Одним из основных факторов клеточного фенотипа у эукариот является экспрессия генов. Контроль экспрессии генов имеет важное значение и опирается на множество белков и РНК, от транскрипции до процессов трансляции1. Изменения на этих этапах могут спровоцировать несколько различных заболеваний. Процессинг РНК и сплайсинг составляют важную группу реакций, ответственных за образование зрелых молекул РНК 2,3,4,5. Сплайсинг удаляет интроны и соединяет экзоны для создания зрелой молекулы РНК, способной выполнять функциональную и структурную активность. Эффективность и скорость сплайсинга сильно влияют на фенотипы, наблюдаемые в различных условиях6.
Сплайсинг осуществляется сложным макромолекулярным механизмом, называемым сплайсосомой, который состоит из пяти нРНК и более 100 белков 5,7. В дополнение к основным белковым компонентам, сплайсосомы имеют трансакционные белки, которые могут непосредственно влиять на регуляцию этого процесса 8,9. Важность сплайсинга отражается в широком спектре заболеваний, вызванных изменениями в этом процессе, включая нейродегенеративные расстройства, нервно-мышечные заболевания и несколько видов рака 3,10,11. Изучение динамики сплайсинга и сборки сплайсосом может сильно повлиять на понимание биологии этих нарушений.
Сборка сплайсосомы начинается с ассоциации U1 snRNP со специфическим участком недавно транскрибируемой пре-мРНК, 5'-сайтом сплайсинга 5,8. Эффективное спаривание и распознавание 5'-сайтов сплайсинга с помощью U1 snРНК не только определяет сайты сплайсинга, которые следует использовать, но и контролирует, какие пре-РНК будут сплайсированы первыми или более эффективно 6,12,13. Использование различных сайтов сплайсинга может привести к получению нескольких альтернативных изоформ зрелых РНК из одного и того же гена. Альтернативный сплайсинг является основным источником протеомного разнообразия, позволяя генерировать РНК и белки, необходимые во время развития или в различных клетках и тканях14,15. Альтернативные транскрипты РНК могут генерировать усеченные или нефункциональные изоформы белка, которые могут вызывать заболевания 10,16. Таким образом, белковые компоненты комплекса U1 snRNP играют важную регуляторную роль в сплайсинге1. Галектин-1 и галектин-3 (Gal1 и Gal3) являются компонентами U1 snRNP17,18. Voss et al.19 предлагают метод фракционирования ядерного экстракта для получения комплексов, обогащенных Gal3-U1 snRNP, способных спасать активность сплайсинга в клетках, обедненных U1. Этот анализ способствует пониманию механизма ассоциации Gal3 со сплайсосомами, и аналогичные подходы могут быть использованы для изучения других потенциальных регуляторных белков сплайсинга.
Связывание U1 snRNP с 5'-сайтами сплайсинга является важным медиатором точности сплайсинга20. Мутации в 5'-сайтах сплайсинга имеют решающее значение и вызывают потерю спаривания U1 snRNP, что приводит к дефектам сплайсинга2. Муковисцидоз, например, вызывается мутировавшим 5'-сайтом сплайсинга в гене CFTR21. Wong et al.22 описывают метод компенсации мутаций 5'-сайта сплайсинга комплементарными мутациями в U1 snРНК. Этот подход успешно способствует включению экзонов, генерируя зрелые РНК и приводя к спасению от дефектов сплайсинга. В дополнение к предложению возможной терапии этих заболеваний на основе РНК, этот подход может быть полезен для анализа индивидуальных регуляторных последовательностей в пре-мРНК23.
Верность ассоциации U1 snРНК сайтам сплайсинга также исследуется в модельной системе дрожжей ван дер Фельцем24. Почковающиеся дрожжи Saccharomyces cerevisiae широко использовались для изучения кинетики сплайсинга и сборки сплайсосомы25. Кинетика сплайсинга и состав сплайсосом хорошо сохраняются у эукариот, и дрожжи широко используются для мониторинга образования промежуточных комплексов во время сборки26. Репортерный анализ ACT1-CUP1 основан на экспрессии пары генов: ACT1, который содержит один интрон с оптимальными последовательностями сайтов сплайсинга, и CUP1, который экспрессирует медный хелатор, защищающий клетку от повреждений, вызванных ионом этого металла. CUP1 выражается только в том случае, если ACT1 правильно сращен, что приводит к созданию репортерной системы27. Рост клеток в условиях различных концентраций меди можно контролировать для определения эффективности сплайсинга различных последовательностей интронов или с использованием различных регуляторных белков. Ван дер Фельц24 представляет метод анализа эффектов регуляторного белка сплайсинга с использованием этой репортерной системы и анализов жизнеспособности меди. Аналогичный подход может быть использован для разработки вариаций в последовательностях интронов в сочетании с различными белками для решения проблемы успешного сплайсинга у дрожжей.
В дополнение к ассоциации snRNP, связывание белков имеет важное значение во время сборки сплайсосом1. Контроль активности сплайсосомы напрямую зависит от ее белкового состава и взаимодействий, происходящих при ее формировании. Структурные и функциональные особенности белковых компонентов имеют важное значение для активации комплекса 5,7. Carvalho et al.28 используют подход, основанный на методе Grafix, который основан на необратимом сшивании белков в анализе глицеринового градиента. В этом анализе рассматривается состав белков и переходные взаимодействия, происходящие во время сборки, которые могут иметь решающее значение для сборки активного комплекса и успеха сплайсинга. Анализ других динамических макромолекулярных комплексов с помощью этого подхода может быть очень полезным и дать представление об организации и взаимодействиях белков.
На химический состав и скорость сплайсинга также влияет динамическая ассоциацияразличных компонентов сплайсосом8. В последнее время использование ингибиторов сплайсинга на малых молекулах показало, что определенные этапы могут быть остановлены in vitro из-за сниженной скорости реакций сплайсинга. Basei et al.31 представляют метод анализа альтернативного сплайсинга на влияние регуляторного фактора сплайсинга, Nek4. Рассмотрен вопрос о распространенности изоформ транскриптов, приводящих к про- или противоопухолевым фенотипам в клетках HEK293 с использованием минигена. Неправильная регуляция сплайсинга или различное использование сайтов сплайсинга может привести к альтернативному генерированию транскриптов, вызывая различныетипы рака. Использование модуляторов или ингибиторов сплайсинга во время терапии может определить выбор места сплайсинга, тем самым определяя генерируемые альтернативные изоформы, будь то про- или противоопухолевые. В настоящее время в качестве химиотерапевтических средств используются паклитаксел и цисплатин. С помощью минигена E1A устраняются эффекты этих препаратов в альтернативном сплайсинге. Анализ альтернативного сплайсинга с использованием минигенов является важной стратегией для мониторинга эффектов трансактивных белков и изменений сплайсинга на терапию и использование конкретных препаратов.
В этой линии сообщалось, что многие интронные микроРНК (микроРНК) связаны с опухолевыми фенотипами32,33. Контроль и регуляция синтеза интронных микроРНК и биогенеза могут быть связаны с контролем реакций сплайсинга. МикроРНК могут модулировать стабильность и распространенность мРНК в клетках, влияя на стабильность РНК и скорость трансляции34 . Гатти да Силва и Колтри35 описывают репортерную систему для оценки биогенеза и созревания интронных микроРНК, которые могут быть напрямую связаны с изменениями в клеточных фенотипах и определением про- или противоопухолевых характеристик. С помощью модуляции сплайсинг-регуляторного белка HuR система позволяет анализировать биогенез и функциональную активность интронной онкогенной микроРНК.
Анализ сплайсинга пре-РНК и созревания различных РНК в конкретных клетках будет иметь важное значение для понимания и интерпретации геномной информации. Сплайсосомы дрожжей и млекопитающих сохраняются, и фундаментальные исследования могут улучшить использование различных методов, применяемых в терапии и биомедицине. Несмотря на большое количество геномных данных, доступных в настоящее время, экспрессия этой информации в фенотипах может быть клеточно-специфичной и зависеть от процессинга РНК и сплайсинга. Понимание сложной регуляции этого процесса будет иметь важное значение для будущих исследований.