Настоящий протокол описывает высокочастотное ультразвуковое исследование для визуализации всей щитовидной железы мыши и мониторинга роста анапластической карциномы щитовидной железы.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Ультразвуковое исследование высокого разрешения для анализа ортотопических опухолей АТХ на генно-инженерной мышиной модели
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Анапластическая карцинома щитовидной железы (АТХ) связана с плохим прогнозом и коротким средним временем выживания, но никакое эффективное лечение не улучшает результаты значительно. Генетически модифицированные мышиные модели, которые имитируют прогрессирование ATC, могут помочь исследователям изучить методы лечения этого заболевания. Скрещивание трех разных генотипов мышей: TPO-cre/ERT2; БрафCA/вес; Разработана трансгенная модель АТХ Trp53 Δex2-10/Δex2-10. Мышиная модель ATC была индуцирована внутрибрюшинной инъекцией тамоксифена с гиперэкспрессией BrafV600E и делецией Trp53, и опухоли генерировались в течение примерно 1 месяца. Ультразвук высокого разрешения применялся для исследования инициации и прогрессирования опухоли, а динамическая кривая роста была получена путем измерения размеров опухоли. По сравнению с магнитно-резонансной томографией (МРТ) и компьютерной томографией, ультразвук имеет преимущества в наблюдении за мышиной моделью ATC, например, является неинвазивным, портативным, в режиме реального времени и без радиационного облучения. Ультразвук высокого разрешения подходит для динамических и множественных измерений. Однако ультразвуковое исследование щитовидной железы у мышей требует соответствующих анатомических знаний и опыта. В этой статье представлена подробная процедура использования ультразвука высокого разрешения для сканирования опухолей в трансгенной модели ATC. Между тем, перечислены ультразвуковая регулировка параметров, навыки ультразвукового сканирования, анестезия и восстановление животных, а также другие элементы, требующие внимания во время процесса.
Введение
Хотя анапластическая карцинома щитовидной железы (АТХ) составляет менее 2% случаев рака щитовидной железы, она ежегодно вызывает более 50% смертей, связанных с раком щитовидной железы. Среднее время выживания после постановки диагноза с помощью АТХ составляет всего около 6 месяцев, и нет доступных методов лечения, которые значительно улучшают выживаемость 1,2.
Редкость УВД препятствует исследованиям, изучающим, как болезнь начинается и агрессивно прогрессирует. Недавно стали доступны генетически модифицированные модели мышей, имитирующие болезнь, которые дают представление о болезни и ее реакции на возможные методы лечения 3,4,5. Такие исследования требуют точной визуализации опухоли для измерений и мониторинга, которая обычно выполняется с использованием магнитно-резонансной томографии, компьютерной томографии или ультразвукового исследования высокого разрешения 6,7. Ультразвуковое исследование широко используется в органах мыши. Он имеет преимущества перед магнитно-резонансной томографией и компьютерной томографией, поскольку его можно выполнять в режиме реального времени и он не подвергает испытуемого облучению, а необходимое оборудование достаточно мало, чтобы быть портативным 8,9. Однако исследования по постоянному мониторингу роста УВД с помощью ультразвука встречаются редко; Таким образом, в этой работе исследуется полезность ультразвука в этом контексте.
Здесь представлен протокол использования ультразвука высокого разрешения для точного сканирования, мониторинга и измерения опухолей в мышиной модели ATC.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Настоящее исследование было проведено с одобрения Комитета по уходу за животными и их использованию Сычуаньского университета. ТПО-кре/ЭРТ2; БрафCA/вес; В этом исследовании использовались трансгенные мыши Trp53 Δex2-10/Δex2-10 10 (см. Таблицу материалов). При необходимости шаги протокола могут быть изменены для разных видов животных. Здесь использовались двенадцать мышей, в том числе шесть самок и шесть самцов, средний возраст которых составлял 93 дня.
1. Экспериментальная подготовка
- Включите систему УЗИ (см. Таблицу материалов) и создайте новую папку для захвата изображений и сбора данных. Выберите линейный датчик 40 МГц и нажмите на шаблон поверхностной ткани, чтобы активировать датчик поверхностной ткани . Используйте «B-режим» для визуализации щитовидной железы (рис. 1A).
ПРИМЕЧАНИЕ: B-режим является основным режимом ультразвуковой визуализации. Внешний вид ультразвуковых изображений зависит от физического взаимодействия звука с тканями тела. Изображения B-режима получаются в виде серых изображений11,12. - Держите мышей в специальных клетках со свободным доступом к пище и воде. Поместите клетку на дополнительное нагревательное устройство (см. Таблицу материалов), чтобы обеспечить терморегуляцию.
- Обеспечьте достаточное количество изофлурана в испарителе и O2 в баке. Если запасы недостаточны, обменяйте танки на новые.
- Очистите платформу для визуализации животных стерильным физиологическим раствором и включите кнопку нагрева. Перед тем, как поместить животное на платформу, убедитесь, что температура составляет 38-40 °C (рис. 1C).
2. Подготовка животных к визуализации
- Включите испаритель изофлурана. Перенесите мышь из клетки в анестезиологическую коробку.
- Обезболивают животное, используя смесь 1%-2% изофлурана из испарителя и кислорода, протекающего со скоростью 0,8 л/мин.
- Нанесите крем для депиляции от груди к шее, подождите 30 секунд, а затем полностью сотрите крем и мех. Тщательно промойте область и окружающий мех теплым стерильным физиологическим раствором.
- Поместите обезболиваемое животное на подогреваемую платформу. Прикройте морду носовым конусом, соединенным с выходным отверстием для анестезии (рис. 2A, B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь должна быть полностью успокоена в течение 1-2 минут. Если животное все еще активно, выполняйте длительную индукцию изофлурана до тех пор, пока животное не перестанет проявлять рефлекс отмены педали. Следите за тем, чтобы животное дышало ровно. - Во время визуализации контролируйте частоту сердечных сокращений мыши через подогреваемую платформу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Система ультразвуковой визуализации оснащена монитором сердечного ритма. - С помощью скотча прикрепите конечности мыши к подогреваемой платформе, при этом животное находится в положении лежа на спине. Убедитесь, что носовой конус стабильно расположен с постоянным потоком анестезирующего газа (1,5 л/мин).
- Защитите глаза, применив офтальмологическую мазь.
3. Визуализация опухолей
- Отрегулируйте систему обработки изображений, чтобы оптимизировать разрешение. Настройте следующие параметры: двумерный коэффициент усиления, 25-30 дБ; глубина изображения, 10 мм; количество фокальных зон – 3; и центральный, 3-6 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования использовался зонд с частотой 40 МГц. Для сбора данных был указан B-режим. - Обильно нанесите ультразвуковой гель (см. Таблицу материалов) на участок обнаженной кожи.
- Держите зонд и поместите его в контакт с ультразвуковым гелем на грудной клетке, а затем выполните сканирование от грудной клетки к шее, чтобы найти щитовидную железу (рис. 2C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно надавливайте во время сканирования; Чрезмерное давление на шею животного может вызвать удушье или апноэ. Этот протокол был разработан на основе ручного сканирования, но механизированное сканирование также может быть выполнено с использованием машины для управления зондом, такой как платформа визуализации животных, которая движется по осям x и y. - Сканирование вверх и вниз, чтобы определить границы опухоли и оценить ее размер и форму.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здоровая щитовидная железа обычно выглядит как гипоэхогенная, однородная структура перед трахеей. Анапластические опухоли приводят к тому, что щитовидная железа кажется намного больше, что можно легко определить при сканировании шеи (рис. 3). - Идентифицируют опухоли ATC из трахеи и ремешковых мышц в зависимости от анатомического расположения и ультразвукового эха.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышцы ремешка расположены перед щитовидной железой и трахеей, а также за щитовидной железой. Ультразвуковое эхо ремешковых мышц кажется выше, чем у ATC, в то время как затухание существует за трахеей13.- Основываясь на оттиске общей опухоли, подтвердите срез изображения с наибольшим диаметром опухоли слева направо. Нажмите кнопку замораживания и измерьте переднезадний диаметр опухоли и диаметр опухоли слева направо с помощью ультразвукового штангенциркуля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Переднезадний диаметр должен измеряться перпендикулярно диаметру опухоли слева направо (рис. 4). Размер опухоли ATC рассчитывали путем умножения переднезаднего диаметра опухоли на диаметр опухоли слева направо14. Поскольку размер опухолей на левой и правой сторонах был непостоянным, каждая сторона опухолей была рассчитана отдельно. Общий размер опухолей был получен путем сложения двусторонних опухолей. Размеры были записаны для наблюдения за кривой роста УВД.
- Основываясь на оттиске общей опухоли, подтвердите срез изображения с наибольшим диаметром опухоли слева направо. Нажмите кнопку замораживания и измерьте переднезадний диаметр опухоли и диаметр опухоли слева направо с помощью ультразвукового штангенциркуля.
- Сохраните запись в виде киноцикла, что облегчит просмотр выбранных изображений.
4. Восстановление животных
- После сканирования протрите ультразвуковой гель и снимите удерживающую ленту с конечностей животного.
- Поместите мышь на дополнительное нагревательное устройство (этап 1.2). Уложите животное на бок (рис. 2D).
- После того, как мышь придет в себя (~5 мин), перенесите ее обратно в клетку.
- Очистите систему УЗИ, зонд и платформу мягкой тканью и салфетками с изопропиловым спиртом или глутаровым альдегидом.
- Выключите систему визуализации.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Средний размер правого АТС в начале исследования составлял 4,867 мм2, а средний размер левого АТХ составлял 5,189мм2. При четвертом измерении средний размер правого АТХ вырос до 11,844 мм2, в то время как размер опухоли левой доли вырос до 9,280мм2. Общий размер УВД увеличился с 10.057 мм2 до 15.843мм2. На более позднем этапе исследования УВД быстро рос. Что касается мыши, помеченной как «P92» (таблица 1), размер опухоли при четвертом изме...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол использует ультразвуковое исследование высокого разрешения для анализа ортотопических опухолей ATC в генно-инженерной мышиной модели. Трансгенная модель с генотипом TPO-cre/ERT2; БрафCA/вес; Trp53 Δex2-10/Δex2-10 был разработан в нашей лаборатории. Животные чрезмерно экспрессируют BrafV600E и не имеют Trp53; Внутрибрюшинное введение животным тамоксифена приводит к росту опухоли примерно через 1 месяц10. Опухоли быстро растут и достиг...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.
Благодарности
Это исследование не получило специального гранта от государственных, коммерческих или некоммерческих финансирующих агентств.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Клейкая лента | Winner | ||
| Анестезиологическая система | RWDlifescience | ||
| Brafflox/wt | Сотрудничество с Институтом наук о жизни, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Чэнду, Китай | ||
| Камера для индукции анестезии | RWDlifescience | ||
| Ватные палочки | Winner | ||
| Крем для депиляции | Veet | ||
| Электрическое одеяло с подогревом | Испаритель Petbee | ||
| Изофлуран | RWDlifescience | ||
| Медицинские перчатки | Winner | ||
| Бумажные полотенца | Breeze | B914JY | |
| TPO-cre/ERT2 мыши | Сотрудничество с Институтом наук о жизни, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Чэнду, Китай | ||
| Trp53flox/wt mice | Сотрудничество с Институтом наук о жизни, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Чэнду, Китай | ||
| Ультразвуковой гель | Keppler | KL-250 | |
| Ультразвуковой аппарат | VisualSonics | Vevo 3100 |
Ссылки
- Maniakas, A., et al. Evaluation of overall survival in patients with anaplastic thyroid carcinoma, 2000-2019. JAMA Oncology. 6 (9), 1397-1404 (2020).
- Molinaro, E., et al. Anaplastic thyroid carcinoma: From clinicopathology to genetics and advanced therapies. Nature Reviews Endocrinology. 13 (11), 644-660 (2017).
- Champa, D., Di Cristofano, A. Modeling anaplastic thyroid carcinoma in the mouse. Hormones and Cancer. 6 (1), 37-44 (2015).
- Vitiello, M., Kusmic, C., Faita, F., Poliseno, L. Analysis of lymph node volume by ultra-high-frequency ultrasound imaging in the Braf/Pten genetically engineered mouse model of melanoma. Journal of Visualized Experiments. (175), e62527(2021).
- Wang, Y., et al. Low intensity focused ultrasound (LIFU) triggered drug release from cetuximab-conjugated phase-changeable nanoparticles for precision theranostics against anaplastic thyroid carcinoma. Biomaterials Science. 27 (1), 196-210 (2018).
- Mohammed, A., et al. Early detection and prevention of pancreatic cancer: Use of genetically engineered mouse models and advanced imaging technologies. Current Medicinal Chemistry. 19 (22), 3701-3713 (2012).
- Wege, A. K., et al. High resolution ultrasound including elastography and contrast-enhanced ultrasound (CEUS) for early detection and characterization of liver lesions in the humanized tumor mouse model. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 52 (2-4), 93-106 (2012).
- Greco, A., et al. Preclinical imaging for the study of mouse models of thyroid cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), 2731(2017).
- Renault, G., et al. High-resolution ultrasound imaging of the mouse. Journal of Radiologie. 87, 1937-1945 (2006).
- McFadden, D. G., et al. p53 constrains progression to anaplastic thyroid carcinoma in a Braf-mutant mouse model of papillary thyroid cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (16), 1600-1609 (2014).
- Garassini, M. Basic principles of ultrasonic diagnosis. GEN. 39 (4), 283-289 (1985).
- Aldrich, J. E. Basic physics of ultrasound imaging. Critical Care Medicine. 35, 131-137 (2007).
- Mancini, M., et al. Morphological ultrasound microimaging of thyroid in living mice. Endocrinology. 150 (10), 4810-4815 (2009).
- Ying, M., Yung, D. M., Ho, K. K. Two-dimensional ultrasound measurement of thyroid gland volume: a new equation with higher correlation with 3-D ultrasound measurement. Ultrasound in Medicine & Biology. 34 (1), 56-63 (2008).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
