Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Внутрисердечная инъекция клеток рака предстательной железы человека для создания мышиной модели ксенотрансплантата с метастазами в кости

6.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64589

⸱

4 ноября 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education, 3Institute of Chinese Traditional Surgery, Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол внутрисердечной инъекции клеток рака предстательной железы человека для создания мышиной модели с поражениями метастазов в кости.

Аннотация

Как наиболее распространенное мужское злокачественное новообразование, рак предстательной железы (РПЖ) занимает второе место по смертности, в первую очередь из-за частоты метастазирования в кости 65-75%. Поэтому важно понимать процесс и связанные с ним механизмы метастазирования рака предстательной железы в кости для разработки новых терапевтических средств. Для этого животная модель метастазирования в кости является важным инструментом. Здесь мы сообщаем о подробных процедурах создания модели мышей с метастазами в кости с помощью внутрисердечной инъекции клеток рака предстательной железы. Система биолюминесцентной визуализации может определить, были ли клетки рака предстательной железы точно введены в сердце, и контролировать метастазирование раковых клеток, поскольку она имеет большие преимущества в мониторинге развития метастатического поражения. Эта модель воспроизводит естественное развитие диссеминированных раковых клеток с образованием микрометастазов в кости и имитирует патологический процесс метастазирования рака предстательной железы в кости. Он предоставляет эффективный инструмент для дальнейшего изучения молекулярных механизмов и терапевтических эффектов этого заболевания in vivo .

Введение

Рак предстательной железы является наиболее частым онкологическим заболеванием у мужчин в 112 странах и занимает второе место по смертности в странах с более высоким индексом человеческого развития 1,2. Большинство смертей у пациентов с раком предстательной железы вызваны метастазированием, и примерно в 65-75% случаев развиваются метастазы в кости 3,4. Поэтому профилактика и лечение метастазов рака предстательной железы в кости крайне необходимы для улучшения клинического исхода пациентов с раком предстательной железы. Животная модель метастазирования в кости является незаменимым инструментом для изучения многоступенчатого процесса и молекулярных механизмов, участвующих в каждой стадии метастазирования в кости рака предстательной железы, что позволяет определить терапевтические цели и разработать новые терапевтические средства5.

Наиболее распространенные методы создания экспериментальных животных моделей метастазов рака предстательной железы в кости включают ортотопические, внутридиафизионные (например, внутрибольшеберцовые) и внутрисердечные инъекции клеток рака предстательной железы. Модель метастазирования в кости с ортотопической инъекцией генерируется путем прямой инъекции клеток рака предстательной железы в предстательную железу мыши 6,7. Эта экспериментальная модель на животных имеет очень похожие клинические характеристики на метастазы в кости рака предстательной железы. Однако метастазирование в основном происходит в подмышечных лимфатических узлах и легких, а не в кости 8,9. Модель внутрибольшеберцовой инъекции при раке предстательной железы непосредственно вводит клетки рака предстательной железы в большеберцовую кость с высокой скоростью образования опухоли в кости (большеберцовой кости)10,11; Однако кора костей и полость костного мозга легко повреждаются. Кроме того, метод инъекции большеберцовой кости не может стимулировать патологический процесс метастазирования рака предстательной железы в кости, при котором раковые клетки колонизируют кость через кровообращение. Для исследования кровообращения, сосудистой экстравазации и отдаленных метастазов с более высокой скоростью метастазирования раковых клеток в кости была разработана техника внутрисердечной инъекции путем прямого введения клеток рака предстательной железы в левый желудочек мыши 8,12,13. Это делает его ценной моделью на животных для исследования метастазовв кости 8. Метод внутрисердечной инъекции показывает частоту метастазирования в кости около 75%9,14, что намного выше, чем метод ортотопической инъекции. Таким образом, внутрисердечная инъекция является идеальным методом создания животной модели с метастазами рака предстательной железы в кости.

Эта работа направлена на описание процесса создания мышиной модели метастазов рака предстательной железы в кости, позволяя читателям визуализировать создание модели. Текущая работа содержит подробные процессы, меры предосторожности и иллюстративные изображения для создания модели ксенотрансплантата метастазов в кости с помощью внутрисердечной инъекции клеток рака предстательной железы человека у мышей с атимией. Этот метод является эффективным инструментом для дальнейшего изучения молекулярных механизмов и терапевтических эффектов метастазов рака предстательной железы в кости in vivo .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Шести-восьминедельные самцы атимических мышей BALB/c (n = 10) были размещены в индивидуально вентилируемых клетках для мышей (5 мышей/клетка) в помещении для животных без специфических патогенов (SPF) в условиях 12-часового цикла свет/темнота, со свободным доступом к корму SPF и стерильной воде. Мышей адаптивно кормили в течение недели перед экспериментами. Все эксперименты на животных были одобрены комитетом по благополучию животных Шанхайского университета традиционной китайской медицины.

1. Подготовка клеток

  1. В день инъекции клеток рака предстательной железы дважды вымойте 80%-90% сливающиеся клетки PC-3, меченные люциферазой (PC-3-люциферазой), культивируемые в 10-сантиметровой чашке для культивирования клеток с предварительно холодным стерильным PBS (pH 7,4). Трипсинизировать в течение 3 мин с 1,5 мл 0,25% трипсина и собрать клетки в центрифужную пробирку объемом 15 мл после гашения трипсина 6 мл среды F-12, содержащей 10% сыворотки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточная линия PC-3-люциферазы получена из клеточной линии PC-3 после трансфицирования вектором pLV-люциферазы15.
  2. Используйте автоматический счетчик ячеек и рассчитайте концентрацию клеток, перенеся 20 мкл клеточной суспензии на планшет для подсчета клеток (см. Таблицу материалов).
  3. Центрифугируйте клетки при 800 x g при комнатной температуре (RT) в течение 5 мин.
  4. С помощью пипетки откажитесь от надосадочной жидкости и ресуспендируйте клеточную гранулу в среде F-12 (см. Таблицу материалов) до конечной плотности клеток 1 x 10,7 клеток/мл.
  5. Держите клетки на льду все время до инъекции.
  6. Принесите клетки в операционную и завершите инъекцию клеток в течение 2 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте дополнительные клеточные суспензии (обычно удвоенные объемы по мере необходимости), чтобы обеспечить точные дозы инъекций (например, чтобы избежать мертвых зон внутри шприцев).

2. Операция по внутрисердечной инъекции клеток рака предстательной железы человека

ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургический аппарат, используемый для внутрисердечной инъекции, представляет собой шприц объемом 1 мл (рис. 1). Обеспечьте тепловую поддержку на протяжении всей процедуры до тех пор, пока животное не оправится от анестезии.

  1. Держите мышь в комнате для животных с SPF. Выполняйте все процедуры с помощью стерилизованных аппаратов в асептическом шкафу.
  2. Анестезируйте мышей, используя 2% изофлурана с 98% кислородом при скорости потока кислорода 2 л / мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесите небольшое количество офтальмологической мази на глаза мыши, чтобы избежать сухости во время анестезии. Выполняйте всю операцию в хорошо проветриваемом помещении. Убедитесь, что мышь находится под глубоким наркозом, ущипнув пальцы мыши перед инъекцией клеток. Если реакция (например, рывок или подергивание) остается, подождите дополнительное время, пока анестезия подействует.
  3. Поместите мышь в положение супона и обездвижите обе верхние конечности, перпендикулярно вытянутые от средней линии (рис. 2А).
  4. Иммобилизуйте мышь от живота вниз хирургическим скотчем. Избегайте сильного надавливания и смещения внутренних органов (рис. 2B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание топографической анатомии (т.е. фиксация клейкой лентой) имеет важное значение, поскольку внутрисердечная инъекция слепа (т.е. точное место инъекции на сердце невидимо невооруженным глазом).
  5. Продезинфицируйте кожу грудной клетки с помощью тампона с 70% этанолом.
  6. Определите мечевидный отросток мыши в углублении на самом нижнем конце средней грудины, пальпируя середину передней грудной стенки. Определите яремную выемку мыши в центральном углублении на верхней границе манубриума, пальпируя вверх от середины передней грудной стенки.
  7. Отметьте маркером самую нижнюю точку мечевидного отростка и яремную выемку (рис. 2А). Сделайте третью отметку посередине этих двух ориентиров и немного правее (слева от животного) прямо над сердцем в третьем межреберье.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Место инъекции находится в 1-2 мм слева от средней линии, а точка инъекции находится между третьим и четвертым ребрами мыши (рис. 2A).
  8. Загрузите 200 мкл клеточной суспензии в шприц объемом 1 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите пузырь воздуха в шприце, как показано на рисунке 2C, чтобы убедиться, что кровь пульсирует. Клеточную суспензию перед загрузкой необходимо тщательно перемешать.
  9. Вертикально введите иглу 26 G через место инъекции (рис. 2D).
  10. Держите руку, держащую шприц, устойчиво на столе, или используйте другую руку, чтобы удерживать его устойчиво. Убедитесь, что длинная ось шприца перпендикулярна месту инъекции, и вставьте шприц примерно на 2 мм подкожно.
  11. Ярко-красная пульсация крови видна в игольчатой втулке и/или клеточной суспензии, когда кончик иглы правильно введен в левый желудочек. Если пульсация крови незаметна, кончик иглы находится не в сердце. Втяните и замените иглу (в случае, если свертывание крови внутри иглы останавливает пульсацию крови). Вставьте иглу еще раз.
  12. Вводите клетки. Вводите клеточную суспензию (100 мкл) очень медленно в течение 40-60 с и все время держите руку, держащую шприц, устойчивой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Внимательно следите за клеточной суспензией в шприце и не вводите пузырь воздуха внутри шприца в сердце.
  13. Надавите на место инъекции сухим ватным тампоном в течение 15 с, чтобы обеспечить гемостаз при втягивании иглы.
  14. Верните мышь в чистую клетку и следите за животным до тех пор, пока оно полностью не оправится от наркоза.
  15. Сфотографируйте мышь с помощью биолюминесцентной системы in vivo в течение 24 часов после инъекции, чтобы убедиться, что раковые клетки попали в системный кровоток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Правильно введенные раковые клетки попадают в артериальное кровообращение через левый желудочек сердца, что видно по биолюминесцентной сигнализации, видимой по всему телу (например, см. рис. 3A).
  16. Выполняйте биолюминесцентную визуализацию in vivo .
    1. Включите прибор и компьютер. Откройте программное обеспечение, когда индикатор питания на приборе и компьютере загорится, а затем откройте окно «Получение изображения ».
    2. Определите систему визуализации in vivo , подключенную к компьютеру, на панели устройства. Поместите мышь для получения изображения в камеру визуализации в положении лежа на спине. Затем закройте дверцу камеры визуализации.
    3. Задайте параметры на панели « Настройка » в окне «Получение изображения ».
      1. Установите параметры с помощью объектива > Zoom > 1x, Lens > Focus > 108 и Lens > Iris > F 2.8 , чтобы сделать изображения четкими.
      2. Установите канал съемки в поле «Фильтр и свет»: «Фильтр и свет» > «Фильтр > люминесценции», «Фильтр и свет > свет» > «Выкл.» и «Фильтр и свет» > интенсивности света > середине.
      3. Установите тип изображения, которое будет сделано: Image > Type > Single-Frame, Imaging > Exposure Time > 500 ms, Imaging > HDR Mode > Low GainMode. Нажмите кнопку «Получить », чтобы получить изображение.
  17. Визуализируйте рост метастатического рака с помощью биолюминесценции in vivo .
    ПРИМЕЧАНИЕ: В каждый момент времени визуализации внутрибрюшинно вводите 200 мкл субстрата люциферина мышке весом 20 г (150 мг / кг) и подождите 15 минут перед анестезией (2% изофлуран, смешанный с 98% кислородом в индукционной камере). Поместите мышь на платформу системы биолюминесцентной визуализации. Поддерживают анестезию через назальную маску с 2% изофлураном.

3. Патологоанатомическое исследование

  1. Через четыре недели после инъекции клеток пожертвуйте мышь ингаляцией CO2 , а затем вывихом шейки матки.
  2. Обездвижите мышь в положении лежа на спине. Сделайте вертикальный разрез (около 6 см) от живота до грудной клетки хирургическими ножницами, чтобы обнажить и грубо исследовать все органы брюшной полости и грудной клетки на наличие раковых поражений и/или патологических изменений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для внутрисердечного исследования инъекции раковых клеток раковые поражения в средостении, прилегающем к сердцу, предполагают неправильно введенные раковые клетки (клетки, не введенные в левый желудочек сердца); Поэтому эти мыши не включаются в окончательный сбор данных.
  3. Иссекают метастатические опухоли ножницами. Измерьте длинные диаметры (a) и короткие диаметры (b) опухоли с помощью штангенциркуля, чтобы рассчитать объем опухоли (V) по формуле V = 1/2 × a × b2, и взвесьте опухоль с помощью электронных весов.
  4. Фиксируют опухолевые ткани в 10% растворе формалина с последующим заделыванием в парафин. В качестве альтернативы можно заморозить опухоли в жидком азоте.
  5. Иссекают кости (задние конечности, позвонки и/или ребра) с метастатическими поражениями. Зафиксируйте образец каждой мыши в пробирке объемом 50 мл, содержащей 20 мл 10% раствора формалина, в течение 24 ч после удаления кожи и мышц с последующей декальцификацией в течение 14 дней в 10% растворе ЭДТА с частой сменой буфера (каждые 3 дня).
  6. Поместите образец в парафин и разделите образцы для рутинного гистологического исследования16.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Биолюминесцентная визуализация дает огромные преимущества в мониторинге развития метастатического поражения для внутрисердечной инъекционной модели. Вскоре после инъекции раковых клеток (в течение 24 часов) биолюминесцентная визуализация использовалась для визуализации раковых клеток, поступающих в общий кровоток (рис. 3А). Очевидная биолюминесцентная сигнализация по всему телу будет видна, когда раковые клетки будут введены в артериальное кровообращение должным образом. Данные мышей, демонс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Внутрисердечная инъекция клеток рака предстательной железы человека для получения метастазов в кости является идеальной моделью мыши для изучения функций и механизмов метастазирования рака предстательной железы в кости и оценки терапевтической эффективности. Исследования показали, что повреждение костей, скорее всего, происходит в проксимальном отделе большеберцовой кости идистальном отделе бедренной кости 17, что может быть связано с их высокой васкуляризацией и метаболической активностью.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Все авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа поддерживается грантами Национальной программы ключевых исследований и разработок Китая (2018YFC1704300 и 2020YFE0201600), Национального фонда естественных наук (81973877 и 82174408), исследовательских проектов в рамках бюджета Шанхайского университета традиционной китайской медицины (2021LK047) и Шанхайского совместного инновационного центра промышленной трансформации подготовки больниц к ТКМ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 мл шприцев и иглShandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd20200411Клетки вводились в желудочки мышей
Наркозный аппаратShenzhen RWD Life Technology Co., LtdR500IPОборудование для анестезии мышей
Автоматический счетчик клетокShanghai Simo Biological Technology Co., LtdIC1000  Для подсчета клеток
BALB/c атимических мышейShanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.Самец6-8 недель, самец мышей
Биолюминесцентная система визуализацииShanghai Baitai Technology Co., LtdVieworksДля отслеживания роста опухоли и метастазирования в легкие, если введенные клетки помечены люциферазой
Центрифуга в пробирке (15 мл, 50 мл)Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd  430790, Corning
EDTA solutionWuhan Xavier Biotechnology Co., LtdG1105  Для декальцинации костной оболочки
среды F-12Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd21700075, GIBCOСреда для культивирования клеток
Раствор формалинаShanghai YueNian Biotechnology Co., LtdBL539AДля фиксации образца каждой мыши
IsofluraneShenzhen RWD Life Technology Co., LtdVETEASYДля анестезии 
Липофектамин 2000Шанхай YueNian Biotechnology Co., Ltd11668027, Thermo fisherПлазмидный реагент для трансфекции
PC-3 клеточная линияБанк клеток Китайской академии наукTCHu 158Клеточная линия рака предстательной железы
Фосфатно-солевой буферBeyotime BiotechnologyST447Промыть клетки остеосаркомы человека
Трипсин (0,25%)Шанхай YueNian Biotechnology Co. , Ltd25200056, GibcoДля отделения клеток
Вектор (pLV-люцифераза)Shanghai YueNian Biotechnology Co., LtdVL3613Плазмида для трансфекционной
рентгеновской визуализации Brook(Beijing) Technology Co., LtdFX PROДля получения рентгеновских изображений для обнаружения роста опухоли
μ CT80Shenzhen Fraun Technology Service Co., LtdScanco Medical AG, ШвейцарияДля обнаружения разрушения костей. MICO-CT оснащен 3DCalc, реконструкцией конуса,   и μ Программное обеспечение для визуализации моделей CT Ray V3.4A.

Ссылки

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer Cancerstatistics, 2021. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).
  2. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  3. Coleman, R. E. Skeletal complications of malignancy. Cancer. 80, 1588-1594 (1997).
  4. Macedo, F., et al. Bone metastases: An overview. Oncology Reviews. 11 (1), 321(2017).
  5. Rea, D., et al. Mouse models in prostate cancer translational research: From xenograft to PDX. BioMed Research International. 2016, 9750795(2016).
  6. Zhang, Y., et al. Real-time GFP intravital imaging of the differences in cellular and angiogenic behavior of subcutaneous and orthotopic nude-mouse models of human PC-3 prostate cancer. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (11), 2546-2551 (2016).
  7. Stephenson, R. A., et al. Metastatic model for human prostate cancer using orthotopic implantation in nude mice. Journal of the National Cancer Institute. 84 (12), 951-957 (1992).
  8. Simmons, J. K., et al. Animal models of bone metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
  9. Jenkins, D. E., Hornig, Y. S., Oei, Y., Dusich, J., Purchio, T. Bioluminescent human breast cancer cell lines that permit rapid and sensitive in vivo detection of mammary tumors and multiple metastases in immune deficient mice. Breast Cancer Research: BCR. 7 (4), 444-454 (2005).
  10. Corey, E., et al. Establishment and characterization of osseous prostate cancer models: intra-tibial injection of human prostate cancer cells. The Prostate. 52 (1), 20-33 (2002).
  11. Andersen, C., Bagi, C. M., Adams, S. W. Intra-tibial injection of human prostate cancer cell line CWR22 elicits osteoblastic response in immunodeficient rats. Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interactions. 3 (2), 148-155 (2003).
  12. Sudhan, D. R., Pampo, C., Rice, L., Siemann, D. W. Cathepsin L inactivation leads to multimodal inhibition of prostate cancer cell dissemination in a preclinical bone metastasis model. International Journal of Cancer. 138 (11), 2665-2677 (2016).
  13. Jinnah, A. H., Zacks, B. C., Gwam, C. U., Kerr, B. A. Emerging and established models of bone metastasis. Cancers. 10 (6), 176(2018).
  14. Simmons, J. K., et al. Canine prostate cancer cell line (Probasco) produces osteoblastic metastases in vivo. The Prostate. 74 (13), 1251-1265 (2014).
  15. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. The Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
  16. Chang, J., et al. Matrine inhibits prostate cancer via activation of the unfolded protein response/endoplasmic reticulum stress signaling and reversal of epithelial to mesenchymal transition. Molecular Medicine Reports. 18 (1), 945-957 (2018).
  17. Arguello, F., Baggs, R. B., Frantz, C. N. A murine model of experimental metastasis to bone and bone marrow. Cancer Research. 48 (23), 6876-6881 (1988).
  18. Brylka, L., et al. Spine Metastases in immunocompromised mice after intracardiac injection of MDA-MB-231-SCP2 breast cancer cells. Cancers. 14 (3), 556(2022).
  19. Rahman, M. M., Veigas, J. M., Williams, P. J., Fernandes, G. DHA is a more potent inhibitor of breast cancer metastasis to bone and related osteolysis than EPA. Breast Cancer Research and Treatment. 141 (3), 341-352 (2013).
  20. Park, S. I., Kim, S. J., McCauley, L. K., Gallick, G. E. Pre-clinical mouse models of human prostate cancer and their utility in drug discovery. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 14, Unit 14.15 (2010).
  21. Wright, L. E., et al. Murine models of breast cancer bone metastasis. BoneKEy Reports. 5, 804(2016).
  22. Fearon, K. C., Glass, D. J., Guttridge, D. C. Cancer cachexia: mediators, signaling, and metabolic pathways. Cell Metabolism. 16 (2), 153-166 (2012).
  23. Waning, D. L., et al. Excess TGF-β mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice. Nature Medicine. 21 (11), 1262-1271 (2015).
  24. Talbot, S. R., et al. Defining body-weight reduction as a humane endpoint: a critical appraisal. Laboratory Animals. 54 (1), 99-110 (2020).
  25. Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
  26. Yin, J. J., et al. TGF-beta signaling blockade inhibits PTHrP secretion by breast cancer cells and bone metastases development. The Journal of Clinical Investigation. 103 (2), 197-206 (1999).
  27. Schneider, A., et al. turnover mediates preferential localization of prostate cancer in the skeleton. Endocrinology. 146 (4), 1727-1736 (2005).
  28. Padalecki, S. S., et al. Chromosome 18 suppresses prostate cancer metastases. Urologic Oncology. 21 (5), 366-373 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

клетки PC3биолюминесцентная визуализацияметастатические очагирентгенографиямикрокомпьютерная томографияокрашивание гематоксилином и эозином
Внутрисердечная инъекция клеток рака предстательной железы человека для создания мышиной модели ксенотрансплантата с метастазами в кости
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.