения защитной среды для гидрогеля, содержащего органоиды / сфероиды, и сохранения реагентов, используемых во время различных процессов. Кроме того, боковая часть устройства, которая окружает нишу, может быть использована в качестве камеры влажности во время экспериментов по иммуноокрашиванию. Среда для подачи образца может варьироваться в пределах 100-200 мкл, в зависимости от высоты капли гидрогеля. Текущее исследование фокусируется на купольном методе, поскольку многие гидрогели, коммерческие компоненты внеклеточного матрикса и экстракты базальной мембраны позволяют пользователю готовить капли. Тем не менее, также можно заполнить нишу MD гидрогелем, а затем засеять клетки внутри него для генерации органоидов / сфероидов. Этот метод может быть предпочтительным, если вязкость матрицы не позволяет получить купола или если эксперимент включает большие объемы органоидов. Тип гидрогеля и соотношение гидрогель/среда для приготовления капель могут варьироваться в зависимости от типа ячейки, экспериментальной конструкции и среды. Рисунок 1  также представляет собой конструкцию устройства, которая позволяет исследовать органоиды / сфероиды под ярким полем, конфокальным и сканирующим электронным микроскопом, в то время как органоиды / сфероиды все еще находятся в своей родной среде in vitro .

На рисунке 2 показано, как засеять клетки в гидрогель и изучить развитие сфероидов или органоидов. Конструкция и размеры многоцелевого устройства также были представлены на этом рисунке. Видео 1 демонстрирует расположение 3D растущих сфероидов в гидрогеле. На рисунке 3 представлены живые изображения растущих сфероидов с 3-го по 21-й день. Время образования сфероидов и органоидов может варьироваться в зависимости от характера образца. Например, сфероиды из клеток HepG2 и HEK-клеток образовались в течение 3 дней, в то время как формирование печеночных и желчных органоидов длилось 2 недели во время экспериментов.

Гематоксилин и сфероиды, окрашенные эозином, показаны на рисунке 4. На изображении представлены хорошо сохранившиеся и однородно окрашенные сфероиды разных размеров и сплавы сфероидов. Живые клетки в центре сфероидов заслуживают внимания. Изображение также демонстрирует тонкие связи между клетками из разных сфероидов. Эти хрупкие соединения не могли быть визуализированы после традиционных рабочих процессов, поскольку передача, пипетка или центрифугирование повредили бы их. Рисунок 5  демонстрирует иммуноокрашивание сфероидов антителом, специфичным для аргиназы, одним из наиболее распространенных маркеров диагностики и прогноза гепатоцеллюлярной карциномы42,43. Микроснимки показывают дифференцированные и недифференцированные раковые клетки печени в одних и тех же сфероидах. Этот рисунок содержит изображения с и без контрокрашивания гематоксилином. Исследователи могут предпочесть опустить контрокрашивание гематоксилином в тех случаях, когда было бы трудно дифференцировать помеченные области в 3D-структуре.

Рисунок 6 представляет собой еще один простой протокол для визуализации целых рядов живых органоидов / сфероидов в гидрогеле: окрашивание живой клеточной мембраны и ядра. Методика допускает одинаковую плотность маркировки на периферии и в центре, показывая полное проникновение реагента. На рисунках 7, 8 и 9 показаны репрезентативные изображения сфероидов, помеченных одним, двумя или тремя антителами соответственно. От одного до трех первичных антител разводят в S-IF одновременно. Аналогичным образом, от одного до трех совпадающих вторичных антител, подходящих для эксперимента, разбавляют одновременно в S-IF. Протокол иммуномаркировки позволяет исследователям отмечать 3D-структуры в течение 4-6 часов, не теряя и не повреждая их. Фон прозрачен, и используемая здесь технология не требует дополнительной очистки, извлечения антигена или блокирующих методов / решений. Метод также позволяет исследователям маркировать образец несколькими антителами за один шаг. Другими словами, пользователь готовит один раствор, содержащий от одного до трех первичных антител, и другой раствор, соответствующий от одного до трех вторичных антител. Протокол, описанный здесь, исключает последовательные этапы маркировки различными антителами в обычных методологиях.

На фиг.10 представлены сканирующие и пропускающие электронные микроскопические изображения сфероидов. Первый ряд демонстрирует снимки целых сфероидов в MD под сканирующим электронным микроскопом. Второй ряд содержит просвечивающие электронные микроскопические изображения сфероидов после получения смоляных блоков, содержащих цельномонтные сфероиды в МД, а также изображения секционированных и окрашенных сфероидов. Хорошо сохранившиеся цитоплазматические органеллы и другие ультраструктурные особенности клеток демонстрируют эффективность этого простого протокола, который защищает 3D-структуру всего образца. MD также позволяет исследователям замораживать и размораживать образцы всего крепления в гидрогеле. Рисунок 11  демонстрирует гидрогелевые купола и сфероиды при более высоком увеличении до и после замерзания. Примечательна неровность на границах купола гидрогеля. Однако округлость криоконсервированных сфероидов почти стабильна после оттаивания по сравнению со сфероидами до замерзания. Методы маркировки живой клеточной мембраны и ядра также применяются через 48 ч после оттаивания, чтобы продемонстрировать, как процедура замораживания / оттаивания повлияла на 3D-архитектуру, клеточную мембрану и жизнеспособность клеток. Традиционный замораживающий раствор, содержащий диметилсульфоксид, и текущий вновь разработанный раствор, SF, демонстрируют аналогичные результаты. Более 75% 3D-структур могут выжить в этом протоколе. Однако необходимы дальнейшие эксперименты, чтобы выявить долгосрочные побочные эффекты каждого препарата на органоиды и сфероиды.

Таблица 1 и Таблица 2 сравнивают традиционные рабочие процессы с описанными здесь на основе количества шагов, продолжительности и производства отходов (т.е. общего количества пластиковых перчаток, наконечников пипеток, серологических пипеток, центрифужных трубок, микроцентрифужных трубок, сосудов для клеточных культур, криовиалов и т. Д. Для каждого рабочего процесса).

Дополнительный рисунок 1 представляет последовательные шаги, которые могут быть выполнены в одном MD схематично. Дополнительный рисунок 2 демонстрирует результаты экспериментов, предназначенных для сравнения жизнеспособности клеток, токсичности и скорости пролиферации клеток HepG2 в MD или традиционной посуде со стеклянным дном. На дополнительном рисунке 3 показаны пенопластовые коробки, которые использовались для замораживания образцов в MD. Дополнительный рисунок 4 суммирует шаги по извлечению смоляного блока из MD. Дополнительный рисунок 5 включает изображения органоидов дыхательных путей, которые были иммунофлуоресцентно помечены, а затем визуализированы, когда они все еще находились в MD. Аналогичным образом, Видео 2 демонстрирует два иммунофлуоресцентных меченых органоида дыхательных путей в MD. Наконец, дополнительный рисунок 6 представляет собой график, сравнивающий среднюю интенсивность маркировки клеточной мембраны в живых сфероидах до и после замораживания с использованием традиционного рабочего процесса и рабочего процесса, описанного здесь. Для анализа использовалось программное обеспечение Image J.

Рисунок 1: Многоцелевое устройство для культивирования клеток (MD). (A) Ниша (N), центральная часть устройства, предназначена для создания защитной среды для органоидов/сфероидов, выращенных в капле гидрогеля (D) во время последовательных процессов. Сторона (S), окружающая часть ниши, может быть использована в качестве увлажняющей камеры во время экспериментов по иммуноокрашиванию. (B) Прозрачный центр в крышке позволяет пользователю наблюдать органоиды/сфероиды, когда устройство закрыто. (C) Купол гидрогеля, содержащий органоиды в МД, может быть окрашен или встроен в смоляной блок для просвечивающей электронной микроскопии. Крышка также включает в себя нишу (N) для методологии подвесного падения. Размер и конструкция устройства позволяют пользователю исследовать органоиды / сфероиды под (D) ярким полем, (E) конфокальным и (F) сканирующим электронным микроскопом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Посев клеток внутри гидрогеля. (A) Гранула ячейки в пипетке вставляется в верхнюю часть купола. Через 3-5 дней сфероиды становятся заметны в куполе, особенно на периферии капли. (B) Четыре живых изображения растущих сфероидов из каждого квартала в куполе были захвачены и объединены. Шкала = 200 мкм. (C)Конструкция и размеры (в сантиметрах) многоцелевого устройства (MD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Развитие сфероидов в гидрогелевой капле с 3-го по 21-й день. Шкала = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Гематоксилин и Эозин-окрашенные цельномонтные сфероиды в MD. Визуализация связей между клетками, расположенными в соседних или сливающихся сфероидах. Тонкие процессы между клетками (стрелками) видны, так как цельный образец в гидрогеле фиксируется, окрашивается и исследуется без повреждения 3D-растущих структур. Шкала: день 3, день 9 = 50 мкм; день 7, день 17 = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Иммуногистохимическое окрашивание цельномонтных сфероидов в гидрогеле внутри МД. Образцы были иммуноокрашены антителом, специфичным для аргиназы. В сфероидах наблюдаются положительные (красные стрелки) и отрицательные (черные стрелки) клетки аргиназы. Изображения взяты из двух экспериментов: (A-C) без и (D-F) с контрокрашиванием гематоксилином. Шкала = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Конфокальное изображение живого органоида в гидрогеле. Живые органоиды были помечены живой клеточной мембраной (WGA) и пятнами ядра (Hoechst). Шкала = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Иммунофлуоресцентная маркировка цельномонтных сфероидов в гидрогеле с одним антителом и ядерным пятном (Hoechst).. (А-С) На верхней панели изображен сфероид, меченый антителом, специфичным для Na-K АТФазы в клеточной мембране. (Д-Ф) Нижняя панель демонстрирует расположение другого антитела, специфичного для аргиназы, цитозольного белка, специфичного для гепатоцеллюлярной карциномы, в сфероидах рака печени. Продолжительность окрашивания протокола: 6 ч. Шкала = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8: Иммунофлуоресцентная маркировка цельномонтных сфероидов в гидрогеле с двумя антителами и ядерным пятном (Hoechst).. (A-C) На верхней панели изображен сфероид, помеченный двумя антителами, специфичными для альбумина и Ov6. Шкала bar = 5 мкм. (D-F) Нижняя панель демонстрирует расположение альфа-фето-белка и Ov6 в сфероидах рака печени. Шкала бар = 20 мкм. Продолжительность окрашивания протокола: 6 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 9: Иммунофлуоресцентная маркировка цельномонтных сфероидов в гидрогеле с тремя антителами и ядерным пятном (Hoechst).. (A-E) Сфероид в верхней панели помечен антителами, специфичными для аргиназы, Na-K АТФазы и бета-галактозидазы. Шкала бара = 10 мкм. (F-J) Средняя панель демонстрирует сфероид, помеченный Ov6, бета-галактозидазой и альфа-фето-белком. Шкала бара = 20 мкм. (K-O) Сфероид в нижней панели был помечен FITC-фаллоидином, антимитохондриальным антителом и анти-Гольджи-антителом. Шкала бар = 20 мкм. Обратите внимание на высокую специфичность маркировки и уменьшенный фон. Продолжительность окрашивания протокола: 6 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 10: Изображения электронной микроскопии. (А-С) Сканирование электронно-микроскопических изображений целых сфероидов в гидрогеле в МД. Шкала бара = 10 мкм. (D-F) Ультраструктурные особенности клеток в сфероиде также были визуализированы под просвечивающим электронным микроскопом. Шкала стержней: (D) = 4 мкм; (E,F) = 2 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 11: Живые изображения сфероидов до и после замораживания. (А-Ф) Неровность границ куполов гидрогеля проявляется после замерзания. Однако размеры и округлость сфероидов остаются аналогичными. (F) Миграция клеток на поверхности культуры может быть замечена после оттаивания. (Г-Л) Живая клеточная мембрана (WGA) и окрашивание ядра (Hoechst) демонстрируют аналогичную жизнеспособность клеток и неповрежденные клеточные мембраны до и после замораживания целых сфероидов в гидрогеле в MD. Шкала basr: (A,B,D,E) = 200 мкм; (C,F,G-L) = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Сравнение количества шагов, времени и производства отходов между традиционными и новыми рабочими процессами в ходе краткосрочного эксперимента.

Таблица 2: Сравнение обычной иммуномаркировки и нового протокола иммуномаркировки.

Видео 1: Временные ряды изображений на разных уровнях гидрогеля, содержащего сфероиды, под инвертированным фазовым контрастным микроскопом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео 2: 3D-структура двух органоидов дыхательных путей, помеченных антителами к цитокератину 5 и DAPI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Дополнительный рисунок 1: Обзор эксперимента. На этой схеме показаны последовательные экспериментальные этапы выращивания и исследования целых органоидов в гидрогеле. Описанная здесь технология позволяет выращивать, замораживать, размораживать, маркировать и исследовать органоиды под разными микроскопами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Сравнение жизнеспособности, токсичности и скорости пролиферации клеток HepG2 в традиционной посуде со стеклянным дном или MD. Клетки HepG2 выращивали на (A) традиционной чашке для культивирования клеток со стеклянным дном или (B) в MD для сравнения жизнеспособности и токсичности клеток. (C) Для демонстрации жизнеспособности использовался тест на исключение синего цвета Трипана. Шкала бар = 20 мкм. Результаты сравнивались с использованием (D-E) цитотоксичности CCK8 и (F) пролиферации клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Расположение двух пенопластовых коробок. Одна пенная коробка помещается внутрь другой во время медленного процесса замораживания целых органоидов или сфероидов в MD. *обозначает два поля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 4: Этапы, демонстрирующие, как удалить смоляной блок из MD после полимеризации смолы. (A) Смоляной блок, окружающий сфероиды или органоиды, получают внутри ниши MD и затем полимеризуют. (Б-Д) Затем, с помощью соответствующего тонкого стержня, смоляной блок выталкивается, чтобы удалить его из ниши. (E) Затем удаляется смоляной блок с пластиком внизу. (Ф-Г) Наконец, пара пинцетов используется для их разделения, если блок все еще прикреплен к пластику. (H) Блок готов к тонкому сечению. Цельномонтные органоиды или сфероиды в смоляном блоке (*) готовы к секционированию для просвечивающей электронной микроскопии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 5: Органоиды дыхательных путей, которые были иммунофлуоресцентно помечены, а затем визуализированы, когда они все еще находились в MD. (А-С) Верхняя панель показывает круглые органоиды дыхательных путей с центральным просветом. Зеленый представляет клетки-предшественники дыхательных путей, экспрессирующие цитокератин 5 в самом внешнем кольце органоида, а синий представляет ядра. Шкала = 50 мкм. (D-F) Нижняя панель показывает трехмерное изображение двух параллельных органоидов в фильтрах (D) DAPI и (E) Alexa 488, а также (F) объединенное изображение. Шкала = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 6: Сравнение плотности маркировки на мембранах живых клеток. График сравнивает сфероиды до и после замораживания, используя традиционный и принятый в настоящее время рабочий процесс. Анализ проводился с использованием программного обеспечения для анализа изображений Image J. Сокращения: IntDen = Интегральная плотность (интенсивность флуоресценции в выбранных сфероидах). CTCF = скорректированная общая флуоресценция клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Ранан Гулхан Актас владеет патентными заявками MD, S-IHC, S-IF и FS. Ольгу Энис Ток принимал участие в разработке этих продуктов. Ольгу Энис Ток и Гамзе Демирель являются членами команды R&D компании под названием Cellorama. Юсуф Мустафа Саатчи, Зейнеп Акбулут и Озгеджан Каялар не имеют никаких конфликтов интересов.