Методическая статья

Оценка процесса и кинетика экспрессии рекомбинантной хитиндеацетилазы в клетках E. coli Rosetta pLysS с использованием статистического метода

DOI:

10.3791/64590

⸱

10 марта 2023 г.

 ,  , 
1Department of Biotechnology, Manipal Institute of Technology, Manipal Academy of Higher Education (MAHE)

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящем протоколе был применен статистический метод, центральный композитный дизайн (CCD), для оптимизации условий процесса экспрессии рекомбинантной бактериальной хитиндеацетилазы (BaCDA) в клетках E. coli Rosetta pLysS. Применение CCD привело к увеличению экспрессии и активности BaCDA в ~2,39 раза.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В последние годы все большее значение приобретает более экологичный путь деацетилирования хитина до хитозана с использованием фермента хитиндеацетилазы. Ферментативно преобразованный хитозан с эмулирующими характеристиками имеет широкий спектр применения, особенно в биомедицинской области. Сообщалось о нескольких рекомбинантных хитиндеацетилазах из различных источников окружающей среды, но нет исследований по оптимизации процесса производства этих рекомбинантных хитиндеацетилаз. В настоящем исследовании использовалась методология центрального композитного дизайна поверхности ответа для максимизации продукции рекомбинантной бактериальной хитиндеацетилазы (BaCDA) в E. coli Rosetta pLysS. Оптимизированные условия процесса: концентрация глюкозы 0,061%, концентрация лактозы 1%, температура инкубации 22 °C, скорость перемешивания 128 об/мин и 30 часов ферментации. В оптимизированных условиях экспрессия за счет индукции лактозы начиналась через 16 ч ферментации. Максимальная экспрессия, биомасса и активность BaCDA были зарегистрированы через 14 ч после индукции. В оптимизированном состоянии активность BaCDA экспрессии BaCDA была увеличена в ~2,39 раза. Оптимизация процесса сократила общий цикл ферментации на 22 ч и время сцеживания на 10 ч после индукции. Это первое исследование, в котором сообщается об оптимизации процесса экспрессии рекомбинантной хитиндеацетилазы с использованием центрального композитного дизайна и его кинетического профилирования. Адаптация этих оптимальных условий роста может привести к экономически эффективному, крупномасштабному производству менее изученной монерандеацетилазы, что позволит начать более экологичное производство хитозана биомедицинского класса.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хитин, структурный β, 1-4 гликозидный связанный природный полимер, является вторым по распространенности полисахаридом в природе после целлюлозы. Несмотря на этот факт, хитин имеет ограниченное промышленное применение из-за своей нерастворимости1. Это узкое место устраняется путем воздействия на хитин N-деацетилирования, которое придает положительный заряд и увеличивает растворимость полученного полимера хитозана1. Хитин может быть модифицирован в хитозан двумя различными путями: химическим и ферментативным. Биомедицинское применение хитозана требует контролируемого и определенного деацетилирования, которое ограничено химическими путями 2,3. Это ограничение может быть устранено с помощью хитиндеацетилаз (CDA), зеленого ферментативного подхода к процессу деацетилирования 4,5.

Хитиндеацетилаза принадлежит к семейству углеводных эстераз-4 (CE-4), определенному в базе данных углевод-активных ферментов (CAZY). Ферменты семейства CE-4 имеют общую гомологию NodB или полисахариддеацетилазный домен в качестве консервативной области. Центральный композитный дизайн (CCD), статистический инструмент, используется для оптимизации нескольких хитин-модифицирующих ферментов дикого типа 6,7,8,9. Тем не менее, последующие этапы использования организмов дикого типа становятся утомительными, отсюда и сдвиг в сторону рекомбинантных ферментов 10,11,12,13,14,15,16,17. В последние годы галофильные рекомбинантные CDA из морских источников приобрели значение из-за их простоты в промышленном применении и производстве хитозанабиомедицинского класса 18,19.

Продукция рекомбинантного фермента в E. coli имеет ограничение на процесс, и необходима оптимизация среды, поскольку его экспрессия в E. coli изменяется в зависимостиот используемого гена и плазмиды. Таким образом, скрининг подходящего процесса и параметров питательных веществ становится важным. Один фактор за раз (OFAT), широко используемый метод оптимизации, требует огромных ресурсов и времени для проведения пошаговых экспериментов. Этот метод страдает от недостатка статистической информации о взаимодействии между параметрами 20,21,22,23. Поэтому для изучения выхода экспрессии галофильной бактериальной хитиндеацетилазы (BaCDA) и активности BaCDA у E. coli Rosetta pLysS была принята методология поверхности ответа (RSM). Для оптимизации экспрессии E. coli учитывались такие параметры, как концентрация лактозы, концентрация глюкозы, температура инкубации, скорость перемешивания и время инкубации. В большинстве исследований экспрессии E. coli в качестве индуктора использовали среду Luria Bertani (LB) с изопропилом β-d-1-тиогалактопиранозидом (IPTG). Это добавление IPTG потребовало регулярного мониторинга роста24. Эти повторяющиеся опосредования в процессе ферментации также открывают пути для загрязнения. Следовательно, исследовательские группы перешли на потрясающий бульон (ТБ) с лактозой в качестве индуктора. Включение лактозы в средства массовой информации вместо ПЦПГ решает эту проблему; E. coli потребляет эту лактозу и производит алло-лактозу в качестве побочного продукта, что приводит к состоянию аутоиндукции. Эта автоиндукторующая среда включает глицерин, который продемонстрировал улучшенный выход рекомбинантного белка25.  Эта сверхэкспрессия рекомбинантных белков в туберкулезных средах была дополнительно улучшена за счет оптимизации параметров процесса. В настоящем исследовании был применен центральный композитный дизайн для оптимизации гетерологичной экспрессии галофильной BaCDA в клетках E. coli Rosetta pLysS. В качестве параметров процесса были выбраны температура инкубации, скорость перемешивания и время инкубации, а в качестве параметров питательных веществ оценивались концентрация глюкозы и лактозы. Галофильная экспрессия BaCDA оценивалась с помощью прогнозируемого оптимизированного состояния и подвергалась перекрестной проверке с помощью SDS-PAGE.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Условия выражения и культуры

  1. Трансформируйте вектор pET-22b, содержащий ген BaCDA, в компетентные клетки E. coli Rosetta pLysS с помощью метода теплового шока, как описано впункте 15.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с микроорганизмами необходимо соблюдать осторожность. Во избежание загрязнения все микробиологические работы должны выполняться внутри вытяжки шкафа биобезопасности.
  2. Проведите предварительное исследование экспрессии в противотуберкулезных средах, содержащих 0,05% (мас./об.) глюкозы и 0,2% (мас./об.) лактозы при 16 °С и 180 об/мин. Вырастите 6,792 x 107 клеток E. coli Rosetta pLysS в 100 мл среды, содержащей клонированную плазмиду BaCDA, до тех пор, пока она не перейдет в стационарную фазу. При указанных условиях роста клетки E. coli Rosetta pLysS достигают оптической плотности 600 (наружный диаметр600) 10,85 ± 0,21.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Состав ТБ сред (% по массе): триптон, 1,2; дрожжевой экстракт, 2,4; глицерин, 0,6; и 1x ТБ соли (17 мМ KH2PO4 и 74 мМ K2HPO4)17.

2. Оптимизация и планирование эксперимента

  1. Планируйте эксперименты и подгоняйте полиномиальную модель второго порядка к центральному композитному проектированию с помощью программного обеспечения статистического инструмента. В настоящем исследовании использовалось статистическое программное обеспечение MINITAB 17.0 (пробная версия).
    1. Для этого откройте программу и нажмите на следующие кнопки: Stat > DoE > Поверхность отклика > Создать поверхность отклика > Дизайн отклика > Центральный композит. Вывод отображается в виде диалогового окна.
  2. Подайте данные по пяти параметрам: температуре инкубации, скорости перемешивания, времени инкубации, концентрации глюкозы и концентрации лактозы на пяти уровнях (-2, -1, 0, +1, +2) в диалоговом окне.
    1. Для этого введите параметры с уровнями в диалоговое окно, введите детали всех параметров и нажмите OK. В результате создается матрица экспериментального дизайна с шестью повторами в центральной точке, что требует 32 экспериментальных прогона. Программное обеспечение формирует таблицу, содержащую параметры и их уровни в кодированных и некодированных терминах, используемых при оптимизации технологического процесса с помощью ПЗС-матрицы (табл. 1).
  3. Проведите 32 эксперимента с условиями, созданными программным обеспечением. Вводите результаты эксперимента в матрицу экспериментального дизайна (сгенерированную программным обеспечением), содержащую уровни и параметры в терминах кодированных и некодированных единиц (таблица 2).
  4. Проанализируйте матрицу планирования эксперимента (Таблица 2) с помощью программного обеспечения. Для этого откройте программное обеспечение и введите ответ в таблицу данных. Выберите столбец "Ответ" > "Статистика" > "DoE" > поверхность ответа > "ОК" > "Анализ структуры поверхности ответа". Выходные данные анализируются на предмет статистической значимости, и программное обеспечение прогнозирует модель.

Таблица 1: Параметры и их уровни в кодированных и некодированных терминах, использованных в дизайне эксперимента для оценки экспрессии рекомбинантной хитиндеацетилазы в клетках E. coli Rosetta pLysS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Матрица экспериментального дизайна с экспериментальной и прогнозируемой активностью (экспрессией) BaCDA рекомбинантной хитиндеацетилазы в клетках E. coli Rosetta pLysS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

3. Валидация модели

  1. Проверьте разработанную модель с помощью инструмента оптимизатора отклика, доступного в программном обеспечении.
  2. Повторите ферментацию в прогнозируемых программно оптимальных условиях и сравните экспериментальное значение с прогнозируемым программным обеспечением.
    1. Для этого откройте программу и выберите столбец «Ответ» > «Статистика» > «DoE» > поверхность «Ответ» > «Оптимизатор ответов» > «Максимизировать > OK». На выходе получаются оптимальные технологические условия и значения, прогнозируемые программным обеспечением. Повторите ферментацию в прогнозируемых оптимальных условиях и сравните значения.

4. Аналитические методы

  1. Экспрессия, биомасса и количественное определение белка
    1. Провести ферментацию в 32 условиях, заданных программным обеспечением в матрице планирования эксперимента (табл. 2). Получайте гранулу после каждого прогона путем центрифугирования культуры при 5 405 x g в течение 10 мин при 4 °C. Взвесьте клеточную гранулу, чтобы определить выход биомассы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вся работа с микроорганизмами должна производиться в асептических условиях (т.е. внутри шкафов биобезопасности).
    2. Лизируйте клеточную гранулу для получения периплазматического белка методом ультразвуковой обработки. Добавьте 5 мл буфера для лизиса (50 мМ Tris-HCl, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазола) к каждому грамму клеточной гранулы и разрушайте путем ультразвуковой обработки в течение 10 циклов с импульсом 10 с включением и 10 с выключением при амплитуде 60%. Соберите лизат центрифугированием при температуре 5 405 x g в течение 10 мин при 4 °C. Количественно определите концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда26.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать денатурации белка, ультразвуковую обработку необходимо проводить в холодных условиях. Поместите образцы на лед во время проведения ультразвуковой обработки.
    3. Проанализируйте экспрессию BaCDA с помощью SDS-PAGE, а затем программного обеспечения ImageJ. Загрузите 10 мкл растворимого клеточного лизата (периплазматического белка) в 12% бис-акриламидный гель и запустите в буфере 1x трис-глицин-SDS (TGS) при токе 100 В в течение 2 ч. После завершения прогона окрасьте гель синим цветом Кумасси и удалите пятна, чтобы удалить фон27.
    4. Захват изображения с помощью блока документирования геля. Определение экспрессии BaCDA путем сравнения интенсивности канала в виде значений пикселей с помощью программного обеспечения ImageJ. Рассмотрим экспериментальный прогон с наименьшей активностью и биомассой BaCDA в качестве эталонного пикселя 28.
      1. Для этого откройте программу и откройте файл изображения, затем выделите каждую полосу с помощью прямоугольного поля. Перейдите в раздел «Анализ» и установите для каждой полосы значение 100%, затем выберите сверхвыраженную полосу в каждой полосе с помощью прямоугольного поля. Перейдите в раздел «Анализ» и определите интенсивность полосы, повторите процесс на каждой полосе и экспортируйте результат .xls файл. Рассмотрите интенсивность полосы частот экспериментального прогона с самой низкой активностью BaCDA в качестве эталонной интенсивности и проанализируйте экспрессию каждой полосы.
  2. Анализ активности ферментов
    1. Определить активность BaCDA с помощью набора для ацетатного анализа15 с использованием хитина этиленгликоля (1 мг/мл; EGC) в качестве субстрата29.
    2. Дайте 20 мкл BaCDA вступить в реакцию с 40 мкл субстрата в присутствии 40 мкл 50 мМ буфера Tris-HCl (pH 7) в течение 1 ч при 30 °C путем перемешивания при 800 об/мин.
    3. Через 1 ч 100 мкл реагента центрифугируют через колонку с массой 3 кДа при давлении 2111 x g в течение 15 мин при 4°С. Отбросить ретентат, содержащий BaCDA, и собрать фильтрат, содержащий ацетат, высвобожденный в ходе реакции. Используйте фильтрат для анализа ацетата для определения активности BaCDA.
      Примечание: Одна единица фермента определяется как активность, которая высвобождает 1 мкМ ацетата из субстрата на микролитр фермента в минуту. Анализ активности фермента проводили в трех экземплярах, и соответственно рассчитывали соответствующую активность фермента.
  3. Кинетика ферментации при индукции лактозы
    1. Исследуйте профиль активности, чтобы определить точку индукции лактозы и начальную точку экспрессии. Профилирование активности производится путем оценки биомассы и активности BaCDA с оптимизированными условиями ферментации.
    2. Определите концентрацию глюкозы в среде с помощью набора для оценки уровня глюкозы. Составьте график профиля активности с использованием биомассы, концентрации глюкозы и активности BaCDA в зависимости от времени ферментации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оптимизация процесса экспрессии периплазматического рекомбинантного фермента хитиндеацетилазы в E. coli с использованием центрального композитного дизайна (CCD)
Конструкция pET22b-Ba CDA при выращивании в неоптимизированных условиях давала максимальный выход биомассы и активность BaCDA 22,26 ± 0,98 г/л и 84,67 ± 0,56 Ед/л соответственно15. В настоящем исследовании был принят статистический подход CCD для поиска оптимальных условий процесса экспрессии ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Деацетилированный хитин, хитозан, имеет множество применений, особенно в биомедицинской области30. Тем не менее, воспроизводимость хитозана в отношении его степени ацетилирования (DA) и характера ацетилирования (PA) является серьезной проблемой в дополнение к другим экологическим опасениям. Таким образом, был использован более экологичный путь с использованием ферментов. Массив CDA может быть использован для создания хитозана с уникальным типом деацетилирования, что увеличитих би...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить Manipal Academy for Higher Education (MAHE) за фонд MAHE UNSW, а авторы хотели бы поблагодарить Совет по научным и промышленным исследованиям - Группу развития человеческих ресурсов (CSIR-MHRD) правительства Индии за стипендию для старших исследователей, присуждение письма No 09/1165(0007)2K19 EMR-I от 31.3.2019.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Kits
Acetate Anasay kitMegazyme, ИрландияK-ACETAKПротокол был немного изменен и оптимизирован для проведения анализа на 96 луночном планшете
Набор для оценки глюкозыAgappe diagnosis Ltd., Индия12018013Протокол был немного изменен и оптимизирован для проведения анализа на 96 луночном планшете
Chemicals
Acetic acidHi-media, ИндияAS001Используется для приготовления окрашивающего и обеззараживающего раствора SDS-PAGE
АкриламидHi-media, ИндияMB068Используется для приготовления геля SDS-PAGE
Пурсульфат аммонияHi-media, ИндияMB003Используется для приготовления геля SDS-PAGE
Бис-акриламидHi-media, ИндияMB005Используется для приготовления геля SDS-PAGE
Coomassie briliiiant blue G-250Hi-media, ИндияMB092Используется для приготовления раствора для окрашивания и удаления стей SDS-PAGE
Coomassie briliiiant blue R-250Hi-media, IndiaMB153Используется для приготовления анализа Бардфорда
Этиленгликоль хитозанSigma-aldrich, СШАE1502Используемый для получения этиленгликоль хитина и этиленгликоль хитин использовался в качестве субстрата для ферментативной реакции
D-глюкозыHi-media, IndiaMB037Использовался в качестве компонента среды.
ИмидазолHi-media, ИндияGRM1864Используется в буфере для лизиса
LactoseHi-media, ИндияGRM017Используется в качестве компонента среды.
МетанолФинар, Индия30930LC250Используется для приготовления раствора для окрашивания и удаления стадий SDS-PAGE
Хлорид натрия (NaCl)Hi-media, ИндияMB023Используется в буфере для лизиса
Фосфорная кислотаHi-media, ИндияMB157Используется для приготовления анализа Бардфорда
додецилсульфата натрия (SDS)Hi-media, ИндияGRM6218Используется для приготовления геля SDS-PAGE
Фосфат натрия двухосновной безводныйHi-media, ИндияMB024Используется для приготовления салата из туберкулеза для сред и буфера для ферментативной реакции.
Фосфат натрия одноосновной безводныйHi-media, ИндияGRM3964Используется для приготовления салата из туберкулеза для сред и буфера для ферментативной реакции.
Тетраметилэтилендиамин (TEMED)Hi-media, ИндияMB026Используется для приготовления геля SDS-PAGE
Tris baseHi-media, ИндияMB029Используется для приготовления геля SDS-PAGE
TryptoneHi-media, ИндияRM7707Используется в качестве компонента среды.
Дрожжевой экстрактHi-media, ИндияRM027Используется в качестве компонента среды.
Equipment
AlphaImager Блок документирования геляHP ProteinSimple, США92-13823-00Используется для захвата фотографий SDS-PAGE
Настольный миксерEppendorf, Германия 9.776 660Используется для поддержания ферментативной реакции с адаптером 2 мл Биоинкубатор
шейкерTrishul instruments, Индия13410622Используется для инкубации бактериальной культуры при различных температурах и RPM
БиоспектрофотометрEppendorf, Германия 6135000009Используется для снятия всех спектроскопических показаний
Охлаждающая центрифугаEppendorf, Германия 5805000017Используется для центрифугирования культуры, лизата и всех других протоколов центрифугирования
Сухая ваннаLabnet International, СШАS81522039Используется для денатурации образца белка для SDS-PAGE
МикропипеткиEppendorf, Германия 3123000900Используется в протоколе для измерения объема
Качалочный шейкерTrishul instruments, Индия11770719Используется для встряхивания геля SDS-PAGE для окрашивания и распыления
устройства SDS-PAGEBio-Rad, США1658001FCИспользуется для литья и запуска геля SDS-PAGE
Ультра ультразвуковой аппаратSonics & Materials, Inc., СШАVCX 130Используется для лизиса бактериальной клетки методом ультраультразвука
Весовые весыSartorius, ГерманияBSA124 SИспользуется для измерения веса по всему протоколу
Devices
Nanosep Центробежные устройства с омега-мембраной (3 кДа)PALL для медико-биологических наук, СШАOD003C33Используется для выделения фермента после субстрата treatment
Softwaresверсияразработана в
MINITAB17.0  (Пробная версия)  Университет штата ПенсильванияИспользовано для разработки экспериментальной модели и анализа данных
ImageJ1.53oНациональные институты здравоохранения (NIH)Использовано для анализа уровня экспрессии с помощью SDS-PAGE image
Plasmid
pET22b (+) DNA— NovagenMerck-Millipore, США69744Хранится при температуре &минус 20 °°; C
Cells
E. coli Rosetta pLysS— NovagenMerck- Millipore, США70956Обслуживается в Luria– Бульон Bertani (LB), содержащий 25% глицерина при &минус; 80 ° С

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yadav, M., et al. Seafood waste: a source for preparation of commercially employable chitin/chitosan materials. Bioresources and Bioprocessing. 6 (1), 1-20 (2019).
  2. Anil, S. Potential medical applications of chitooligosaccharides. Polymers. 14 (17), 3558(2022).
  3. Amiri, H., et al. Chitin and chitosan derived from crustacean waste valorization streams can support food systems and the UN Sustainable Development Goals. Nature Food. 3 (10), 822-828 (2022).
  4. Wattjes, J., et al. Patterns matter part 1: Chitosan polymers with non-random patterns of acetylation. Reactive and Functional Polymers. 151, 104583(2020).
  5. Cord-Landwehr, S., et al. Patterns matter part 2: Chitosan oligomers with defined patterns of acetylation. Reactive and Functional Polymers. 151, 104577(2020).
  6. He, Y., Xu, J., Wang, S., Zhou, G., Liu, J. Optimization of medium components for production of chitin deacetylase by Bacillus amyloliquefaciens Z7, using response surface methodology. Biotechnology and Biotechnological Equipment. 28 (2), 242-247 (2014).
  7. Pareek, N., Vivekanand, V., Saroj, S., Sharma, A. K., Singh, R. P. Purification and characterization of chitin deacetylase from Penicillium oxalicum SAE M-51. Carbohydrate Polymers. 87 (2), 1091-1097 (2012).
  8. Yonis, R. W., Luti, K. J. K., Aziz, G. M. Statistical optimization of chitin bioconversion to produce an effective chitosan in solid state fermentation by Asperigellus flavus. Iraqi Journal of Agricultural Sciences. 50 (3), 916-927 (2019).
  9. Deeba, F., Shakir, H. A., Irfan, M., Khan, M., Qazi, J. I. Utilization of agro-industrial waste for chitinase production by locally isolated bacillus subtilis using response surface methodology. Pakistan Journal of Zoology. 54 (2), 551-560 (2022).
  10. Pandey, A., Tripathi, A. H., Tripathi, P. H. Production, purification, and application of the microbial enzymes. Industrial Applications of Microbial Enzymes. , CRC Press. 19-39 (2022).
  11. Bhat, P., et al. Expression of Bacillus licheniformis chitin deacetylase in E. coli pLysS: Sustainable production, purification and characterisation. International Journal of Biological Macromolecules. 131, 1008-1013 (2019).
  12. Hamer, S. N., et al. Enzymatic production of defined chitosan oligomers with a specific pattern of acetylation using a combination of chitin oligosaccharide deacetylases. Scientific Reports. 5, 8716(2015).
  13. Kadokura, K., et al. Production of a recombinant chitin oligosaccharide deacetylase from Vibrio parahaemolyticus in the culture medium of Escherichia coli cells. Biotechnology Letters. 29 (8), 1209-1215 (2007).
  14. Liu, J., et al. Identification and characterization of a chitin deacetylase from a metagenomic library of deep-sea sediments of the Arctic Ocean. Gene. 590 (1), 79-84 (2016).
  15. Pawaskar, G. M., Raval, K., Rohit, P., Shenoy, R. P., Raval, R. Cloning, expression, purification and characterization of chitin deacetylase extremozyme from halophilic Bacillus aryabhattai B8W22. Biotech. 11 (12), 515(2021).
  16. Raval, R., Simsa, R., Raval, K. Expression studies of Bacillus licheniformis chitin deacetylase in E. coli Rosetta cells. International Journal of Biological Macromolecules. 104, 1692-1696 (2017).
  17. Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: Advances and challenges. Frontiers in Microbiology. 5, 172(2014).
  18. Yang, G., et al. Enzymatic modification of native chitin and chitin oligosaccharides by an alkaline chitin deacetylase from Microbacterium esteraromaticum MCDA02. International Journal of Biological Macromolecules. 203, 671-678 (2022).
  19. Amer, O. A., et al. Exploring new marine bacterial species, Alcaligenes faecalis Alca F2018 valued for bioconversion of shrimp chitin to chitosan for concomitant biotechnological applications. International Journal of Biological Macromolecules. 196, 35-45 (2022).
  20. Packiam, K. A. R., Ramanan, R. N., Ooi, C. W., Krishnaswamy, L., Tey, B. T. Stepwise optimization of recombinant protein production in Escherichia coli utilizing computational and experimental approaches. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (8), 3253-3266 (2020).
  21. Jayakumar, D., Sachith, S. K., Nathan, V. K., Rishad, K. S. M. Statistical optimization of thermostable alkaline protease from Bacillus cereus KM 05 using response surface methodology. Biotechnology Letters. 43 (10), 2053-2065 (2021).
  22. Balakrishnan, R., Mohan, N., Sivaprakasam, S. Application of design of experiments in bioprocessing: process analysis, optimization, and reliability. Current Developments in Biotechnology and Bioengineering. , 289-319 (2022).
  23. Papaneophytou, C. P., Kontopidis, G. Statistical approaches to maximize recombinant protein expression in Escherichia coli: A general review. Protein Expression and Purification. 94, 22-32 (2014).
  24. Tang, S. R., Somasundaram, B., Lua, L. H. L. Protein expression optimization strategies in E. coli: a tailored approach in strain selection and parallelizing expression conditions. Methods in Molecular Biology. 2406, 93-111 (2022).
  25. Nag, N., Khan, H., Tripathi, T. Strategies to improve the expression and solubility of recombinant proteins in E. coli. Advances in Protein Molecular and Structural Biology Methods. , Academic Press. 1-12 (2022).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  27. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Variations of staining sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels with coomassie brilliant blue. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
  28. Etemadzadeh, M. H., Arashkia, A., Roohvand, F., Norouzian, D., Azadmanesh, K. Isolation, cloning, and expression of E. coli BirA gene for biotinylation applications. Advanced Biomedical Research. 4, 149(2015).
  29. Yin, L., Wang, Q., Sun, J., Mao, X. Expression and molecular modification of chitin deacetylase from Streptomyces bacillaris. Molecules. 28 (1), 113(2023).
  30. Hamedi, H., Moradi, S., Hudson, S. M., Tonelli, A. E., King, M. W. Chitosan based bioadhesives for biomedical applications: A review. Carbohydrate Polymers. 282, 119100(2022).
  31. Falak, S., Sajed, M., Rashid, N. Strategies to enhance soluble production of heterologous proteins in Escherichia coli. Biologia. 77 (3), 893-905 (2022).
  32. Shahzadi, I., et al. Scale-up fermentation of Escherichia coli for the production of recombinant endoglucanase from Clostridium thermocellum. Scientific Reports. 11 (1), 7145(2021).
  33. Ganjave, S. D., Dodia, H., Sunder, A. V., Madhu, S., Wangikar, P. P. High cell density cultivation of E. coli in shake flasks for the production of recombinant proteins. Biotechnology Reports. 33, 00694(2022).
  34. Wurm, D. J., et al. The E. coli pET expression system revisited-mechanistic correlation between glucose and lactose uptake. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (20), 8721-8729 (2016).
  35. Gennari, A., et al. Recombinant production in Escherichia coli of a β-galactosidase fused to a cellulose-binding domain using low-cost inducers in fed-batch cultivation. Process Biochemistry. 124, 290-298 (2023).
  36. Mostovenko, E., Deelder, A. M., Palmblad, M. Protein expression dynamics during Escherichia coli glucose-lactose diauxie. BMC Microbiology. 11, 126(2011).
  37. Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods in Molecular Biology. 1091, 17-32 (2014).
  38. Studier, F. W. Stable cultures and auto-induction for inducible protein production in E. coli. Methods in Molecular Biology. 1091, 17-22 (2014).
  39. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
  40. Selvaraj, S., Natarajan, K., Nowak, A., Murty, V. R. Mathematical modeling and simulation of newly isolated bacillus cereus M1GT for tannase production through semi-solid state fermentation with agriculture residue triphala. South African Journal of Chemical Engineering. 35 (1), 89-97 (2021).
  41. Ghahremanifard, P., Rezaeinezhad, N., Rigi, G., Ramezani, F., Ahmadian, G. Designing a novel signal sequence for efficient secretion of Candida antarctica lipase B in E. coli: The molecular dynamic simulation, codon optimization and statistical analysis approach. International Journal of Biological Macromolecules. 119, 291-305 (2018).
  42. Vuillemin, M., Malbert, Y., Laguerre, S., Remaud-Siméon, M., Moulis, C. Optimizing the production of an α-(1→2) branching sucrase in Escherichia coli using statistical design. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (12), 5173-5184 (2014).
  43. Sattari, F., Rigi, G., Ghaedmohammadi, S. The first report on molecular cloning, functional expression, purification, and statistical optimization of Escherichia coli-derived recombinant Ficin from Iranian fig tree (Ficus carica cv.Sabz). International Journal of Biological Macromolecules. 165, 2126-2135 (2020).
  44. Hajihassan, Z., Biroonro, N. Enhanced expression of recombinant activin A in Escherichia coli by optimization of induction parameters. Journal of Sciences, Islamic Republic of Iran. 29 (2), 105-111 (2018).
  45. Rigi, G., Mohammadi, S. G., Arjomand, M. R., Ahmadian, G., Noghabi, K. A. Optimization of extracellular truncated staphylococcal protein A expression in Escherichia coli BL21 (DE3). Biotechnology and Applied Biochemistry. 61 (2), 217-225 (2014).
  46. Faust, G., Stand, A., Weuster-Botz, D. IPTG can replace lactose in auto-induction media to enhance protein expression in batch-cultured Escherichia coli. Engineering in Life Sciences. 15 (8), 824-829 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Chitin DeacetylaseRecombinant ExpressionE Coli RosettaChitosan ProductionProcess OptimizationCentral Composite DesignResponse Surface MethodologyEnzyme KineticsLactose InductionFermentation Process
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи