Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Резекция подколенных сосудистых лимфатических узлов в задней конечности кролика для индукции вторичной лимфедемы

1.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64576

⸱

30 ноября 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microsurgery, Jesús Usón Minimally Invasive Surgery Centre, 2Department of Plastic Surgery, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau

В этой статье

Краткое содержание

Здесь описана хирургическая индукция стабильно приобретенной лимфедемы в задней конечности кролика. Это экспериментальное животное может быть использовано для дальнейшего изучения эффекта лечения лимфедемы микрохирургическими методами.

Аннотация

Лимфедема является распространенным заболеванием, часто связанным с раком и его лечением, которое приводит к повреждению лимфатической системы, и современные методы лечения в основном являются паллиативными, а не лечебными. Его высокая частота среди онкологических больных указывает на необходимость изучения как нормальной лимфатической функции, так и патологической дисфункции. Для воспроизведения хронической лимфедемы необходимо выбрать подходящее экспериментальное животное. Попытки создания животных моделей ограничены регенеративной способностью лимфатической системы. Среди потенциальных кандидатов задняя конечность кролика проста в обращении и экстраполируется на клинический сценарий человека, что делает ее выгодной. Кроме того, размеры этого вида позволяют лучше подбирать лимфатические сосуды для васкуляризированной резекции лимфатических узлов.

В данном исследовании мы представляем процедуру резекции сосудистых лимфатических узлов в задней конечности кролика для индуцирования вторичной лимфедемы. Животные, находящиеся под наркозом, подвергались окружным измерениям, инфильтрации патентованным синим V и индоцианиновой зеленой лимфографии (ICG-L) с использованием флуоресценции ближнего инфракрасного диапазона в реальном времени, метода, который позволяет идентифицировать отдельные подколенные узлы и лимфатические каналы. Доступ к выявленным структурам достигается путем иссечения подколенного узла и лигирования медиальной и латеральной афферентных лимфатических лимфатических лимфок. Особое внимание следует уделять тому, чтобы любой лимфатический сосуд, который присоединяется к бедренной лимфатической системе в бедре, не входя в подколенный узел, мог быть идентифицирован и перевязан.

Послеоперационная оценка проводилась через 3, 6 и 12 месяцев после индукции с использованием окружных измерений задней конечности и ICG-L. Как было продемонстрировано во время наблюдения, у животных развился кожный обратный поток, который сохранялся до12-го месяца, что делает это экспериментальное животное полезным для новых долгосрочных оценок в лечении лимфедемы. В заключение следует отметить, что описанный здесь подход является осуществимым и воспроизводимым. Кроме того, в течение представленного временного окна он может быть репрезентативным для лимфедемы человека, тем самым обеспечивая полезный исследовательский инструмент.

Введение

Лимфедема является хроническим заболеванием, которое заслуживает особого внимания в связи с его распространенностью во всем мире, отсутствием излечивающего и стандартизированного лечения и серьезным влиянием на качество жизни пациентов 1,2.

В развитых странах лимфедема является в основном приобретенной и вторичной по отношению к раку молочной железы из-за высокой распространенности этого злокачественного новообразования; Кумулятивная заболеваемость лимфедемой, связанной с раком молочной железы, через 10 лет после операции может достигать 41,1%3. Тем не менее, такие заболевания, как меланома, гинекологический рак, опухоли мочеполовой системы, новообразования головы и шеи, также связаны с высокой частотой этого заболевания4. Регионарная резекция лимфатических узлов, как часть необходимого онкологического лечения для повышения выживаемости, приводит к нарушению функционального лимфодренажа. В некоторых случаях это приводит к появлению компенсаторных механизмов, которые предотвращают или задерживают начало лимфедемы5. Однако при назначении химиотерапии и лучевой терапии эти механизмы не могут компенсировать изменение, и в результате возникает лимфедема. Это оказывает негативное влияние на качество жизни пациентов, отражаясь на их функциональном, социальном и психологическом благополучии 6,7.

Потребность в эффективном лечении лимфедемы требует понимания физиопатологии лимфатической системы, а также глубокого проникновения в сложные клеточные механизмы и их реакцию как в нормальной, так и в дисфункциональной лимфатической системе 8,9,10. Такие выводы могут быть получены первоначально на экспериментальных животных моделях, способных воспроизводить хронические заболевания человека.

Было предпринято много попыток воспроизвести лимфедему на экспериментальных животных моделях; Тем не менее, большинству из них препятствовали некоторые ограничения, в том числе невозможность воспроизвести хроническую лимфатическую недостаточность в стабильной животной модели, затраты на исследование и, что самое главное, большая регенеративная способность лимфатической системы, которая позволяет ей восстанавливатькровообращение.

В этом исследовании представлен экспериментальный подход к хирургическому индуцированию стабильной приобретенной лимфедемы с использованием задней конечности кролика. Исходя из обзора литературы, это животное можно считать оптимальным для развития лимфедемы из-за последовательной анатомии его лимфатической системы задних конечностей, которая включает в себя один подколенный узел, который дренирует заднюю конечность и достигает основной бедренной лимфатической системы в ноге14,15.

Специфическая анатомия задней конечности кролика позволяет воспроизводить хирургические процедуры, выполненные у людей для индуцирования вторичной лимфедемы. Таким образом, эта процедура может быть использована для микрохирургического обучения и доклинических исследований для экстраполяции результатов на медицину человека.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры были одобрены этическим комитетом Центра минимально инвазивной хирургии им. Хесуса Усона и руководящими принципами благосостояния регионального правительства, которые основаны на европейском законодательстве.

1. Предоперационная и хирургическая подготовка

  1. Содержать девять самок новозеландских белых кроликов весом 4-4,5 кг и в возрасте 4 месяцев в отдельных клетках, содержащихся при температуре 22-25 °С, со свободным доступом к пище и воде. Убедитесь, что в клетках находится лоток из полисульфонового материала площадью 3 м2 и высотой 40 см, а также грядка с древесной стружкой.
    1. Идентифицируйте клетки с помощью кода проекта и идентификационного номера животного.
    2. Акклиматизируйте животных в течение 1 недели перед операцией, чтобы предотвратить проблемы, вызванные стрессом. Соберите предоперационные лабораторные данные образцов крови, чтобы убедиться, что каждое животное находится в хорошем состоянии здоровья до начала анестезии.
  2. Убедитесь, что все кролики соблюдают 12-часовое голодание перед каждой хирургической процедурой.
    1. После премедикации кроликов предварительно насытить кислородом с помощью лицевой маски (маски Холла) в течение 5 мин со 100% кислородом и потоком свежего газа 3-5 л/мин. Проводите фазу коиндукции с мидазоламом (0,3 мг/кг) и пропофолом (10 мг/кг) внутривенно.
  3. Интубируют кроликов с помощью 3,0-3,5 эндотрахеальных трубок, с пневмотапонированием, подключенных к полузамкнутому кольцевому контуру, соединенному с аппаратом искусственной вентиляции легких с потоком свежих газов со скоростью 1 л/мин в течение начальных 5 мин, а затем устанавливают на 0,5 л/мин.
    1. Проводят поддерживающую анестезию путем ингаляции севофлурана в концентрации 3%-3,5%, установленной на вапорайзере.
  4. Непрерывно вводите раствор лактата Рингера (2-4 мл/кг/ч) через краевую вену уха кроликам, находящимся под наркозом, на протяжении всей хирургической процедуры.
    1. Используйте защитную мазь для глаз для защиты глазной поверхности.
  5. Мониторинг общей анестезии: с помощью ректального термометра отслеживают температуру на уровне 38,7-39,7 °C, осматривают цвет слизистой оболочки, контролируют сатурациюO2на >95% и частоту сердечных сокращений на уровне 180-240 уд/мин с помощью пульсоксиметра кролика.
  6. Установите термоподставку, чтобы животное поддерживало постоянную температуру на протяжении всей процедуры.
  7. Введите кеторолак (1,5 мг/кг) и трамадол (3 мг/кг) внутривенно для интраоперационной анальгезии.
  8. Введение антибиотиков (7,5 мг/(кг∙сут) энрофлоксацина подкожно [подкожно]) до операции и через 5 дней после операции, а также послеоперационная анальгезия (10 мкг/(кг∙сут) бупренорфина в.к.) в течение 5 дней.
  9. Поместите кроликов в положение лежа на спине и побрейте задние конечности и паховые области животного. Поместите животное в положение лежа на спине/спине и подстригите шерсть с задних конечностей и паховой области.
  10. Проведите антисептическую обработку кожи, нанеся на ранее выбритую кожу 0,5% хлоргексидина и 70% этанола. После того, как участок будет продезинфицирован, накройте кролика стерильной тканью, за исключением левой задней конечности.

2. Операция по резекции подколенных сосудистых лимфатических узлов (Рисунок 1)

  1. Инфильтрат 0,2-0,3 мл индоцианина зеленого (ICG) внутрикожно во второе и третье межпальцевые пространства левой задней конечности. Помассируйте, мягко согните и вытяните заднюю конечность на несколько минут, чтобы облегчить всасывание красителя в лимфатические сосуды. Используйте контралатеральную конечность в качестве контрольной.
  2. Используйте флуоресцентную камеру ближнего инфракрасного диапазона в режиме реального времени, чтобы визуализировать и отметить (с помощью хирургического маркера) лимфатические сосуды, пересекающиеся на уровне колена, и подколенный лимфатический узел (PLN) на коже (рис. 2).
  3. Введите патентованный синий V (0,2 мл) в межпальцевую область для последующей идентификации лимфатических сосудов и лимфатических узлов.
  4. После того, как PLN будет идентифицирован с помощью флуоресцентной камеры в ближнем инфракрасном диапазоне в режиме реального времени (рис. 3), сделайте разрез шириной 2 см в центре подколенной ямки, продольный по отношению к длинной оси задней конечности через седалищную вену, которая видна через кожу.
    1. Для получения панорамных изображений лимфатической системы в режиме реального времени с помощью флуоресцентной камеры ближнего инфракрасного диапазона в реальном времени используйте оптическую головку, оснащенную лазером класса 1 в качестве источника возбуждающего света, и чувствительную камеру ближнего инфракрасного диапазона, от лодыжки до колена задней конечности животного.
    2. Визуализируйте лимфатические сосуды над мышечной фасцией путем резекции подкожного жира5. Лимфатические сосуды выглядят синими из-за патентованного окрашивания в синий цвет V на шаге 2.3.
    3. Используйте микрохирургические щипцы для растяжения разреза и обнажения PLN, включая сосудистые и афферентные лимфатические ножки. Обеспечьте четкую видимость всех лимфатических и сосудистых структур (Рисунок 4).
    4. Определите PLN диаметром 0,8 мм под седалищной веной и между бицепсом бедра и медиальными мышцами подколенного сухожилия.
  5. Определите два основных лимфатических сосуда на медиальной поверхности ПЛН. Эти сосуды расположены параллельно дистальному отделу подкожной вены и по мере приближения к PLN разделяются на сеть микрососудов (рис. 5).
  6. Рассекайте ножку лимфатического узла, избегая при этом повреждения окружающих тканей и сосудов (рисунок 6).
  7. Перевязать медиальную артерию (ветвь подколенной артерии) и латеральную подкожную вену дистально и проксимально с помощью нейлоновых нерассасывающихся швов 10/0.
  8. Определите и прижгите две группы афферентных лимфатических сосудов, которые непосредственно присоединяются к бедренной лимфатической системе в бедре, но не входят в PLN (рис. 7).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первая группа соответствует медиальным афферентным лимфатическим сосудам, которые дренируют лимфу из верхней части ноги и голени. Вторую группу составляют лимфатические сосуды в области мускулатуры нижних конечностей. Эти сосуды проходят вдоль икроножной мышцы, вместе с подкожной веной.
  9. Подтвердите полное нарушение работы лимфатической системы путем повторения флуоресцентной визуализации в ближнем инфракрасном диапазоне в режиме реального времени.
  10. Полностью удалите окружающую жировую ткань, чтобы избежать возможного лимфангиогенеза.
  11. Сшивайте разрез кожи рассасывающимися плетеными нитями 4-0 полигликолевой кислоты (ПГА) (с треугольной иглой 16 мм 3/8) с использованием непрерывного внутрикожного рисунка, чтобы избежать послеоперационного аутоукаличного вмешательства.
  12. После операции кроликов размещают по отдельности в клетках; держать их под наблюдением и при комнатной температуре от 16 до 22 °C.

3. Послеоперационная оценка

  1. Проведите послеоперационное обследование через 3, 6 и 12 месяцев после индукции.
  2. Обезболите кроликов, следуя выполненным ранее шагам (шаги 1.2-1.7).
  3. Измерьте периметры задних конечностей кроликов, находящихся под наркозом, с помощью рулетки. Снимайте мерки через каждые 2 см, причем первая точка находится на щиколотке, а последняя — на колене. Рассчитайте общий объем по формуле усеченного конуса.
  4. Используйте индоцианиновую зеленую лимфографию (ICG-L) для оценки лимфатической функции.
    1. Инфильтрируйте 0,2-0,3 мл ICG внутрикожно во второе и третье межпальцевые пространства и мягко массируйте в течение 1 минуты, чтобы облегчить всасывание ICG в лимфатические сосуды.
  5. Соберите изображения через 15 минут с помощью флуоресцентной системы ближнего инфракрасного диапазона для оценки обратного потока в коже.
  6. После завершения последующего наблюдения усыпьте кролика, следуя тому же протоколу анестезии, который использовался при вмешательстве. Как только желаемый уровень анестезии будет достигнут, введите внутривенно хлорид калия в ушную вену в среднем 2 мг-экв/кг.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом исследовании девять кроликов подверглись индукции лимфедемы, однако трое кроликов умерли в течение непосредственного послеоперационного периода и не могли быть оценены. Данные исследования были получены через 3, 6 и 12 месяцев после операции тремя независимыми исследователями. Измерения окружности задних конечностей и ICG-L проводились под общей анестезией для оценки функции лимфатической системы и кожного обратного тока.

Данные, полученные с помощью ICG-L через 3 месяца после операции,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Резекция PLN у экспериментального животного является относительно новой процедурой, которая может вызвать вторичную лимфедему в конечностях для оценки и изучения. После резекции лимфатических узлов наступает период изменения функциональности лимфатической системы, накопления лимфы и гистологических изменений лимфатических сосудов, которые выглядят расширенными. Когда накопление лимфы достигает адекватного уровня, характерный дермальный обратный ток лимфедемы, аналогичный тому, который на...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Этот исследовательский проект был выполнен в Центре минимально инвазивной хирургии им. Хесуса Усона (CCMIJU), который является частью ICTS Nanbiosis. Исследование проводилось с использованием следующих установок Nanbiosis: U21, экспериментальная операционная, и U22, содержание животных. Эта работа была поддержана больницей Санта-Креу-и-Сант-Пау. Эта работа была частично профинансирована Junta de Extremadura, Европейским фондом регионального развития (грант No GR21201). Спонсор играл роль в планировании исследования, сборе данных, анализе, принятии решения о публикации и подготовке рукописи. Особая благодарность выражается Марии Перес за подготовку фигур и отделению микрохирургии JUMISC за постоянную поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Bleu Patente V sodique (Guerbet)Guerbet. Villepinte, Франция2,5 г/100 мл
бупренорфина (Бупак)Richter Pharma. Вельс, Австрия0820645AA3 мг/10 мл
флуооптика с флуопом. Гренобль, ФранцияФлуоресцентная визуализация
Программное обеспечение IBM SPSSверсия 21.0
Индоцианин зеленый (Verdye, Diagnostic Green GmbH)Diagnostic Green GmbH. Ашхайм-Дорнах, Германия5 мг/мл
Кеторолако  (Нормон) Normon, S.A. Madrid, SpainT01H30 мг/мл
Microsoft Excelверсия Microsoft 16.66.1
Мидазолам (Нормон) Normon, S.A. Madrid, SpainT35M15 мг/3 мл
микроскоп Pentero 800, флуоресцентный модульCarl Zeiss Meditec AG. Гешвитцер Штрассе 51-52. Йена, Германия302581-9245-000
Хлорид калия (Braun)B.Braun. Барселона, Испания1926201020 ммоль/10 мл
пропофола (Propomitor, Orion Pharma) Орион Фарма. Spoo, Finland20R039B200 мг/20 мл
RÜ Эндотрахеальные трубки SCHTeleflex Medical IDA Деловой и технологический парк. Атион, Ирландия.12CE12 Размер Туба 4.0 I.D. мм
Севофлурано (SevoFlo, Zoetis)Zoetis Бельгия. Luvain-la-Neuve, Бельгия60935591000 мг/г (250 мл)
Трамадол (Нормон)Нормон, С.А. Мадрид, ИспанияT08U100 мг/2 мл

Ссылки

  1. Taylor, G. W. Lymphoedema. Postgraduate Medical Journal. 35 (399), 2-7 (1959).
  2. Weissleder, H., Schuchhardt, C. Lymphedema Diagnosis and Therapy. 2nd ed. , Kagerer Kommunikation. (1997).
  3. Pereira, A. C. P. R., Koifman, R. J., Bergmann, A. Incidence and risk factors of lymphedema after breast cancer treatment: 10 years of follow-up. The Breast. 36, 67-73 (2017).
  4. Coriddi, M., et al. Systematic review of patient-reported outcomes following surgical treatment of lymphedema. Cancers. 12 (3), 565(2020).
  5. Fernández Peñuela, R., Casaní Arazo, L., Masiá Ayala, J. Outcomes in vascularized lymph node transplantation in rabbits: A reliable model for improving the surgical approach to lymphedema. Lymphatic Research and Biology. 17 (4), 413-417 (2019).
  6. Armer, J. M., et al. ONS GuidelinesTM for cancer treatment–related lymphedema. Oncology Nursing Forum. 47 (5), 518-538 (2020).
  7. Villanueva, T. Avoiding lymphedema. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 121(2014).
  8. Clavin, N. W., et al. TGF-β 1 is a negative regulator of lymphatic regeneration during wound repair. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 295 (5), 2113-2127 (2008).
  9. Schulte-Merker, S., Sabine, A., Petrova, T. V. Lymphatic vascular morphogenesis in development, physiology, and disease. The Journal of Cell Biology. 193 (4), 607-618 (2011).
  10. Padberg, Y., Schulte-Merker, S., Van Impel, A. The lymphatic vasculature revisited—new developments in the zebrafish. Methods in Cell Biology. 138, 221-238 (2017).
  11. Cornelissen, A. J. M., et al. Outcomes of vascularized versus non-vascularized lymph node transplant in animal models for lymphedema. Review of the literature. Journal of Surgical Oncology. 115 (1), 32-36 (2017).
  12. Hadamitzky, C., Pabst, R. Acquired lymphedema: An urgent need for adequate animal models. Cancer Research. 68 (2), 343-345 (2008).
  13. Shin, W. S., Szuba, A., Rockson, S. G. Animal models for the study of lymphatic insufficiency. Lymphatic Research and Biology. 1 (2), 159-169 (2003).
  14. Soto-Miranda, M. A., Suami, H., Chang, D. W. Mapping superficial lymphatic territories in the rabbit. Anatomical Record. 296 (6), 965-970 (2013).
  15. Bach, C., Lewis, G. P. Lymph flow and lymph protein concentration in the skin and muscle of the rabbit hind limb. The Journal of Physiology. 235 (2), 477-492 (1973).
  16. Mayer, J. Use of behavior analysis to recognize pain in small mammals. Lab Animal. 36 (6), 43-48 (2007).
  17. Jones-Bolin, S. Guidelines for the care and use of laboratory animals in biomedical research. Current Protocols in Pharmacology. 59 (1), 4(2012).
  18. Hawkins, P. Recognizing and assessing pain, suffering and distress in laboratory animals: a survey of current practice in the UK with recommendations. Laboratory Animals. 36 (4), 378-395 (2002).
  19. Kohn, D. F., et al. Public statement: Guidelines for the assessment and management of pain in rodents and rabbits. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 46 (2), 97-108 (2007).
  20. Wolfe, J. H., Rutt, D., Kinmonth, J. B. Lymphatic obstruction and lymph node changes–a study of the rabbit popliteal node. Lymphology. 16 (1), 19-26 (1983).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Модель задней конечности кроликаподколенный лимфатический узеллигирование лимфатическогоv сосудалимфография с использованием индоцианина зеленогоближняя инфракрасная флуоресценцияPatent Blue Vмодель хронического лимфедемыдермальный обратный ток

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.