Method Article

Восстановление цитоархитектии и функции эпителиальных тканей человека на органе-чипе с открытым верхом

DOI:

10.3791/64633

⸱

February 17th, 2023

 ,  ,  , 
1Merk Sharp & Dohme LLC, 2Department of Biomedical Engineering, University of Cincinnati, 3Center for Stem Cell and Organoid Medicine, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящий протокол описывает возможности и основные методы культивирования органа-чипа с открытым верхом для успешного создания и созревания полнослойных культур первичных тканей (кожи, альвеол, дыхательных путей и кишечника), что дает возможность исследовать различные функциональные аспекты интерфейса эпителия/мезенхимы и сосудистой ниши человека in vitro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Почти все органы человека выстланы эпителиальными тканями, состоящими из одного или нескольких слоев плотно связанных клеток, организованных в трехмерные (3D) структуры. Одной из основных функций эпителия является формирование барьеров, защищающих подкладные ткани от физических и химических воздействий и инфекционных агентов. Кроме того, эпителий опосредует транспортировку питательных веществ, гормонов и других сигнальных молекул, часто создавая биохимические градиенты, которые определяют позиционирование и компартментализацию клеток в органе. Благодаря своей центральной роли в определении структуры и функции органов, эпителии являются важными терапевтическими мишенями для многих заболеваний человека, которые не всегда фиксируются на животных моделях. Помимо очевидных видовых различий, проведение научных исследований барьерной функции и транспортных свойств эпителия у животных еще больше усугубляется трудностью доступа к этим тканям в живой системе. В то время как двумерные (2D) клеточные культуры человека полезны для ответа на основные научные вопросы, они часто дают плохие прогнозы in vivo . Чтобы преодолеть эти ограничения, в последнее десятилетие появилось множество микроинженерных биомиметических платформ, известных как органы на чипе, в качестве многообещающей альтернативы традиционным испытаниям in vitro и испытаниям на животных. Здесь мы описываем Open-Top Organ-Chip (или Open-Top Chip), платформу, предназначенную для моделирования органоспецифических эпителиальных тканей, включая кожу, легкие и кишечник. Этот чип предлагает новые возможности для восстановления многоклеточной архитектуры и функции эпителиальных тканей, включая возможность воссоздания 3D-стромального компонента путем включения тканеспецифических фибробластов и эндотелиальных клеток в механически активную систему. Этот чип с открытым верхом представляет собой беспрецедентный инструмент для изучения эпителиальных/мезенхимальных и сосудистых взаимодействий в различных масштабах разрешения, от отдельных клеток до многослойных тканевых конструкций, что позволяет молекулярно рассекать межклеточные перекрестные помехи эпителизированных органов в здоровье и при болезнях.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исторически сложилось так, что ученые полагались на доклинические испытания на животных для открытия лекарств, но все большее число этих методов ставится под сомнение из-за плохой корреляции с человеческим исходом1. Внедрение принципов «3R» для замены, сокращения и уточнения экспериментов на животных побуждает ученых искать новые альтернативные методы in vitro для поддержки доклинической оценки риска лекарственной и химической токсикологии2. Однако многим моделям in vitro, разработанным на сегодняшний день, не хватает биологической архитектуры, клеточной сложности и механической среды, необходимых для повторения динамической природы живых органов человека 3,4.

Обычные доклинические системы in vitro обычно используют 2D-монокультуры клеток человека, выращенных на жесткой пластиковой поверхности. Эти методы обеспечивают инструмент для проведения простых механистических исследований и позволяют быстро проводить скрининг кандидатов на лекарства. Из-за их относительно низкой стоимости и высокой надежности 2D-модели часто сочетаются с автоматическими высокопроизводительными системами и используются для быстрой идентификации потенциальных кандидатов на лекарства на ранней стадии процесса разработки лекарств 5,6. Однако такие 2D-модели не обеспечивают трансляционного подхода к моделированию на тканевом, органном или системном уровне ответов на терапевтические кандидаты, что необходимо для точного прогнозирования безопасности и эффективности лекарственных средств на доклинической стадии их разработки. Плоскоклеточные культуры не повторяют микроокружение нативной ткани, включая сложное многоклеточное взаимодействие, биомеханические свойства и трехмерную (3D) архитектуру тканей человека7. Клетки, растущие на плоской поверхности, часто не приобретают зрелого фенотипа и, следовательно, не могут реагировать на фармакологические раздражители так, как в нативной ткани. Например, первичные альвеолярные эпителиальные клетки человека, выращенные in vitro, проявляют плоскоклеточный фенотип и теряют ключевые фенотипические маркеры, включая сурфактантные белки C и B (SP-C и SP-B)8. В дополнение к недостаточной дифференцировке первичные клетки часто становятся нечувствительными к биологическим стрессорам in vitro, поскольку определенные биохимические пути, связанные с воспалением тканей, становятся нефункциональными9. Такая потеря функции клеток, по-видимому, в первую очередь связана с использованием жестких субстратов, а также с отсутствием растворимых факторов, естественным образом высвобождаемых тканеспецифическими стромальными клетками, такими как фибробласты легких и гладкомышечные клетки10,11.

Понимание того, что отсутствие химиофизической и биологической сложности ограничивает физиологическое поведение клеток in vitro, способствовало разработке более сложных многоклеточных моделей, которые, как оказалось, лучше отражают сложность тканей человека вне тела12,13. С момента создания первых моделей совместной культуры в начале 1970-х годов14 внедрение синтетических и натуральных гидрогелей значительно улучшило способность имитировать микроокружение нативных тканей и стало бесценным инструментом для стимулирования клеточной дифференцировки, направления самоорганизации клеток в тканеподобные структуры и восстановления функций нативных тканей15,16. Например, при выращивании в соответствующем 3D-каркасе клетки человека могут самостоятельно организовываться в функциональные структуры, такие как сфероиды или органоиды, экспрессирующие маркеры стволовых клеток, и способны к самообновлению17. Напротив, клетки человека (включая стволовые клетки) при выращивании на традиционных 2D-субстратах быстро стареют и стареют после нескольких пассажей18. Кроме того, гидрогели могут быть «адаптированы» в соответствии с конкретными свойствами ткани, такими как пористость, размер пор, толщина волокна, вязкоупругость, топография и жесткость, или дополнительно сконструированы с использованием клеточных компонентов тканевого происхождения и/или биологически активных молекул, позволяющих имитировать физиологические или патологические состояния19,20. Несмотря на огромный потенциал для тестирования лекарств, 3D-модели на основе гидрогеля, используемые в фармацевтических исследованиях, не полностью повторяют сложную цитоархитектографию тканей in vivo и не имеют важных гемодинамических и механических стимулов, обычно присутствующих в организме человека, включая гидростатическое давление, циклическое растяжение и сдвиг жидкости21.

Микрофизиологические системы (МПС), такие как органы-на-чипах (OOC), недавно появились как инструменты, способные улавливать сложные физиологические реакции in vitro22,23. В этих моделях часто используются микрофлюидные платформы, которые позволяют моделировать динамическое микроокружение живых органов.

Мы объединили принципы 3D-биоинженерии тканей и механобиологии для создания модели сложной эпителиальной ткани человека с открытым верхом. Это позволило нам точно повторить многоклеточное и динамическое микроокружение эпителиальных тканей. Это включает в себя тканеспецифические биохимические и биомеханические сигналы, естественным образом присутствующие в живых органах, но часто игнорируемые традиционными моделями in vitro 24. Чип с открытым верхом включает в себя два отсека: сосудистый отсек (рис. 1А) и стромальный компартмент (рис. 1В), разделенные пористой мембраной, обеспечивающей диффузию питательных веществ между двумя камерами (рис. 1С). Сосудистый компартмент подвергается непрерывному потоку жидкости для повторения физиологического напряжения сдвига, в то время как растяжимая конструкция стромальной камеры позволяет моделировать механическое напряжение, связанное с дыхательными движениями или перистальтикой кишечника. В стромальном отсеке находится настраиваемый 3D-гидрогелевый каркас, предназначенный для поддержки физиологического роста тканеспецифических фибробластов. Он обладает съемной крышкой, которая облегчает установление границы раздела воздух-жидкость, что позволяет лучше имитировать физиологию тканей слизистой оболочки человека, а также прямой доступ к ткани для введения лекарств непосредственно на эпителиальный слой. На дополнительном рисунке 1 показаны некоторые ключевые компоненты конструкции микросхемы с открытым верхом, включая размеры и биологические отсеки (дополнительный рисунок 1A-D), а также основные технические этапы, описанные в этом протоколе (дополнительный рисунок 1E).

Перфузия чипа с открытым верхом достигается с помощью программируемого перистальтического насоса (рис. 1D). Перистальтический насос позволяет одновременно перфузировать 12 стружек с открытым верхом. Большинство инкубаторов могут содержать две установки, позволяющие выращивать до 24 чипов на инкубатор. Механическое растяжение достигается с помощью специально разработанного программируемого регулятора давления вакуума (рис. 1E). Он состоит из электропневматического регулятора вакуума, управляемого электронным способом цифро-аналоговым преобразователем. Другими словами, электропневматический регулятор вакуума генерирует синусоидальный вакуумный профиль с амплитудой и частотой, которые определяются пользователем. Циклическая деформация в диапазоне от 0% до 15% создается путем приложения отрицательного давления к вакуумному каналу микросхемы с открытым верхом с амплитудой от 0 до -90 кПа и частотой 0,2 Гц. Это специально разработанная система, эквивалентная коммерчески доступному блоку деформации Flexcell, ранее принятому и описанному в других документах25. Чтобы имитировать механическую деформацию ткани, связанную, например, с дыхательным движением легкого или перистальтикой кишечника, пневматический привод применяет синусоидальные волны вакуума/деформации, величина и амплитуда которых могут быть отрегулированы в соответствии с физиологическим уровнем напряжения и частотой, которые клетки человека испытывают в своих родных тканях.

Здесь мы описываем эффективный и воспроизводимый метод разработки и культивирования органотипических эквивалентов эпителия на прототипе платформы Open-Top Chip. Он позволяет создавать сложные модели органов, таких как кожа, альвеолы, дыхательные пути и толстая кишка, интегрируя поток сосудистой жидкости и механическое растяжение. Мы обозначим ключевые технические аспекты, которые необходимо учитывать при реализации принципов тканевой инженерии для создания сложных эпителиальных моделей. Мы обсудим преимущества и возможные ограничения текущей конструкции.

Обзор основных этапов, используемых для достижения созревания тканей и органов, включая параметры потока и растяжения, представлен в: Рисунок 2 для кожи, Рисунок 3 для альвеолы, Рисунок 4 для дыхательных путей и Рисунок 5 для кишечника. Дополнительная информация о составе среды и реагентах, используемых для культивирования различных моделей органов, включена в дополнительные таблицы (Дополнительная таблица 1 для кожи; Дополнительная таблица 2 для альвеол; Дополнительная таблица 3 для дыхательных путей и дополнительная таблица 4 для кишечника).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Колоноиды человека были получены из резекций кишечника в соответствии с рекомендациями Институционального комитета по биобезопасности детской больницы Цинциннати (IBC 2017-2011).

1. Поверхностная активация

  1. Подготовка буфера активации
    1. Поместите сшивающий агент и буферные реагенты на основе растворителя под шкаф биобезопасности (BSC) и дайте им уравновеситься при комнатной температуре (RT) в течение 10 минут перед использованием.
    2. Восстановите 5 мг сшивающего агента в 5 мл буфера растворителя, используя стерильный светонепроницаемый контейнер или прозрачную коническую трубку объемом 15 мл, обернутую алюминиевой фольгой, для защиты раствора сшивающего агента от воздействия прямого света.
    3. Встряхните раствор в течение 1 мин, чтобы удалить все комки, а затем пипеткой наберите 50 мкл раствора сшивающего агента непосредственно в нижний канал чипа и 150 мкл в камеру с открытым верхом.
    4. Удалите излишки сшивающего раствора с поверхности стружки с помощью аспиратора. Затем пипеткой вводят дополнительные 50 мкл сшивающего раствора непосредственно в нижний канал чипа и 150 мкл в камеру с открытым верхом, чтобы удалить оставшиеся пузырьки воздуха.
  2. Активация с помощью УФ-сшивающей машины
    1. Аккуратно снимите крышку с чипа под BSC и храните его в стерильном контейнере.
    2. Перенесите стружку, содержащую раствор сшивающего агента, в чашку Петри, закройте чашку Петри, чтобы избежать загрязнения, и поместите чашку с чипсами под машину для УФ-сшивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Снимите крышку чашки Петри, чтобы максимизировать воздействие ультрафиолета.
    3. Установите УФ-сшивающий аппарат с пиковой длиной волны 365 нм на интенсивность 100 мкДж/см2 и включите ультрафиолетовый свет на 20 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После 20 минут УФ-обработки раствор сшивающего агента будет выглядеть темнее (коричневым).
    4. Верните стружку под BSC и аспирируйте окисленный раствор сшивающего агента. Затем трижды промойте всю стружку буфером растворителя и дайте стружке высохнуть под BSC в течение 5-10 минут, чтобы завершить химическую функционализацию поверхности полидиметилсилоксана (PDMS).

2. Подготовка эквивалента стромы

  1. Приготовление 10-кратного реконструкционного буфера (100 мл)
    1. Растворите 2,2 г бикарбоната натрия в 75 мл 0,067 М NaOH в двойной дистиллированной воде.
    2. Добавьте 4,76 г HEPES и доведите объем до 100 мл с помощью двойной дистиллированной воды.
    3. Стерильную фильтрацию раствора под БСК используют одноразовый стерильный флакон-фильтр с мембраной 0,22 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор стабилен в течение примерно 6 месяцев при хранении при 4 °C.
  2. Оценка объема прегелевого раствора
    1. Умножьте количество чипов, необходимых для эксперимента, на 150 мкл (внутренний объем центральной камеры с открытым верхом), чтобы оценить количество предварительного раствора геля, необходимого для эксперимента:
      Необходимый объем = (количество чипов x 150) мкл
    2. Приготовьте раствор коллагена на льду, смешав: 1 объем 10x EMEM, содержащий выбранные клетки, 1 объем 10x буфера реконструкции (см. шаг 2.1), 8 объемов раствора коллагена I (10 мг / мл) и 1 мкл 1 N раствора NaOH на каждый мг коллагена I.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется подготовить дополнительный объем +15% для учета экспериментальных ошибок; Пример, описанный в разделе 2.2, предоставляет подробную пошаговую процедуру приготовления достаточного количества предварительного раствора геля для 12 чипсов и дополнительных 15% объема.
  3. Приготовление предварительного раствора геля для стромного эквивалента (на 12 чипов)
    1. Подвести под BSC на льду следующие решения: 10x EMEM; 10-кратный буфер реконструкции (см. шаг 2.1); Раствор коллагена I (10 мг/мл); и стерильный раствор NaOH 1 Н.
    2. Культивируйте тканеспецифические мезенхимальные клетки по указанию поставщиков до тех пор, пока 80-90% не слились воедино, а затем диссоциируют клетки с помощью трипсина или других методов в соответствии с рекомендациями поставщика клеток. Соберите клетки в гранулы центрифугированием при 250 x g в течение 5 мин при 24 °C.
    3. Ресуспендируют гранулу ячейки в 225 мкл ледяного 10x EMEM и добавляют 225 мкл ледяного 10-кратного буфера реконструкции (см. шаг 2.1). Смешайте раствор, аккуратно пипетируя вверх и вниз, а затем добавьте 1,800 мкл ледяного раствора коллагена I.
    4. Пипеткой вверх и вниз 5-6 раз, избегая пузырьков, чтобы перемешать предварительно гель-раствор на льду.
  4. Включение эквивалента стромы в чип (для 12 чипов)
    1. Нейтрализуйте раствор предварительного геля 18 мкл 1 N NaOH. Аккуратно перемешайте, пипеткой вверх и вниз 5-6 раз, а затем введите пипеткой 150 мкл насыщенного клетками гидрогеля в центральную камеру чипа с открытым верхом, избегая пузырьков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется микропаттернирование, перейдите к следующему шагу (раздел 3).
    2. Сгруппируйте чипы в отдельные чашки Петри, включая крышку центрифужной пробирки, заполненную 2 мл стерильного ddH2 O в каждой чашке Петри, и инкубируйте чашки Петри в инкубаторе при 37 ° C, 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Через 90 минут нагруженный клетками гидрогель полностью полимеризуется.

3. Микроструктурирование поверхности (опционально)

  1. Выполните поверхностное микроструктурирование стромального гидрогеля после пипетки нейтрализованного коллагенового гидрогеля (все еще в жидком состоянии) с использованием штампов, напечатанных на 3D-принтере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Марки, напечатанные на 3D-принтере, могут быть получены в различных настраиваемых дизайнах, как описано ранее в другом месте24.
  2. Пипетку 20 мкл нейтрализованного раствора коллагена I предварительно геля на узорчатую поверхность стерильного штампа, напечатанного на 3D-принтере, и вставьте штамп внутрь (сверху) камеры с открытым верхом, пока стромальный гидрогель все еще находится в жидкой форме.
  3. Удалите остатки гидрогеля, которые могут пролиться из верхней части камеры с открытым верхом, с помощью аспиратора (или пипетки). Сгруппируйте все чипсы в отдельные чашки Петри и включите центрифугу 15 мл конической пробирки, заполненную 2 мл стерильного ddH2O в каждой чашке Петри.
  4. Инкубируйте все чашки Петри при 37 °C, 5% CO2 в течение 90 минут, а затем верните стружку под BSC и аккуратно удалите штампы с помощью прецизионного пинцета, чтобы снизить риск повреждения гидрогеля.

4. Покрытие эпителиальной и сосудистой поверхности тканеспецифическими белками ECM

  1. Покрытие сосудистой микрофлюидной камеры белками внеклеточного матрикса
    1. Умножьте количество чипов, необходимых для эксперимента, на 20 мкл (объем сосудистого русла), чтобы оценить объем раствора сосудистого ECM-покрытия, необходимого для эксперимента:
      Необходимый объем = (количество чипов x 20) мкл
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется подготовить дополнительный 15% тома, чтобы учесть экспериментальные ошибки.
    2. Приготовьте раствор для покрытия сосудов ECM для всех чипов (например, 300 мкл на 12 чипов), используя ледяной PBS или HBSS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к таблице конкретных органов-протоколов в разделе дополнительных материалов (Дополнительная таблица 1 для кожи; Дополнительная таблица 2 для альвеол; Дополнительная таблица 2 для дыхательных путей и дополнительная таблица 4 для кишечника) для определения конкретных реагентов и рекомендуемого состава ECM.
    3. Пипетка 20 мкл сосудистого раствора ECM-покрытия в сосудистый канал каждого чипа.
  2. Покрытие апикальной поверхности стромального эквивалента белками внеклеточного матрикса
    1. Умножьте количество чипов, необходимых для эксперимента, на 50 мкл (объем сосудистого канала), чтобы оценить объем раствора эпителиального покрытия ECM, необходимого для эксперимента:
      Необходимый объем = (Количество чипов x 50) мкл
      ПРИМЕЧАНИЕ: рекомендуется подготовить дополнительный 15% тома для учета экспериментальных ошибок.
    2. Приготовьте достаточное количество раствора для покрытия ECM для всех чипов (например, 750 мкл на 12 чипов) в ледяном PBS или HBSS и перенесите 50 мкл раствора эпителиального покрытия ECM непосредственно на поверхность гидрогеля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к таблице конкретных органов-протоколов в разделе дополнительных материалов (Дополнительная таблица 1 для кожи; Дополнительная таблица 2 для альвеол; Дополнительная таблица 2 для дыхательных путей и дополнительная таблица 4 для кишечника) для определения конкретных реагентов и рекомендуемого состава ECM.
    3. Сгруппируйте чипсы в отдельные чашки Петри, включая центрифугу объемом 15 мл конической пробирки, заполненную 2 мл стерильного ddH 2 O в каждой чашке Петри, и инкубируйте чашки Петри в инкубаторе при 37 ° C, 5% CO 2 в течение2часов, прежде чем приступить к посеву эпителиальных клеток.

5. Посев эпителиальных клеток на стромальный эквивалент

  1. Культура эпителиальных клеток
    1. Культивирование тканеспецифических эпителиальных клеток по указанию поставщиков до слияния 80-90%.
    2. Диссоциируйте клетки с помощью процедур протеолитических ферментов в соответствии с рекомендациями поставщика клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов собирайте эпителиальные клетки при низком пассаже (P1-P2) во время активной фазы роста, когда они достигают слияния между 70% -90%.
    3. После диссоциации центрифугируйте клетки и собирайте их в виде гранул.
    4. Ресуспендируйте эпителиальные клетки до соответствующей плотности клеток/фрагментов, как указано в таблице протоколов конкретных органов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовали клеточный раствор с плотностью 3 x 10 6 клеток / мл для кожи, 1 x 10 6 клеток / мл для альвеолы, 6 x 106 клеток / мл для дыхательных путей и 8 x 106 фрагментов / мл для кишечника.
  2. Посев эпителиальных клеток
    1. Перенесите чипсы из инкубатора в BSC. Аспирируйте раствор покрытия из сосудистого канала и трижды промойте сосудистый микрофлюидный канал 50 мкл свежей среды для культивирования эндотелиальных клеток.
    2. Аспирируйте раствор покрытия с поверхности гидрогеля и трижды промойте стромальную поверхность 100 мкл свежей среды для культивирования эпителиальных клеток, чтобы удалить излишки раствора покрытия.
    3. Аспирируют поднимающуюся среду и засевают поверхность гидрогеля 50 мкл суспензии эпителиальных клеток, используя соответствующую плотность клеток, как указано в дополнительных таблицах, а затем переносят чипсы обратно в инкубатор на 2 ч (или на ночь для колоноидов).
    4. Аккуратно промойте поверхность гидрогеля питательной средой для культивирования клеток дважды, чтобы удалить клеточный мусор. Наконец, обновите среду, автоклавируя в герметичные автоклавируемые контейнеры, и подсоедините стружку к перистальтическому насосу.

6. Подключение чипов к потоку

  1. Подготовка жидких частей
    1. Отрежьте 2 дюйма биосовместимой трубки для переноса термопластичного эластомера (TPE) на основе полипропилена (таблица материалов), чтобы подготовить короткую микрофлюидную трубку, необходимую для соединения микросхем с резервуарами среды.
    2. Отрежьте 7.5 дюймов биосовместимой трубки для переноса TPE, чтобы получить длинную микрофлюидную трубку.
    3. Достаточно подготовить металлические разъемы 18 G и 19 G (Таблица материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется подготовить и стерилизовать трубки и соединители, описанные в шагах 6.1.1 и 6.1.2, по крайней мере, за 1 день до подключения микросхем с открытым верхом к перистальтическим насосам.
    4. Проткните крышку каждого резервуара среды 4-дюймовой иглой для подкожных инъекций (Таблица материалов).
  2. Средняя дегазация
    1. Дайте среде для культивирования клеток уравновеситься до комнатной температуры (RT).
    2. Переведите необходимый объем среды в коническую фильтрующую трубку.
    3. Примените отрицательное вакуумное давление -20 фунтов на квадратный дюйм для дегазации среды (вакуумная фильтрация).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если вакуум недоступен, среду для культивирования клеток можно оставить для уравновешивания в инкубаторе на ночь для достижения аналогичных результатов.
  3. Подготовьте чип с открытым верхом к потоку жидкости
    1. Поднесите стружку и стерильные жидкие детали под BSC и совместите крышку (верхнюю часть) микросхемы с открытым верхом для герметизации прототипа микросхемы с открытым верхом перед запуском потока жидкости.
    2. Пипетка 200 мкл дегазированной среды для культивирования клеток (см. таблицы для конкретных органов) вводится во входное отверстие как верхнего, так и нижнего каналов чипа, обращая внимание на то, чтобы избежать пузырьков.
    3. Пипеткой 300 мкл питательной среды в короткую микрофлюидную трубку для заправки внутренней поверхности пробирок и соединения короткой трубки с входными отверстиями верхнего и нижнего каналов чипа.
  4. Соедините и загрунтуйте микрофлюидные поверхности
    1. Поместите средние резервуары в стойку фермы, подсоедините иглу для подкожных инъекций к нижнему входному отверстию чипсов и, наконец, разместите все чипсы в держателе (носителях) корпуса внутри инкубатора.
    2. Подключите чипы к перистальтическому насосу, а затем осмотрите все разъемы, чтобы убедиться, что все чипы правильно подключены и что нет видимой утечки среды для культивирования клеток.
    3. Используйте кнопку «Продувка » на насосе и удерживайте ее около 15 с или до тех пор, пока капли питательной среды клеток не появятся на конце выпускной трубки.
    4. Используйте систему управления на насосе, чтобы установить соответствующий расход органа-чипа (рис. 2, рис. 3, рис. 4 и рис. 5).

7. Обслуживание чипов

  1. Обслуживание органного чипа
    1. Подготавливают свежую среду для культивирования клеток эпителия и/или эндотелия и выполняют стадии дегазации (как ранее описано на шаге 6.2).
    2. Приостановите работу перистальтического насоса, осторожно отсоедините микросхемы от насоса и извлеките держатели корпуса стружки. Перенесите щепу из инкубатора в BSC и удалите объем среды, оставшийся в резервуарах.
    3. Замените питательные среды для клеточных культур в верхнем и нижнем входных резервуарах 5 мл свежих сред для культивирования клеток и поместите носитель (держатели) корпуса чипа обратно в инкубатор. Подсоедините стружку к перистальтическому насосу и перезапустите поток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать функцию продувки , чтобы быстро освежить среду в сосудистом отсеке и снизить риск образования пузырьков воздуха.
    4. Повторяйте шаги 7.1.1-7.1.3 через день, как показано на рисунке 2, рисунке 3, рисунке 4 и рисунке 5.
  2. Создание интерфейса воздух-жидкость (ALI)
    1. Приостановите работу перистальтического насоса, осторожно отсоедините микросхемы от насоса и извлеките держатели корпуса стружки. Перенесите чипсы из инкубатора в шкаф биобезопасности и удалите оставшийся объем среды в верхний резервуар.
    2. Аккуратно аспирируйте всю среду из верхнего микрофлюидного канала и зажмите короткую микрофлюидную трубку, соединенную с верхними входными отверстиями, с помощью связующих зажимов, чтобы уменьшить испарение среды и поддержание ALI.
    3. Поместите чип с открытым верхом на держатель (держатели) корпуса обратно в инкубатор и снова подключите чип к перистальтическому насосу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать функцию продувки , чтобы быстро освежить среду в сосудистом отсеке и снизить риск образования пузырьков воздуха.
    4. Возобновите поток, запустив перистальтический насос.
  3. Растяжка (опционально)
    1. Приостановите работу перистальтического насоса и подключите вакуумные порты микросхем к вакуумному модулю с помощью двух длинных микрофлюидных трубок на чип.
    2. Используйте вакуумный модуль, чтобы отрегулировать настройку растяжения в соответствии с условиями, рекомендованными для каждого органа, как указано в таблицах протоколов органов: Дополнительная таблица 1 для кожи; Дополнительная таблица 2 для альвеол; Дополнительная таблица 2 для дыхательных путей; и Дополнительная таблица 4 для кишечника.
    3. Визуально осмотрите соединения трубок, чтобы убедиться, что все микросхемы правильно подключены и нет видимых капель средней капли.
    4. Возобновите поток, запустив перистальтический насос.

8. Посев эндотелиальных клеток в сосудистый компартмент

  1. Подготовьте клетки и чипы для посева сосудистых клеток
    1. Культивируйте тканеспецифические эндотелиальные клетки по указанию поставщиков до тех пор, пока не произойдет слияние 80-90%. Диссоциируют клетки с помощью процедуры протеолитического фермента (в соответствии с рекомендациями поставщика) и, наконец, ресуспендируют эндотелиальные клетки в растворе 3 х 106 клеток / мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов собирайте эндотелиальные клетки при низком пассаже (P2-P4) во время активной фазы роста, когда они достигают слияния между 70% -90%.
    2. Приостановите работу перистальтического насоса. Перенесите чипы из инкубатора в BSC, отсоедините чипы от резервуаров среды и любых подключенных трубок, а затем сгруппируйте чипы в отдельные чашки Петри.
    3. Освежите питательную среду эпителиального компартмента свежей средой для культивирования эпителиальных клеток. Дважды промойте сосудистое русло свежей питательной средой для клеток эндотелия, а затем аспирируйте среду из сосудистого компартмента.
  2. Посев эндотелиальных клеток
    1. Засейте нижний (сосудистый) канал 25 мкл суспензии эндотелиальных клеток (3 x 106 клеток/мл), переверните чипы вверх дном, чтобы эндотелиальные клетки могли прикрепиться к верхней поверхности микрофлюидной камеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте 50 мкл суспензии ячейки на чип (600 мкл на 12 чипов).
    2. Сгруппируйте чипсы в чашки Петри. Поместите их обратно в инкубатор при 37 ° C, 5% CO2 и дайте эндотелиальным клеткам прикрепиться в течение 1 часа.
    3. Через 1 ч перенесите чипсы из инкубатора в БСК. Дважды промойте сосудистый канал питательной средой эндотелиальных клеток, чтобы удалить клеточный мусор.
    4. Повторите шаги 8.2.1-8.2.2, чтобы снова засеять сосудистый канал эндотелиальными клетками и уложить стружку ровно, чтобы облегчить адгезию эндотелиальных клеток к нижней поверхности сосудистого канала.
  3. Снова подключите чип к потоку
    1. Заполните резервуар сосудистой среды дегазированной средой для культивирования сосудистых клеток под BSC.
    2. Поместите микросхемы обратно в держатель (держатели) корпуса микросхемы и снова подсоедините микросхемы к средним резервуарам на одном конце к перистальтическому насосу на другом конце.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать функцию продувки , чтобы быстро освежить среду в сосудистом отсеке и снизить риск образования пузырьков воздуха.
    3. Визуально осмотрите микрофлюидные соединения, чтобы убедиться, что все чипы правильно подключены и нет видимых капель среды. Затем возобновите поток жидкости, запустив перистальтический насос.

9. Общие анализы конечных точек

  1. Отключение микросхем для анализа конечных точек
    1. Приостановите работу перистальтического насоса, осторожно отсоедините микросхемы от насоса и извлеките держатели корпуса стружки. Перенесите держатель (держатели) корпуса чипа из инкубатора в BSC и освободите чипы.
    2. Аккуратно промойте центральную камеру чипа с открытым верхом средой для культивирования эпителиальных клеток и сосудистый канал питательной средой эндотелия дважды, чтобы удалить клеточный мусор.
    3. Снимите крышку чипа с открытым верхом, чтобы получить доступ к апикальному отсеку чипа с помощью пинцета.
  2. Иммуноокрашивание для флуоресцентной микроскопии
    1. Приступайте к обычной фиксации образца, пермеабилизации и блокировке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании образцы фиксировали в 200 мкл 4% параформальдегида (ПФА) в течение 1 ч с последующим промыванием PBS, пермеабилизацией в 0,1% Triton X-100 в течение 40 мин и блокированием 1% бычьего сывороточного альбумина в течение 1 ч.
    2. Инкубируйте чипы с первичными антителами (таблица материалов) при 4 ° C в течение ночи. а затем дважды промыть эпителиальный и эндотелиальный компартменты чипов 200 мкл PBS. Затем продолжайте прием соответствующих вторичных антител в течение 2 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавьте первичные антитела и вторичные антитела в PBS + 1% BSA в разведении 1:100 (первичное антитело) и 1:200 (вторичное антитело).
  3. Иммуногистохимия
    1. Экстрагируют стромальные эквиваленты из основной камеры чипа с открытым верхом с помощью пинцета, собирают их в пробирку объемом 1,5 мл, заполненную 10% нейтральным буферным формалином, и инкубируют не менее 24 часов.
    2. Перенесите фиксированный стромальный эквивалент в тканевый процессор и выполните следующие шаги для достижения оптимального обезвоживания образца.
      1. Погрузите гидрогель в 70% этанол на 90 мин.
      2. Удалите 70% этанол и погрузите гидрогель в 80% этанол на 90 минут.
      3. Удалите 80% этанол и погрузите гидрогель в 95% этанол на 90 минут.
      4. Удалите 95% этанол и погрузите гидрогель в 100% этанол на 90 минут дважды.
      5. Удалите 100% этанол и погрузите гидрогель в раствор ксилола на 120 мин дважды.
      6. Удалите раствор ксилола и инфильтрируйте обработанные стромальные эквиваленты в парафиновом воске в течение 120 мин (~ 2 ч) дважды.
    3. Встраивайте инфильтрированные стромальные эквиваленты в парафиновые блоки для секционирования.
    4. На этом этапе стромальные эквиваленты могут быть разделены на парафиновые блоки с использованием микротома и обработаны в соответствии с традиционными гистологическими методами26.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микропаттернирование поверхности
Микропаттернирование внеклеточного матрикса (ECM) может быть использовано для репликации пространственной конфигурации интерфейса кишечной крипты. Конфигурация чипа с открытым верхом может быть изменена для интеграции микроузорчатых штампов, специально разработанных для имитации естественной топографии границы раздела эпителий толстой кишки и строма (рис. 6A, B) и крипт кишечника в микрометровом масштабе (рис. 6C-E...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чип с открытым верхом представляет собой платформу для исследования сложного клеточного взаимодействия, происходящего между эндотелием, стромой и эпителием в контролируемой микросреде в режиме реального времени. Эта технология предлагает критические преимущества по сравнению с обычными органотипическими и органоидными культурами, такие как интеграция физических и биохимических сигналов, которые имеют отношение к воссозданию микроокружения тканей человека, включая сдвиг жидкости (поток), циклическое растяжение и реконстру...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют о следующих финансовых интересах/личных отношениях, которые могут рассматриваться как потенциальные конкурирующие интересы: Вароне Антонио является бывшим сотрудником Emulate Inc. и может владеть долей участия в Emulate.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x EMEM Lonza12-684FСредний; Stroma
18 калибр иглаMicroGroup316H18RWТрубка нержавеющая сталь 316 сварная, 18RW Full Hard 
Игла 19 калибраMicroGroup316H19RWТрубка нержавеющая сталь 316 сварная, 19RW Full Hard
2-Stop PharMed BPT Коул-Палмер EW-95723-12Туба, 0,25 мм, 12/упаковка
70% этанол и салфетки  -  - Для стерилизации поверхностей 
8-бромаденозин 3′,5′-циклический монофосфат натриевая соль (8-Br-cAMP)SigmaB7880Medium supplement 
А-83-01 Tocris 2939
АденинСигмаA9795
Усовершенствованный DMEM/F12 Термо12634010
эпителиальные клетки дыхательных путейТехнология Lifeline CellTechnology FC-0016
Алюминиевая фольга   -  -  -
Альвеолярные клеткиКлеточные биологические препаратыH6621
Anti-ABCA3   АБКАМ АБ24751&nБСП;Мышиное моноклональное антитело [3C9] 
Анти-Аквапорин5 Alexa Fluor 647 АБКАМ ab215225   Моноклональное антитело кролика [EPR3747]   
Анти-Аквапорин5 АБКАМ АБ92320 Моноклональное антитело кролика [EPR3747] 
Анти-бета IV тубулин   АБКАМ AB11315 Мышиное моноклональное антитело [ONS.1A6] 
Anti-CD31 (PECAM-1) АБКАМ ab9498 Мышиное моноклональное антитело [JC/70A]   
Анти-CK5   АБКАМ ab75869 Кролик рекомбинантный моноклональный [AY1E6] 
Анти-Цитокератин 10   ТермоФишер MA5-13705 Мышиное моноклональное антитело (DE-K10) 
Анти-Цитокератин 14   АБКАМ АБ7800 Мышиное моноклональное антитело 
Анти-E-кадгерин   АБКАМ АБ1416&НБСП;  Мышиное моноклональное антитело 
Анти-Филаггрин   ТермоФишер PA5-79267 Кроличье поликлональное антитело   
Анти-HTI-56 Терраса Биотех ТБ-29AHT1-56   Мышиное моноклональное антитело (IgG1) 
Анти-HTII-280 Терраса Биотех ТБ-27AHT2-280 Мышиное моноклональное антитело (IgM) 
Анти-Инволюкрин  ТермоФишер MA5-11803 Мышиное моноклональное антитело (SY5) 
Антиизоформы TA p63-α, -β, -γ    Биоленгенд 618902 Кроличье поликлональное антитело   
Анти-Ki67   АБКАМ АБ8191 Мышиное моноклональное антитело [B126.1] 
Anti-LAMP3   АБКАМ AB111090 Кроличье поликлональное антитело 
Антизрелые SP-B Севен Хилл WRAB-48604 Кроличье поликлональное антитело 
Анти-MUC5AC   ТермоФишер PA5-34612 Кроличье поликлональное антитело   
Антимуцин-2 SantaCruz Biotechnologysc-7314Мышиное моноклональное антитело (IgG1) 
Анти-p63   Dako GA662 Мышиное моноклональное антитело p63 белок (Dako Omnis)  Клон DAK-p63 
Анти-PCNA   ТермоФишер PA5-32541 Кроличье поликлональное антитело   
Антиподопланин (АТ-1&альфа;)   АБКАМ ab128994 Кроличье поликлональное антитело 
Анти-Про + Зрелый Поверхностно-Активный Белок B АБКАМ ab40876 Кроличье поликлональное антитело 
Антиповерхностно-активное вещество C     Севен Хилл   WRAB-9337   Кроличье поликлональное антитело 
Анти-Утероглобин/SCGB1A1 Hycult Biotech HM2178 Мышиное моноклональное антитело [AY1E6] 
Анти-VE-кадгерин   АБКАМ AB33168 Кроличье поликлональное антитело   
Анти-ЗО-1   ТермоФишер 33-9100 Мышиное моноклональное антитело [1A12] 
Аскорбиновая кислотаSigmaA4544
Аспирационные пипетки Corning / Falcon 357558 2 мл, полистирол, в индивидуальной упаковке 
Советы по аспирации  -  - Стерильные (автоклавные) 
B27
BSA (10X) в растворе PBS   ТермоФишер 37525 Блокатор 
Хлорид кальцияSigmaC7902
CHIR 99021Tocris4423
Коллаген IУсовершенствованная биоматрица513310 мг/мл (Строма)
Коллаген I Advanced BioMatrix50053 мг/мл (сосудистая ВКМ)
Коллаген IVSigma  C5533
Коллаген-IVСигма C5533-5MG Коллаген из плаценты человека, 5 мг порошка, восстановленный до 1 мг/мл;
Фибробласты толстой кишки Клеточные биологические препараты  H6231
Микрососудистые эндотелиальные клетки толстой кишки  Клеточные биологические препаратыH6203 
Конические трубы    -  - 15 мл и 50 мл полипропилен, стерильный 
Сшиватель (ER-1) Эмуляция 104615 мг порошок 
DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол, дилактат)   ТермоФишер D3571 Зонд ДНК 
Дермальные фибробластыATCCPCS-201-010
Дермальные микрососудистые эндотелиальные клеткиATCCCRL-3243
ДексаметазонSigmaD4902
DMEMThermoFisher11054020
DMEM/F-12 GIBCO 
DMEM/F-12, GlutaMAX   GIBCO 10565-018 Базальная среда для среды ALI 
Donkey Anti-Mouse IgG H& L (Alexa Fluor 488)   АБКАМ AB150105 Вторичное антитело Donkey Anti-Mouse   
Donkey Anti-Mouse IgG H& L (Alexa Fluor 568)   АБКАМ ab175472 Вторичное антитело Donkey Anti-Mouse 
Donkey Anti-Mouse IgG H& L (Alexa Fluor 647)   АБКАМ АБ150107 Вторичное антитело Donkey Anti-Mouse 
Donkey Anti-Rabbit IgG H& L (Alexa Fluor 488)   АБКАМ   AB150073 Вторичное антитело Donkey Anti-Mouse 
Donkey Anti-Rabbit IgG H& L (Alexa Fluor 568)   АБКАМ АБ175470 Вторичное антитело Donkey Anti-Mouse 
Donkey Anti-Rabbit IgG H& L (Alexa Fluor 647)   АБКАМ AB150075 Вторичное антитело Donkey Anti-Mouse 
Дульбекко s PBS (DPBS-/-) (без Ca2+, Mg2+) Corning 21-031-CV 1х 
Эпидермальный фактор роста (EGF) человека, рекомбинантный в E. coliPromoCellC-60170Medium supplement 
F-12 Хам sInvitrogen 21700-108Для сосудистой ВКМ
FibriCol Усовершенствованная БиоМатрица 5133-20МЛ Раствор коллагена I (10 мг/мл)
ФибронектинCorning356008
Фибронектин, человеческий, Природный,   Corning 47743-654 Фибронектин плазмы человека 
Прецизионный пинцет с тонким наконечником Авен18056США Прецизионный пинцет из нержавеющей стали Technik Style 5B-SA
ГлутамаксИнвитроген 21700-108
Глутамакс Инвитроген 
Козий антимышиный IgG H& L (Alexa Fluor 594)   АБКАМ АБ150080 Goat Anti-Mouse вторичное антитело   
Козий антимышиный IgG H& L (Alexa Fluor 647)   АБКАМ AB150115 Goat Anti-Mouse вторичное антитело   
Козий антимышиный IgG H& L (FITC)   АБКАМ АБ6785 Goat Anti-Mouse вторичное антитело   
Козий антимышиный IgG1 Alexa Fluor 568   ТермоФишер А-21124 Вторичное антитело Goat Anti-Mouse IgG1 
Козий антимышиный IgM Alexa Fluor 488   ТермоФишер А-21042 Вторичное антитело Goat Anti-Mouse IgM 
Ручной вакуумный аспиратор Corning 4930  - 
Термоинактивированная сыворотка HyClone FetalClone II (FCS) GE Healthcare Медико-биологические наукиSH30066.03
Гемоцитометр  -  - - 
Гепарин натриевая соль из слизистой оболочки кишечника свиньиSigmaH3149
HEPESThermo15630080
человека [Leu15] - Gastrin SigmaG9145
Человеческие колоноидыПолучены в результате клинических резекцийПолучены в результате клинических резекций
Рекомбинантный белок EGF человека ТермоPHG0311L
фактор роста эпителия человека Термо 
Сыворотка HyClone FetalClone II (США)  GE Healthcare SH30066.02HI   Стерильные FBS  Термоинактивированный 
Гидрокортизон 21-гемисукцинат натриевая сольSigmaH4881
Hydrocortisoon PromoCell   С-64420 Средняя добавка   
Ведро для льда  -  -  - 
Исматек МПК-Н Cole-PalmerEW-78000-41Низкоскоростной цифровой перистальтический насос; q24-канал (1 на 12 чипов)
ITESBioWhittaker17-839Z
Фактор роста кератиноцитов (KGF), также известный как основной фактор роста фибробластов 7 (FGF-7), человеческий, рекомбинантный в HEKPromoCellC-63821
КератиноцитыATCCPCS-200-010
Ламинин БиоламинаCT521-0501 
Ламинин, 521 CTG (CT521) Биоламина   CT521-0501 Человеческий рекомбинантный ламинин 521       
Легкие фибробластыклеточные биологические препаратыH6013
Легкие фибробластыLifeline Клеточная технологияFC-0049
Микрососудистые эндотелиальные клетки легкихLonzaCC-2527
Легкие гладкомышечные клеткиLifeline Клеточная технологияFC-0046
Ручной счетчик  -  -  -
Передаточная трубка Masterflex (TPE Cole-PalmerFV-96880-02PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD
Medium 199, без фенола красногоThermo 
Микроцентрифужная трубка  -    -   1,5 мл, стерильный 
Микроскоп (с камерой)  -  - Для визуализации в светлом поле 
N2Sigma17502001
N-ацетилцистеинSigmaA5099
Noggin (HEK293T кондиционированная среда)SigmaN17001
Нормальная козья сыворотка   ТермоФишер 50062Z Решение для блокировки   
О-фосфосфорилэтаноламин SigmaP0503
Параформальдегид (4% масс./об.)   EMS 15710 Фиксатор 
Пенициллин стрептомицинGIBCO15140122
пенициллин-стрептомицинСигма P4333 10 000 ЕД/мл; 10 мг/мл;
Наконечники для пипеток    -  - P20, P200 и P1000  стерильная, пипетка с низкой адгезией
 Gilson   F167380 P20, P200 и P1000 
Замена сыворотки PluriQ (или замена сыворотки KO)AMSBIO (или Thermo)N/A (или C1910828010)
Предметные стекла микроскопа с покрытием из поли-L-лизина   Сигма P0425 Стеклянные горки 
PrimocinInvivoGenant-pm-1
ProgesteroneSigmaP8783
ProLong Gold   ТермоФишер P36931 Антивыцветающий монтант с DAPI 
Ретиноевая кислота Ингибитор SigmaR2625
ROCK (Y27632)TocrisTB1254-GMP/10
R-спондин (HEK293T кондиционированная среда)Добавки SigmaSCC111
SAGM SingleQuots LonzaCC-4124
SAGMTM Среда для роста эпителиальных клеток малых дыхательных путей BulletKitTM Лонза CC-4124 Средние добавки 
SB2001190 Tocris 1264/10
Серологические пипетки  -  - 2 мл, 5 мл, 10 мл и 25 мл с низким содержанием эндотоксина, стерильный 
Среда для роста эпителиальных клеток малых дыхательных путей (SAGM)Lonza CC-4124 
Буфер растворителя (ER-2) Эмуляция 10462Флакон 25 мл 
Steriflip-HV MilliporeSE1M003M00Стерильная фильтрующая коническая трубка
Sterilin 100 мм Квадратная чашка ПетриThermo103Стерильная, 1 на 6 чипов 
Колбы Т25  -  -  -
Колбы Т75  -  -  - 
ТрийодтиронинSigmaT5516
Triton X-100 (0.3% (об./об.)   Сигма Т8787 Пермеабилизирующий агент 
Трипан синий Сигма 93595 0,4% раствор 
Решение TrypEE Сигма 12604013 Решение для отделения ячеек 
TWEEN-20 Сигма P2287 Пермеабилизирующий агент 
Печь с ультрафиолетовым излучением (пиковая частота 365 нм, интенсивность 100 мкм; J/cm2)VWR21474-598UVP, большой диапазон UV, 365 нм 60 Гц Модель CL-1000L
Вакуумная установка  -  - Минимальное давление: -70 кПа 
Фактор роста эндотелия сосудов 165 (VEGF-165) человека, рекомбинантный в E. coliPromoCellC-64420
VEGF-165   PromoCell   С-64420 Средняя добавка 
Фактор фон Виллебранда сопряженный FITC   АБКАМ АБ8822 Овечьи поликлональные антитела 
Водяная баня (или бусы) -  - Установите значение 37 ° С 
Wnt3A (кондиционированная среда L-Wnt3A)ATCCCRL-2647
Термоблокиратор 17504044 1132008235050061PHG031111043023

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach. JACC: Basic to Translational Science. 4 (7), 845-854 (2019).
  2. Wange, R. L., Brown, P. C., Davis-Bruno, K. L. Implementation of the principles of the 3Rs of animal testing at CDER: Past, present and future. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 123, 104953(2021).
  3. Mosig, A. S. Organ-on-chip models: New opportunities for biomedical research. Future Science OA. 3 (2), (2017).
  4. Alépée, N., et al. State-of-the-art of 3D cultures (organs-on-a-chip) in safety testing and pathophysiology. Altex. 31 (4), 441-477 (2014).
  5. MacArron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
  6. Hughes, J. P., Rees, S. S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).
  7. Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Cell culture based in vitro test systems for anticancer drug screening. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 322(2020).
  8. Mao, P., et al. Human alveolar epithelial type II cells in primary culture. Physiological Reports. 3 (2), 12288(2015).
  9. Zaitseva, M., Vollenhoven, B. J., Rogers, P. A. W. In vitro culture significantly alters gene expression profiles and reduces differences between myometrial and fibroid smooth muscle cells. Molecular Human Reproduction. 12 (3), 187-207 (2006).
  10. Singh, A., Brito, I., Lammerding, J. Beyond tissue stiffness and bioadhesivity: Advanced biomaterials to model tumor microenvironments and drug resistance. Trends in Cancer. 4 (4), 281-291 (2018).
  11. Nawroth, J. C., et al. Stem cell-based Lung-on-Chips: The best of both worlds. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 12-32 (2019).
  12. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33(2020).
  13. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  14. Sutherland, R. M., Inch, W. R., McCredie, J. A., Kruuv, J. A multi-component radiation survival curve using an in vitro tumour model. International Journal of Radiation Biology. 18 (5), 491-495 (1970).
  15. Chandra, P., Lee, S. J. Synthetic extracellular microenvironment for modulating stem cell behaviors. Biomarker Insights. 10, 105-116 (2015).
  16. Nicolas, J., et al. 3D extracellular matrix mimics: Fundamental concepts and role of materials chemistry to influence stem cell fate. Biomacromolecules. 21 (6), 1968-1994 (2020).
  17. Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
  18. Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
  19. Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323(2019).
  20. Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6(2018).
  21. Li, H., et al. Biomechanical cues as master regulators of hematopoietic stem cell fate. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 5881-5902 (2021).
  22. Donoghue, L., Nguyen, K. T., Graham, C., Sethu, P. Tissue chips and microphysiological systems for disease modeling and drug testing. Micromachines. 12 (2), 139(2021).
  23. Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
  24. Varone, A., et al. A novel organ-chip system emulates three-dimensional architecture of the human epithelia and the mechanical forces acting on it. Biomaterials. 275, 120957(2021).
  25. Hassell, B. A., et al. Human organ chip models recapitulate orthotopic lung cancer growth, therapeutic responses, and tumor dormancy in vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
  26. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Biobanking. 1897, 253-268 (2019).
  27. Grant, J., et al. Simulating drug concentrations in PDMS microfluidic organ chips. Lab on a Chip. 21 (18), 3509-3519 (2021).
  28. Barrile, R., et al. Organ-on-chip recapitulates thrombosis Induced by an anti-CD154 monoclonal antibody: Translational potential of advanced microengineered systems. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 104 (6), 1240-1248 (2018).
  29. Jain, A., et al. Primary human lung alveolus-on-a-chip model of intravascular thrombosis for assessment of therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
  30. Campbell, S. B., Wu, Q., Yazbeck, J., Liu, C., Okhovatian, S., Radisic, M. Beyond polydimethylsiloxane: Alternative materials for fabrication of organ-on-a-chip devices and microphysiological systems. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (7), 2880-2899 (2021).
  31. Pun, S., Haney, L. C., Barrile, R. Modelling human physiology on-chip: Historical perspectives and future directions. Micromachines. 12 (10), 1250(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Open Top Organ ChipEpithelial Tissue ModelsMicrofluidic PlatformBarrier FunctionStromal HydrogelEndothelial CellsSurface MicropatterningAir Liquid InterfaceMultilayered EpitheliumVascular Channel

Related Articles