Method Article

Размножение вирусов и клеточная колориметрическая количественная оценка

DOI:

10.3791/64578

⸱

April 7th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящем протоколе описывается распространение вируса Зика (ZIKV) в клетках почек африканской зеленой мартышки Vero и количественная оценка ZIKV с использованием клеточных колориметрических методов иммунодетекции в 24-луночном и 96-луночном (высокопроизводительном) форматах.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вирус Зика (ZIKV) — это вирус, переносимый комарами, принадлежащий к роду Flavivirus. Инфекция ZIKV была связана с врожденными аномалиями головного мозга и, возможно, синдромом Гийена-Барре у взрослых. Исследования ZIKV для понимания механизмов заболевания важны для облегчения разработки вакцин и методов лечения. Метод количественной оценки вирусов является решающим и основополагающим в области вирусологии. Фокусообразующий анализ (FFA) - это количественный анализ вируса, который обнаруживает вирусный антиген с антителами и идентифицирует инфекционные очаги клеток с помощью метода иммуноокрашивания пероксидазой. В настоящем исследовании описывается протокол распространения вируса и количественного определения с использованием 24-луночного и 96-луночного форматов (с высокой пропускной способностью). По сравнению с другими подобными исследованиями, в этом протоколе дополнительно описана оптимизация размеров очагов, что может служить руководством для расширения использования этого анализа для других вирусов. Во-первых, размножение ZIKV производится в клетках Vero в течение 3 дней. Культуру надосадочной жидкости, содержащую ZIKV, собирают и количественно определяют с помощью FFA. Вкратце, культуру вируса инокулируют в клетки Vero и инкубируют в течение 2-3 дней. Образование очагов определяется после оптимизированных процессов окрашивания, включая фиксацию клеток, пермеабилизацию, блокировку, связывание антител и инкубацию с субстратом пероксидазы. Окрашенные вирусные очаги визуализируют с помощью стереомикроскопа (ручной подсчет в 24-луночном формате) или программного анализатора (автоматизированный подсчет в 96-луночном формате). FFA обеспечивает воспроизводимые, относительно быстрые результаты (3-4 дня) и подходит для использования для различных вирусов, включая вирусы, не образующие бляшек. Впоследствии этот протокол полезен для изучения инфекции ZIKV и может быть использован для обнаружения других клинически значимых вирусов.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инфекция, вызванная вирусом Зика (ZIKV), является новым вирусным заболеванием, переносимым комарами. Первая изоляция ZIKV была в Уганде в 1947 г. 1,2; С 1947 по 2007 год она оставалась без внимания, поскольку клинические симптомы чаще всего протекают бессимптомно и характеризуются самоизлечивающимся лихорадочным заболеванием. В 2007 г. эпидемия вируса Зика началась на островах Яп 3,4, за ней последовали более крупные эпидемии в регионах Тихого океана (Французская Полинезия, остров Пасхи, острова Кука и Новая Каледония) с 2013 по 2014 гг. 5,6,7,8, где впервые было зарегистрировано тяжелое неврологическое осложнение синдром Гийена-Барре (СГБ) у взрослых 9. В течение 2015 и 2016 гг. первая широкомасштабная эпидемия ZIKV охватила Северную и Южную Америку после появления азиатского генотипа ZIKV в Бразилии уже в 2013 г.10. Во время этой вспышки было зарегистрировано от 440 000 до 1,3 миллиона случаев микроцефалии и других неврологических расстройств у новорожденных. В настоящее время не существует специфического лекарства или лечения инфекции ZIKV; Таким образом, существует острая медицинская потребность в вакцинах ZIKV, способных предотвращать инфекции, особенно во время беременности.

Количественная оценка вирусов — это процесс определения количества вирусов, присутствующих в образце. Он играет важную роль в исследованиях, а академические лаборатории охватывают множество областей, таких как медицина и науки о жизни. Этот процесс также важен в коммерческих секторах, таких как производство вирусных вакцин, рекомбинантных белков, вирусных антигенов или противовирусных средств. Для количественного определения вируса можно использовать множество методов или анализов12. Выбор методов или анализов обычно зависит от характеристик вируса, желаемого уровня точности и характера эксперимента или исследования. В целом, методы количественной оценки вирусов можно разделить на две категории: молекулярные анализы, которые обнаруживают присутствие вирусных нуклеиновых кислот (ДНК или РНК), и анализы, которые измеряют инфекционность вируса in vitro12. Количественная полимеразная цепная реакция (кПЦР, для ДНК) или количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (кОТ-ПЦР, для РНК)13 и цифровая капельная ПЦР14 являются примерами распространенных молекулярных методов, используемых для количественного определения вирусной нуклеиновой кислоты в данном образце15. Однако эти высокочувствительные молекулярные методы не позволяют дифференцировать жизнеспособные и нежизнеспособные вирусы15. Таким образом, исследования, требующие информации о биологических особенностях, таких как заразность вируса на клетках, не могут быть завершены с использованием вышеупомянутых молекулярных методов; Необходимы анализы, которые могут измерять и определять наличие жизнеспособных вирусов. Анализы, которые измеряют инфекционность вируса, включают бляшеобразующий анализ (PFA), 50% инфекционную дозу тканевой культуры (TCID50), флуоресцентный фокусный анализ и просвечивающую электронную микроскопию (ПЭМ)12.

PFA, разработанный Ренато Дульбекко в 1952 году, является одним из наиболее часто используемых методов титрования вирусов, в том числе для ZIKV16. Он используется для непосредственного определения вирусных концентраций для инфекционных литических вирионов. Метод основан на способности литического вируса продуцировать цитопатические эффекты (CPE; зоны клеточной гибели или бляшки, область инфекции, окруженная неинфицированными клетками) в монослое инокулированной клетки после вирусной инфекции. Однако у анализа есть несколько недостатков, которые влияют на его полезность. Анализ занимает много времени (занимает примерно 7-10 дней, в зависимости от вирусов), зависит от CPE и подвержен ошибкам. В настоящем исследовании мы сообщаем об иммуноколориметрическом методе, фокусообразующем анализе (FFA), для обнаружения и количественного определения ZIKV в форматах 24-луночных и 96-луночных планшетов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Распространение вирусов

  1. Подготовка клеток
    1. Выращивают клетки Vero в колбе для клеточной культуры 75см2 , содержащей 12 мл модифицированной среды Eagle's Medium (DMEM) Dulbecco с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 2 мМ L-глютамина (см. таблицу материалов). Инкубируют клетки в инкубаторе клеточных культур при температуре 37 °C с 5% CO2.
    2. Наблюдение за клетками под микроскопом; как только ячейки достигают 70%-90% слияния, они готовы к использованию (рис. 1A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки Vero удваиваются примерно каждые 24 часа17 минут. Для разведения 1:10 требуется от 3 до 4 дней, чтобы достичь 80%-90% слияния в колбе диаметром 75см2 . Следите за клетками ежедневно или через день.
  2. Инфицирование клеточного монослоя
    1. Извлеките питательную среду из колбы с клеточной культурой с помощью серологической пипетки объемом 10 мл. Промойте колбу 3 мл фосфатно-солевого буфера (dPBS) Dulbecco 2 раза с помощью серологической пипетки объемом 5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стакан с 10% гипохлоритом натрия должен быть подготовлен для дезинфекции любых выброшенных инфекционных жидких отходов из колб / тарелок.
    2. Добавьте 2 мл безсывороточного DMEM (DMEM с добавлением 2 мМ L-глютамина без FBS) и 20 мкл инокулята ZIKV в колбу для клеточной культуры. Инкубируйте колбу при легком покачивании в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы обеспечить адсорбцию вируса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Титрование исходного материала ZIKV будет полезно для определения объема добавки инокулята ZIKV (шаг 2).
      ВНИМАНИЕ: ZIKV классифицируется как патоген 2-го уровня биобезопасности (BSL-2). Все процедуры с материалами, содержащими ZIKV, должны проводиться в сертифицированном кабинете биобезопасности и следовать всем лабораторным стандартным операционным процедурам (СОП) с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты.
  3. Добавление оверлейного носителя
    1. После 1 ч инкубации извлеките и выбросьте разбавленный вирусный посевной материал с помощью серологической пипетки объемом 5 мл. Промойте колбу с клеточной культурой 3 мл dPBS 2x.
    2. Добавьте 12 мл поддерживающей среды (DMEM с добавлением 2% FBS, 2 мМ L-глютамина и 100 Ед/мл пенициллина-стрептомицина) в колбу с клеточной культурой для поддержания инфицированных клеток.
    3. Инкубируют инфицированные клетки Vero в течение 3 дней в инкубаторе клеточных культур при температуре 37 °C с 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ежедневно отслеживайте CPE инфицированных клеток Vero под микроскопом.
  4. Забор надосадочной жидкости клеточных культур, содержащей ZIKV
    1. На 3-й день после заражения может наблюдаться округление и отслоение клеток (CPE) (рис. 1B-D). Соберите надосадочную жидкость клеточной культуры, содержащую ZIKV, в центрифужную пробирку объемом 50 мл с помощью серологической пипетки объемом 10 мл.
    2. Используйте шприцевой фильтр из полиэфирсульфона 0,22 мкм (см. Таблицу материалов) для фильтрации надосадочной жидкости клеточной культуры. Аликвоту 500 мкл отфильтрованной надосадочной жидкости клеточной культуры в пробирки с завинчивающейся крышкой по 2,0 мл и хранят при -80 °C до дальнейшего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Собранный ZIKV можно хранить при температуре -80 °C для длительного хранения.
      ВНИМАНИЕ: При использовании иглы шприца необходимо принять дополнительные меры предосторожности, так как игла может проколоть кожу. Необходимо разработать лабораторные СОП.

2. Количественная оценка вируса

  1. Подготовка клеток
    1. Высевают клетки Vero в специальные планшеты (24-луночный планшет: 0,5 мл/лунка, 7,5 x 104 клеток/лунка; 96-луночный планшет: 0,1 мл/лунка, 1,5 x 104 клеток/лунка) и инкубируют планшет в течение ночи в инкубаторе клеточных культур при 37 °C с 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Существует пять различных временных точек для тестирования (24-луночный планшет: 48 ч, 60 ч, 72 ч, 84 ч и 96 ч после заражения; 96-луночный планшет: 24 ч, 36 ч, 48 ч, 60 ч и 72 ч после заражения); Поэтому подготовьте по одной тарелке для каждого момента времени.
    2. После 24-часовой инкубации и после того, как клетки достигнут 70%-90% слияния (рис. 1E), планшет готов к заражению. Приступают к приготовлению разбавленного запаса вируса (шаг 2.2) до заражения клеточного монослоя.
  2. Разбавление вируса
    1. Для 24- и 96-луночных планшетов подготовьте шесть стерильных пробирок микроцентрифуг по 1,5 мл для каждой чашки для проведения десятикратного разведения (от 10-1 до 10-5), включая отрицательный контроль. Для установки эксперимента с 24-луночным планшетом добавьте 450 мкл безсывороточного DMEM во все шесть пробирок с микроцентрифугой. Для установки эксперимента с 96-луночным планшетом добавьте 135 мкл безсывороточного DMEM в шесть пробирок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед выполнением десятикратного последовательного разведения четко промаркируйте каждую пробирку, чтобы указать разбавление ее содержимого.
    2. Для выполнения серийного разведения в 24-луночном эксперименте добавьте 50 мкл материала ZIKV, полученного на стадии 1, в пробирку 10-1 , содержащую 450 мкл безсывороточного DMEM. Для установки эксперимента с 96-луночным планшетом добавьте 15 мкл материала ZIKV в пробирку 10-1 , содержащую 135 мкл безсывороточного DMEM.
    3. Вмешайте каждую пробирку, чтобы смешать вирус и среду. Это первое десятикратное разведение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения точного серийного разведения необходимо правильное смешивание вируса и питательной среды в каждой пробирке для разведения.
    4. Для установки эксперимента с 24-луночным планшетом используйте свежий наконечник пипетки, чтобы ресуспендировать пробирку 10-1 и перенести 50 мкл разбавленного ZIKV в пробирку 10-2 в качестве второго десятикратного разведения. Для установки эксперимента с 96-луночным планшетом используйте свежий наконечник пипетки, чтобы ресуспендировать пробирку 10-1 и перенести 15 мкл разбавленного ZIKV в пробирку 10-2 в качестве второго десятикратного разведения.
    5. Повторите шаг 2.2.4 четыре раза до пятой пробирки (исключая отрицательный контроль).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте свежий наконечник пипетки после каждого этапа пипетирования, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
  3. Инфицирование клеточного монослоя
    1. Удалите и выбросьте кондиционированную среду из каждой лунки (24-луночная пластина: 0,5 мл/лунка; 96-луночная пластина: 0,1 мл/лунка).
    2. Промойте каждую лунку dPBS 2x (24-луночная пластина: 300 мкл/лунка; 96-луночная пластина: 60 мкл/лунка).
    3. Работая от самого высокого к самому низкому разведению, добавьте каждый последовательно разбавленный вирусный посевной материал в лунку (24-луночная пластина: 200 мкл/лунка; 96-луночная пластина: 40 мкл/лунка).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Заражение каждого разведения будет производиться в дублированных лунках. Поддерживайте две незараженные лунки в качестве отрицательного контроля. Четко обозначьте пластину и лунки, чтобы избежать путаницы. Меняйте наконечники дозаторов после каждого этапа пипетирования, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение.
    4. Инкубируйте планшет с легким покачиванием в течение 1 часа при комнатной температуре, чтобы обеспечить адсорбцию вируса.
  4. Добавление оверлейной клеточной питательной среды
    1. Через 1 ч инкубации удалить и утилизировать вирусную суспензию от самой низкой концентрации до самой высокой.
    2. Промыть инфицированные клетки dPBS 2x (24-луночная пластина: 300 мкл/лунка; 96-луночная пластина: 60 мкл/лунка).
    3. Наложите на лунку DMEM (с добавлением 2% FBS, 2 мМ L-глютамина и 100 Ед/мл пенициллина-стрептомицина) и 1,5% карбоксиметилцеллюлозы низкой вязкости (CMC; см. таблицу материалов) (24-луночная прокладка: 1 мл/лунка; 96-луночная пластина: 0,2 мл/лунка).
    4. Инкубируют планшет в инкубаторе клеточных культур при температуре 37 °C с 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не тревожите планшет в течение этого инкубационного периода.
    5. Выньте планшет из инкубатора клеточных культур для окрашивания в разные моменты времени (24-луночный планшет: 48 ч, 60 ч, 72 ч, 84 ч и 96 ч после заражения; 96-луночный планшет: 24 ч, 36 ч, 48 ч, 60 ч и 72 ч после заражения).

3. Окрашивание

  1. Фиксация клеток
    1. По истечении определенных часов инкубации (24-луночная пластина: 48 ч, 60 ч, 72 ч, 84 ч и 96 ч после заражения; 96-луночная пластина: 24 ч, 36 ч, 48 ч, 60 ч и 72 ч после заражения) удалите и выбросьте оверлейную среду и промойте клетки 3 раза с помощью 1x PBS. Для 96-луночного планшета извлеките и выбросьте оверлейную среду и промойте ячейки 3 раза 60 мкл/лунку 1 PBS с помощью многоканальной пипетки.
    2. Добавьте 4% параформальдегида для фиксации клеток (24-луночная пластина: 300 мкл/лунка; 96-луночная пластина: 60 мкл/лунка). Инкубируйте пластину при комнатной температуре в течение 20 мин.
      ВНИМАНИЕ: Параформальдегид представляет собой твердый полимеризованный формальдегид. Это легковоспламеняющийся, твердый, белый кристаллический порошок, который выделяет газообразный формальдегид при смешивании с водой или нагревании. Все процедуры, связанные с использованием параформальдегида, должны проводиться в сертифицированных химических вытяжных шкафах или утвержденных отработанных шкафах в соответствии с лабораторными СОП, специфичными для формальдегидсодержащих химических веществ.
    3. Через 20 минут выбросьте параформальдегид и промойте клетки 3 раза 1 PBS. Выполните пермеабилизацию, блокировку и инкубацию антител, выполнив шаги 3.2-3.5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При утилизации 4% параформальдегида следуйте процедуре утилизации отходов, принятой в университете или институте.
  2. Проницаемость клеток
    1. Добавьте 1% октилфеноксиполи(этиленокси)этанола (см. таблицу материалов) для пермеабилизации клеток (24-луночная пластина: 200 мкл/лунка; 96-луночная пластина: 40 мкл/лунка). Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение 15 мин.
    2. Через 15 мин выбросьте октилфеноксиполи(этиленокси)этанол и промойте клетки 3 раза 1x PBS.
  3. Блокировка
    1. Добавьте 3% обезжиренного молока для уменьшения неспецифического связывания в образце (24-луночный планшет: 500 мкл/лунка; 96-луночный планшет: 100 мкл/лунка). Выдерживают тарелку при комнатной температуре в течение 2 ч.
    2. Через 2 часа выбросьте 3%-ное обезжиренное молоко и промойте клетки 3 раза с помощью 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это остановка. После добавления 3% обезжиренного молока планшеты можно хранить при температуре 4 °C до 2 дней до введения первичных антител.
  4. Инкубация первичных антител
    1. Добавьте моноклональное антитело против флавивируса, 4G2 (клон D1-4G2-4-15; первичное антитело, см. таблицу материалов), разбавленное в 1% обезжиренном молоке (соотношение 1:1000) (24-луночный планшет: 200 мкл/лунка; 96-луночный планшет: 40 мкл/лунка). Инкубируйте планшет при температуре 37 °C в течение 1 ч.
    2. Через 1 ч удаляют раствор, содержащий моноклональное антитело, и промывают клетки 3 раза 1x PBS.
  5. Инкубация вторичных антител
    1. Добавьте вторичные антитела IgG к козам против мышей, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) (см. таблицу материалов), разведенные в 1% обезжиренном молоке (соотношение 1:1000) (24-луночный планшет: 200 мкл/лунка; 96-луночный планшет: 40 мкл/лунка). Инкубируют планшеты при температуре 37 °C в течение 1 ч.
    2. Через 1 ч удалить раствор, содержащий вторичное антитело, и промыть клетки 3 раза 1 ПБС.
  6. Инкубация субстрата
    1. Добавьте субстрат пероксидазы 3,3'диаминобензидина (DAB) (см. таблицу материалов) и инкубируйте планшет в течение 30 мин в темноте (24-луночный планшет: 200 мкл/лунка; 96-луночный планшет: 40 мкл/лунка). Через 30 мин остановите реакцию, промыв лунки водой.
    2. Просушите пластины на воздухе в течение ночи и приступайте к перебору очагов после того, как пластины полностью высохнут.

4. Определение титра вируса

  1. Ручной процесс подсчета очагов (24-луночный формат)
    1. Очаги можно визуализировать под стереомикроскопом. Выберите разведение, которое дает 50-200 очагов.
    2. Подсчитайте очаги для каждого повторения выбранного разведения. Рассчитайте среднее количество очагов для каждого из выбранных разведений.
    3. Рассчитайте единицу образования очагов на мл (ФОЕ/мл) для каждого образца по следующей формуле: ФОЕ/мл = среднее количество подсчитанных очагов/(разведение x объем добавленного разбавленного вируса).
  2. Автоматизированный процесс подсчета очагов (96-луночный формат)
    1. Отсканируйте 96-луночный планшет на коммерческом программном анализаторе.
      1. Дважды щелкните программное обеспечение (см. Таблицу материалов), чтобы открыть.
      2. Нажмите на Switch Suites и убедитесь, что пакет переключается на любой из подходящих (дополнительный рисунок 1A). Нажмите кнопку ОК.
      3. Начните сканирование, щелкнув Сканировать > Полное сканирование пластины (Дополнительный рисунок 1B).
      4. Нажмите на Dashboard (Панель мониторинга ), чтобы убедиться в том, что используется 96-луночный формат (дополнительный рисунок 2A).
      5. Выберите режим центрирования как «Автоматическое предварительное выравнивание проверено пользователем» (дополнительный рисунок 2B).
      6. Нажмите « Извлечь », чтобы загрузить пластину.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Откройте крышку тарелки и поместите ее вверх так, чтобы ряд A был вверху (дополнительный рисунок 3A).
      7. Введите название таблички и нажмите кнопку ОК. Нажмите кнопку Загрузить , чтобы загрузить пластину.
      8. Нажмите кнопку Начать , чтобы начать сканирование. После этого откалибруйте положения для A1, A12 и H1 с помощью кнопок «Вверх, вниз, влево, вправо» и нажмите «Подтвердить » (дополнительный рисунок 3B).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение начнет сканирование каждой скважины.
      9. После завершения сканирования появится обзорное изображение. Нажмите « Закрыть».
      10. Выйдите из сканирования, нажав на кнопку Вернуться к коммутатору.
    2. Посчитайте 96-луночный планшет с помощью программного обеспечения.
      1. Щелкните Count > Smart Count.
      2. В программном обеспечении отобразится «Шаг 1 из 5: Выберите пластины для подсчета». Нажмите на Load plate(s). Отметьте галочкой всю папку и нажмите « Выбрать», чтобы импортировать отсканированную пластину (дополнительный рисунок 4A).
      3. В программном обеспечении отобразится «Шаг 2 из 5: Определите параметры подсчета». Нажмите « Настроить параметры», и отобразятся параметры (диффузный процесс; маленький/нормальный/большой/самый большой/самый большой +1; точечное разделение; подсчитанная площадь; фоновый баланс; удаление волокон; стробирование).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Начните с одной скважины и проверьте вперед и назад, чтобы найти наилучшие настройки для всех скважин.
      4. После этого нажмите кнопку «Далее » (дополнительный рисунок 4B).
      5. В программном обеспечении отобразится «Шаг 3 из 5: Выбрать/отменить выбор скважин». После того, как выбор скважины для подсчета будет завершен, нажмите «Далее », чтобы продолжить.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Скважины, выбранные для подсчета, будут отображаться с буквой «C» в правом верхнем углу каждой скважины (дополнительный рисунок 5A).
      6. В программном обеспечении отобразится «Шаг 4 из 5: Настройки вывода». Нажмите на View/Modify Output Settings , чтобы проверить, подходят ли настройки (например, формат изображения). Нажмите « Сохранить и выйти» > «Далее» (дополнительный рисунок 5B).
      7. В программном обеспечении отобразится «Шаг 5 из 5: Запустить автоподсчет». Нажмите кнопку Start AutoCount (Запустить автоподсчет ) (дополнительный рисунок 6A).
      8. После завершения нажмите « Выйти из автоподсчета».
  3. Выполнение контроля качества (QC) в коммерческом программном анализаторе.
    1. На странице коммутатора нажмите « Контроль качества» > «Добавить пластины». Отметьте галочкой всю папку, чтобы импортировать подсчитанную пластину, нажмите « Выбрать» > «Начать контроль качества » (дополнительный рисунок 6B).
    2. Дважды щелкните по каждой лунке, чтобы проверить пятна. Нажмите « Количество », чтобы удалить все пятна. Программное обеспечение начнет подсчет.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что установлен флажок «Пятна: Удалить». О завершении подсчета может свидетельствовать подсчитанное количество очагов, например «30» (дополнительный рисунок 7А).
    3. После окончания подсчета (на это указывает подсчитанное количество очагов, например, «30»), нажмите «Да», чтобы удалить пятна (дополнительный рисунок 7B). Трижды щелкните левой кнопкой мыши по удаляемому месту. Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы закончить, затем выберите «Да».
    4. Нажмите на Finish Plate и перейдите к обзору проекта после завершения контроля качества.
  4. Выполните визуализацию с помощью программного анализатора.
    1. Проверьте отсканированное, подсчитанное и контрольное изображение пластины (рисунок 2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ZIKV может быть количественно определен с помощью FFA, как показано схематически на рисунке 3. Для 24-луночного планшета инфицированные клетки Vero фиксировали через 48 ч, 60 ч, 72 ч, 84 ч и 96 ч после заражения. Результаты показали, что клетки оставались неповрежденными (отслоения клеток не наблюдалось) через 96 ч (4 дня) после заражения (рис. 4 и дополнительный рисунок 8A-E). Появление вирусных очагов впервые наблюдалось через 48 ч (2 дня) пос...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Существует несколько тестов для определения титра вируса; PFA имеет аналогичный протокол количественного определения вируса, что и FFA, в котором вирусный инокулят разбавляется, чтобы можно было различить отдельные бляшки или очаги. После окрашивания каждый налет или очаг указывает на наличие одной инфекционной частицы в посевном материале19. PFA окрашивают в кристально-фиолетовый цвет, чтобы визуализировать образование бляшек, вызванное лизисом или гибелью клеток. Следовательно, PFA занимает боль...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование получило поддержку от Министерства высшего образования Малайзии в рамках Схемы долгосрочных исследовательских грантов (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) и финансирование программы Центра передового опыта высших учебных заведений (HICoE) (MO002-2019). Рисунок 3 в этом исследовании, показывающий рабочий процесс окрашивания для анализа с образованием очагов, адаптирован из «Иммуногистохимии DAB» BioRender.com (2022). Источник — https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,22 & микро; m Полиэфирсульфоновый шприцевой фильтрSartoriusS6534-FMOSK
1,5 мл микроцентрифужная пробиркаNest615601
10 мл стерильная серологическая пипеткаLabserv14955156
1x Dulbecco' s фосфатно-солевой буфер (dPBS)Gibco14190-136
2,0 мл Пробирка с завинчивающейся крышкой AxygenSCT-200-SS-C-S
24-луночный планшетCorning3526
25 мл Стерильные серологические пипеткиLabserv14955157
3,3'Диаминобензидин (DAB) пероксидазный субстратThermo Scientific34065
37 ° C инкубатор с 5% CO2SanyoMCO-18AIC
5 мл стерильной серологической пипеткойLabserv14955155
центрифужной пробиркой 50 мл FalconLAB352070
75 см<суп>2 колба для культуры тканей Corning430725U
96-луночный планшетFalcon353072
Антифлавивирусное моноклональное антитело, 4G2 (клон D1-4G2-4-15)MilliporeSigmaMAB10216
автоклавированный 20-кратный фосфатный буферный физиологический раствор (PBS)N/AN/A22,8 г 8 мМ Na2HPO4, 4,0 г 1,5 мМ KH2PO4, 160 г 0,14 М NaCl, 4,0 г 2,7 мМ KCl, 1 л MilliQ H2O
Шкаф биологической безопасности, класс IIHoltenHB2448
CTL S6 Универсальный анализатор ELISpot/FluoroSpotImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL)CTL-S6UNV12Коммерческий программный анализатор
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco12800-017
Фетальный крупный рогатый скот сыворотка (FBS)BovogenSFBS
Goat против мышей вторичное антитело IgG конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP)MilliporeSigma12-349
ГемацитометрLaboroptik LTDNeubauer улучшенный
IGEPAL CA-630 моющее средствоSigma-AldrichI8896Октилфенокси поли(этиленокси)этанолIGEPAL 
Инвертированный микроскопZEISSTELAVAL 31
Лабораторная качалкаFINEPCRCR300
L-глутаминGibco25030-081
Карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ) с низкой вязкостью)Sigma-AldrichC5678
Многоканальная микропипетка (10 - 100 &; L)Eppendorf3125000036
(30–300 &; L)Eppendorf3125000052
ПараформальдегидSigma-AldrichP6148
Пенициллин-стрептомицинGibco15140-122
Одноканальные пипетки (10 - 100 &; L)Eppendorf3123000047
Одноканальные дозаторы (100 - 1000 &; L)Одноканальные дозаторы Eppendorf3123000063
(20–200 &; L)Eppendorf3123000055
обезжиренное молокоSunlac с низким содержанием жираН/АПриготовьте 3% обезжиренное молоко в 1x PBS для блокировки ступени окрашивания
Гипохлорит натрияCloroxN/AДля дезинфекции любых выброшенных инфекционных жидких отходов из колб/тарелок
СтереомикроскопNikonSMZ1000
Шприц одноразовый, замок Люэра, 10 мл с иглой 21 гTerumo
Клетки почек африканской зеленой мартышки Vero -ECACC 88020401Получено от сотрудника. Тем не менее, элементы Vero, полученные от других поставщиков, должны быть пригодны для использования с некоторой оптимизацией.
Многоканальный микродозатор SS10L21G

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
  2. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).
  3. Duffy, M. R., et al. Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).
  4. Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).
  5. Cao-Lormeau, V. -M., et al. Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013. Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).
  6. Dupont-Rouzeyrol, M., et al. Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014. Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).
  7. Roth, A., et al. Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014. Euro Surveillance. 19 (41), 20929(2014).
  8. Tognarelli, J., et al. A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014. Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).
  9. Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveillance. 19 (9), 20720(2014).
  10. Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
  11. Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barré syndrome - 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control. , Stockholm. Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association (2015).
  12. Payne, S. Methods to study viruses. Viruses. , 37-52 (2017).
  13. Bustin, S. A., Mueller, R. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).
  14. Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).
  15. Bae, H. -G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
  16. Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).
  17. Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites. Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).
  18. Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage. Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).
  19. Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).
  20. Bolívar-Marin, S., Bosch, I., Narváez, C. F. Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease. Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183(2022).
  21. Dangsagul, W., et al. Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods. PLoS One. 16 (7), e0255314(2021).
  22. Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
  23. Lazear, H. M., et al. A mouse model of Zika virus pathogenesis. Cell Host & Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
  24. Miner, J. J., et al. Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise. Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).
  25. Kang, W., Shin, E. -C. Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions. PLoS One. 7 (8), e43960(2012).
  26. Brien, J. D., et al. Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse. Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632(2019).
  27. Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay. Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).
  28. Moser, L. A., et al. Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880(2018).
  29. Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses. Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).
  30. Leiva, S., et al. Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections. Virus Research. 304, 198544(2021).
  31. Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs. ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Zika VirusVirus QuantificationFocus Forming AssayVero CellsColorimetric QuantificationPeroxidase ImmunostainingSerial DilutionCell FixationAntibody DetectionHigh Throughput Assay

Related Articles