Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Генерация крыс с гипопаратиреоидами с помощью паратиреоидэктомии с помощью углеродных наночастиц

2.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64611

⸱

14 июля 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral Diseases, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Department of Cariology and Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2State Key Laboratory of Oral Diseases, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Department of Orthognathic and TMJ Surgery, West China Hospital of Stomatology, 3Guangdong Province Key Laboratory of Stomatology, Hospital of Stomatology, Guanghua School of Stomatology, Sun Yat-Sen University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Животная модель приобретенного гипопаратиреоза (HypoPT) имеет решающее значение для понимания того, как HypoPT влияет на гомеостаз минеральных ионов, и для проверки эффективности новых методов лечения. Здесь представлена методика создания модели крысы с приобретенным гипопаратиреозом (AHypoPT) путем паратиреоидэктомии (PTX) с использованием углеродных наночастиц.

Аннотация

Гипопаратиреоз (HypoPT) - это редкое заболевание, поражающее паращитовидные железы, которое характеризуется снижением секреции или активности паратиреоидного гормона (ПТГ), что приводит к высокому уровню фосфора в сыворотке и низкому уровню кальция в сыворотке. ГипоПТ чаще всего возникает в результате случайного повреждения желез или их удаления во время операций на щитовидной железе или других передних операциях на шее. Хирургия паращитовидных желез / щитовидной железы стала более распространенной в последние годы, с соответствующим увеличением частоты возникновения HypoPT в качестве послеоперационного осложнения. Существует острая необходимость в животной модели HypoPT, чтобы лучше понять механизмы, лежащие в основе воздействия HypoPT на гомеостаз минеральных ионов, и проверить терапевтическую эффективность новых методов лечения. Здесь сообщается о методе создания приобретенного HypoPT у самцов крыс путем выполнения паратиреоидэктомии (PTX) с использованием углеродных наночастиц. Крысиная модель показывает большие перспективы по сравнению с мышиными моделями гипопаратиреоза. Важно отметить, что область связывания рецептора ПТГ человека имеет сходство последовательности на 84,2% с таковой у крысы, что выше, чем сходство с мышами на 73,7%. Кроме того, эффекты эстрогена, которые могут влиять на сигнальный путь рецептора PTH/PTHrP, не были полностью исследованы у самцов крыс. Углеродные наночастицы представляют собой лимфатические индикаторы, которые окрашивают лимфатические узлы щитовидной железы в черный цвет, не влияя на их функцию, но они не окрашивают паращитовидные железы, что облегчает их идентификацию и удаление. В этом исследовании уровни ПТГ в сыворотке крови не определялись после PTX, и это приводило к значительной гипокальциемии и гиперфосфатемии. Таким образом, клиническое состояние послеоперационного ГипоПТ может быть замечательно представлено на крысиной модели. Таким образом, PTX с помощью углеродных наночастиц может служить чрезвычайно эффективной и легко реализуемой моделью для изучения патогенеза, лечения и прогноза HypoPT.

Введение

Паратиреоидный гормон (ПТГ) секретируется паращитовидными железами. Он является основным модулятором кальциевого баланса, поддерживает фосфатный обмен и участвует в обновлении костной ткани 1,2. Гипопаратиреоз (HypoPT) проявляется снижением секреции или функциональной потерей ПТГ. Это редкое эндокринное заболевание с распространенностью примерно 9-37 на 100 000 человеко-лет 3,4,5. ГипоПТ характеризуется снижением уровня ПТГ и кальция в сыворотке, сопровождающимся повышением уровня фосфора в сывороткекрови 6,7. ГипоПТ классифицируется в зависимости от его причины: приобретенный гипопаратиреоз (AHypoPT) или идиопатический гипопаратиреоз (IHypoPT)8. AHypoPT чаще встречается в клинической практике; около 75% случаев AHypoPT вызваны резекцией или случайным повреждением паращитовидных желез во время операции на щитовидной железе или других операций на голове и шее. Другие причины включают лучевую терапию и химиотерапию опухолей головы и шеи и лекарственную токсичность 1,8. Совершенствование методов диагностики и расширение скрининга на заболевания щитовидной железы привели к увеличению количества хирургических операций на щитовидной железе. Это привело к соответствующему увеличению соответствующих осложнений со стороны паращитовидных желез 9,10.

Для лучшего исследования AHypoPT и проверки терапевтической эффективности новых методов лечения необходимы легко устанавливаемые модели животных со стабильными характеристиками. Паратиреоидэктомия (PTX), выполненная на крысах и мышах, была зарегистрирована в предыдущих исследованиях 6,11; Однако из-за чрезвычайно малых размеров паращитовидных желез и вариабельности их анатомического распределения вероятность успеха на практике относительно низкая. Таким образом, тиреопаратиреоидэктомия (TPTX) (т.е. полное удаление щитовидной и паращитовидных желез) обычно выполняется для обеспечения резекции паращитовидных желез12. Однако результирующий низкий уровень тироксина может осложнить исследования с этой животной моделью13. Модели HypoPT, созданные другими методами, такими как лекарственная стимуляция и редактирование генов, не могут должным образом представлять наиболее распространенный патогенез AHypoPT. Наша группа ранее использовала нокаутные мышиные модели для маркировки паращитовидных желез и позволяет удалять паращитовидные железы без повреждения щитовидной железы и окружающих анатомических структур14,15. Однако в этом методе используются модели трансгенных мышей, которые требуют более длительного времени развития из-за требований к спариванию и размножению.

Поэтому мы стремились создать легко генерируемую модель AHypoPT. В этом исследовании описывается модель крысы для PTX с использованием маркировки углеродными наночастицами. Суспензия углеродных наночастиц 50 мг/мл, которая обычно используется в хирургии щитовидной железы, равномерно распределяется в щитовидной железе после местной инъекции16. Щитовидная железа становится черной, но паращитовидные железы остаются неокрашенными17, что четко отличает паращитовидные железы от щитовидных желез и позволяет выполнять PTX, не затрагивая щитовидные железы. Этот способ подходит для крыс разного возраста. Инъекция суспензии углеродных наночастиц безопасна и оказывает незначительное влияние на функцию щитовидной железы18. Модель крыс PTX, меченная углеродными наночастицами, созданная в этом исследовании, показала значительные фенотипы гипокальциемии и гиперфосфатемии в течение 4-недельного периода наблюдения. Таким образом, эта модель AHypoPT проста в установлении и имеет воспроизводимый фенотип.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Это исследование было одобрено Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Государственной ключевой лаборатории заболеваний полости рта Сычуаньского университета. Перед экспериментом было получено разрешение от соответствующих местных агентств. Для настоящего исследования использовали восемь 8-10-недельных крыс-самцов Sprague-Dawley (SD) со средним весом 200-250 г. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). Пища и вода обеспечивались ad libitum на протяжении всего экспериментального периода.

1. Предоперационная подготовка к получению крыс PTX с помощью углеродных наночастиц

  1. Анестезируют 8-10-недельных крыс, используя ингаляцию изофлурана 2,0%-2,5% с последующей внутрибрюшинной (в/) инъекцией трибромэтанола в дозе 10 мл/кг массы тела. Гарантируйте достаточную глубину анестезии, проверив отсутствие зрачкового светового рефлекса. Используйте ветеринарную мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крысы в возрасте 8-10 недель признаются взрослыми крысами. Однако этот метод моделирования можно использовать на крысах в возрасте 7 дней.
  2. Подготовьте анестезированных крыс SD к операции, сбрив шерсть вентральной области шеи в положении лежа на спине. Продезинфицируйте операционную зону с помощью ватных тампона повидон-йода (см. Таблицу материалов).
  3. Накройте животное хирургическими простынями (см. Таблицу материалов) и обнаживите хирургическую область, чтобы свести к минимуму микробное загрязнение.

2. Паратиреоидэктомия (PTX)

  1. Начните с середины между двумя ушами и сделайте разрез длиной 2 см в продольном направлении к хвосту с помощью хирургического скальпеля. Рассеките фасцию и жировой слой последовательно острыми, изогнутыми, зазубренными щипцами.
  2. Отделите паратрахеальные мышцы и обнажьте трахею с помощью относительно тупых щипцов под стереомикроскопом с 4-5-кратным увеличением.
  3. Найдите левую и правую доли щитовидной железы в форме бабочки сбоку от трахеи.
  4. Введите 1 мкл суспензии углеродных наночастиц (см. Таблицу материалов) под мембрану щитовидной железы с помощью шприца 10 мкл со скошенной иглой 30 г. Через 5 минут оросите операционную область физиологическим раствором, чтобы удалить лишнюю суспензию углеродных наночастиц, покрывающую мембрану щитовидной железы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемой точкой инъекции является мезиальная часть доли щитовидной железы, которая имеет меньше кровеносных сосудов. Суспензия углеродных наночастиц обычно используется в хирургии щитовидной железы из-за ее способности обнаруживать лимфатические узлы. Окрашивание щитовидной железы и оставление паращитовидных желез неокрашенными облегчает идентификацию последних.
  5. Убедитесь, что щитовидная железа почернела, в то время как паращитовидные железы остаются неокрашенными в течение ~ 5 минут. Наблюдайте за выделенными паращитовидными железами при обычном освещении, используя свет стереомикроскопа или настольной лампы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, грызуны имеют две каплевидные паращитовидные железы, расположенные на левой и правой поверхностях щитовидной железы. Иногда дополнительные паращитовидные железы могут быть расположены дальше.
  6. Точно разрежьте неокрашенные паращитовидные железы микрохирургическими щипцами и ножницами. Используйте стерильные ватные тампоны для гемостаза или желатиновую губку, если кровотечение.
  7. Закройте мышцы, жировые слои и кожу, слой за слоем, прерывистым горизонтальным швом матраса с использованием швов полиглактина 910 6-0 (см. Таблицу материалов).
  8. Для фиктивной группы выполните все этапы предоперационной подготовки и PTX, кроме шага 2.6. Обезболивают крыс и отделяют ткани над трахеей. Найдите паращитовидные железы, но не удаляйте их. Проводят послеоперационное восстановление и наблюдение совместно с крысами группы ПТХ.

3. Послеоперационное восстановление и наблюдение

  1. После операции поместите крыс на термостатическое электрическое одеяло (37 ° C), чтобы поддерживать температуру их тела. Вводят бупренорфина гидрохлорид 0,01 мг/кг подкожно (/к) каждые 12 ч в качестве послеоперационной анальгезии. Переведите крыс в стерильную клетку, когда они начнут двигаться и пытаться ползать.
  2. Внимательно наблюдать за крысами после операции в течение 2 ч. Верните крыс в комнату для выращивания, регулярно наблюдайте за ними и записывайте их состояние.
  3. Возьмите 10 мкл крови из хвостовой вены через 7 дней после операции. Измерьте сыворотку Ca2+, сыворотку Pi и сывороточный ПТГ с помощью соответствующих коммерческих наборов (см. Таблицу материалов). Успешная паратиреоидэктомия приводит к снижению сывороточного ионизированного Ca2+ уровня 2 SD ниже, чем у фиктивных крыс (9,00 ммоль / л, n = 16).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для статистического анализа использовалось программное обеспечение для статистики и построения графиков (см. Таблицу материалов). t-критерий Стьюдента использовался для сравнения параметров сыворотки и мочи между фиктивной и PTX-группами. p < 0,05 считался статистически значимым. Сыворотку и моче Ca2+ и Pi, а также мочевину и креатинин сыворотки измеряли с помощью коммерческих наборов в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). Сывороточный С-телопептид коллагена I типа и остеокальцина измеряли с помощью коммерчески доступных наборов ИФА (см. Таблицу материалов).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Расположение и количество паращитовидных желез первоначально наблюдались у крыс под микроскопом вскрытия. До инъекции углеродных наночастиц щитовидная железа была полупрозрачного красного цвета, а паращитовидные железы были едва различимы под микроскопом (рис. 1А). После инъекции наночастиц щитовидная железа окрашивалась в черный цвет, в то время как паращитовидные железы оставались неокрашенными (рис. 1B). Тщательное вскрытие светлых паращитовидных желез остави...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Эпидемиологические отчеты свидетельствуют о том, что выявление заболеваний щитовидной железы значительно возросло, а количество проведенных операций соответственно увеличилось на19,20. Частота послеоперационного гипопаратиреоза составляет примерно 7,6%8,21, в то время как повышенная заболеваемость приобретенным гипопаратиреозом привела к тому, что это редкое заболевание привлекло больше внимания исследователей....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом NSFC 81800928, финансированием исследований Западно-Китайской школы/больницы стоматологии Сычуаньского университета (No RCDWJS2021-1) и грантом открытого финансирования Государственной ключевой лаборатории заболеваний полости рта SKLOD-R013.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,9% раствор хлорида натрияKelun Co. Сычуань, Китай
10 &микро; L 30G NanoFil ШприцWPI
6-0 полиглактин 910 шовный материал с иглойEthicon, IncJ510G
Calcium LiquiColor testEKF0155-225Для анализа Ca2+
Углеродные наночастицы Суспензия Инъекция Lummy, Чунцин, КитайH200732461 мл : 50 мг
Креатинин (Cr) Набор для анализа (саркозиноксидаза)Jiancheng, Nanjing, ChinaC011-2-1Для анализа креатинина
Одноразовый скальпельShinva, Китай
Dumstar Biology щипцыShinva, Китай
Микродиссекционные пружинные ножницыShinva, Китай
MicroVue Rat intact PTH ELISAImmunotopics30-2531Для измерения ПТГ в сыворотке
крови крысИглодержательShinva, Китай
Фосфор Liqui-UV тестEKF0830-125Для анализа Pi
Слойная марляWeian Co. Хэнань, Китай
Повидон-йодYongan фармацевтическая Co.Ltd. Чэнду, Китай
Prism 9.0 (программное обеспечение для статистики и построения графиков)GraphPad Software, Inc., Сан-Диего, Калифорния, США https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
Крысиный C-телопептид коллагена I типа (CTX-I) ИФА KitCUSABIO, Ухань, КитайCSB-E12776rДля анализа CTX-I
Остеокальцин крысы/костный белок Gla (OT/BGP) ИФА KitCUSABIO, Ухань, КитайCSB-E05129RДля анализа остеокальцина
Безопасные лезвия бритвы с одним лезвиемАмериканская компания по производству безопасных бритв66-0089
Sprague-Dawley Ratsот 8 до 10 недель
Хирургические простыни для разрезаLiangyou Co. Сычуань, Китай
Набор для анализа мочевиныJiancheng, Нанкин, КитайC013-2-1Для анализа мочевины

Ссылки

  1. Bilezikian, J. P., et al. Hypoparathyroidism in the adult: Epidemiology, diagnosis, pathophysiology, target-organ involvement, treatment, and challenges for future research. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (10), 2317-2337 (2011).
  2. Bilezikian, J. P. Hypoparathyroidism. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 105 (6), 1722-1736 (2020).
  3. Underbjerg, L., Sikjaer, T., Mosekilde, L., Rejnmark, L. Postsurgical hypoparathyroidism-Risk of fractures, psychiatric diseases, cancer, cataract, and infections. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (11), 2504-2510 (2014).
  4. Underbjerg, L., Sikjaer, T., Mosekilde, L., Rejnmark, L. The epidemiology of nonsurgical hypoparathyroidism in Denmark: A nationwide case finding study. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (9), 1738-1744 (2015).
  5. Astor, M. C., et al. Epidemiology and health-related quality of life in hypoparathyroidism in Norway. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 101 (8), 3045-3053 (2016).
  6. Rodriguez-Ortiz, M. E., et al. Calcium deficiency reduces circulating levels of FGF23. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (7), 1190-1197 (2012).
  7. Davies, B. M., Gordon, A. H., Mussett, M. V. A plasma calcium assay for parathyroid hormone, using parathyroidectomized rats. The Journal of Physiology. 125 (2), 383-395 (1954).
  8. Clarke, B. L., et al. Epidemiology and diagnosis of hypoparathyroidism. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 101 (6), 2284-2299 (2016).
  9. Liu, Y., Shan, Z. Expert consensus on diagnosis and treatment for elderly with thyroid diseases in China. Aging Medicine. 4 (2), 70-92 (2021).
  10. Sulejmanovic, M., Cickusic, A. J., Salkic, S., Bousbija, F. M. Annual incidence of thyroid disease in patients who first time visit department for thyroid diseases in Tuzla Canton. Materia Socio-Medica. 31 (2), 130-134 (2019).
  11. Liao, H. W., et al. Relationship between fibroblast growth factor 23 and biochemical and bone histomorphometric alterations in a chronic kidney disease rat model undergoing parathyroidectomy. PloS One. 10 (7), 0133278(2015).
  12. Russell, P. S., Gittes, R. F. Parathyroid transplants in rats: A comparison of their survival time with that of skin grafts. The Journal of Experimental Medicine. 109 (6), 571-588 (1959).
  13. Sakai, A., et al. Osteoclast development in immobilized bone is suppressed by parathyroidectomy in mice. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 23 (1), 8-14 (2005).
  14. Bi, R., Fan, Y., Luo, E., Yuan, Q., Mannstadt, M. Two techniques to create hypoparathyroid mice: parathyroidectomy using GFP glands and diphtheria-toxin-mediated parathyroid ablation. Journal of Visualized Experiments. (121), e55010(2017).
  15. Bi, R., et al. Diphtheria toxin- and GFP-based mouse models of acquired hypoparathyroidism and treatment with a long-acting parathyroid hormone analog. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (5), 975-984 (2016).
  16. Huang, Y., et al. Carbon nanoparticles suspension injection for photothermal therapy of xenografted human thyroid carcinoma in vivo. MedComm. 1 (2), 202-210 (2020).
  17. Zhang, R. J., Chen, Y. L., Deng, X., Yang, H. Carbon nanoparticles for thyroidectomy and central lymph node dissection for thyroid cancer. The American Surgeon. , (2022).
  18. Long, M., et al. A carbon nanoparticle lymphatic tracer protected parathyroid glands during radical thyroidectomy for papillary thyroid non-microcarcinoma. Surgical Innovation. 24 (1), 29-34 (2017).
  19. Li, Y., et al. Efficacy and safety of long-term universal salt iodization on thyroid disorders: Epidemiological evidence from 31 provinces of mainland China. Thyroid. 30 (4), 568-579 (2020).
  20. Powers, J., Joy, K., Ruscio, A., Lagast, H. Prevalence and incidence of hypoparathyroidism in the United States using a large claims database. Journal of Bone and Mineral Research. 28 (12), 2570-2576 (2013).
  21. Zihao, N., et al. Promotion of allogeneic parathyroid cell transplantation in rats with hypoparathyroidism. Gland Surgery. 10 (12), 3403-3414 (2021).
  22. Goncu, B., et al. Xenotransplantation of microencapsulated parathyroid cells as a potential treatment for autoimmune-related hypoparathyroidism. Experimental and Clinical Transplantation. , (2021).
  23. Jung, S. Y., et al. Standardization of a physiologic hypoparathyroidism animal model. PLoS One. 11 (10), 0163911(2016).
  24. Chen, W., Lv, Y., Xie, R., Xu, D., Yu, J. Application of lymphatic mapping to recognize and protect parathyroid in thyroid carcinoma surgery by using carbon nanoparticles. Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 28 (24), 1918-1920 (1924).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Генерация крыс с гипопаратиреоидами с помощью паратиреоидэктомии с помощью углеродных наночастиц
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.