Method Article

Методы и протоколы для визуализации в реальном времени в разработке

DOI:

10.3791/64642

⸱

January 13th, 2023

1Department of Neurobiology and Department of Neurosurgery of Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Liangzhu Laboratory, MOE Frontier Science Center for Brain Science and Brain-machine Integration, State Key Laboratory of Brain-machine Intelligence, Zhejiang University, 3NHC and CAMS Key Laboratory of Medical Neurobiology, Zhejiang University

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ОБСУЖДАЕМЫЕ СТАТЬИ:

Januschke, J., Loyer, N. Применение иммобилизации тканей дрозофилы с фибриновыми сгустками для визуализации в реальном времени. Журнал визуализированных экспериментов. (166), 10.3791/61954 (2020).

Li, T., Luo, L. Эксплантная система для покадровой визуализации сборки обонятельных контуров у дрозофил. Журнал визуализированных экспериментов. (176), 10.3791/62983 (2021).

Schramm, P., Hetsch, F., Meier, J. C., Koster, R. W. Визуализация in vivo полностью активной ткани мозга у бодрствующих личинок данио и молоди путем удаления черепа и кожи. Журнал визуализированных экспериментов. (168), 10.3791/62166 (2021).

Ratke, J., Kramer, F., Strobl, F. Одновременная визуализация нескольких эмбрионов насекомых в режиме реального времени в светолистовых флуоресцентных микроскопах на основе камеры образца. Журнал визуализированных экспериментов. (163), 10.3791/61713 (2020).

Терзи, А., Алам, С. М. С., Сутер, Д. М. Визуализация живых клеток РОС во время развития нейронов. Журнал визуализированных экспериментов. (168), 10.3791/62165 (2021).

Мутлу, А. С., Чен, Т., Денг, Д., Ванг, М. С. Безмаркерная визуализация динамики накопления липидов у Caenorhabditis elegans с использованием вынужденной микроскопии комбинационного рассеяния. Журнал визуализированных экспериментов. (171), 10.3791/61870 (2021).

Boutillon, A., Escot, S., David, N. B. Глубокая и пространственно контролируемая объемная абляция с использованием двухфотонного микроскопа в гаструле данио-рерио. Журнал визуализированных экспериментов. (173), 10.3791/62815 (2021).

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Развитие характеризуется динамическим изменением структур на уровнях органелл, клеток и органов. Способность покадровой визуализации собирать четырехмерную информацию от одной и той же структуры в ее физиологическом состоянии делает ее идеальным методом для изучения динамического процесса развития 1,2,3,4,5,6. Огромное количество данных, собранных с помощью визуализации в реальном времени, также позволяет проводить количественный анализ развития. Несмотря на то, что покадровая съемка более широко используется для однослойной клеточной культуры, визуализация трехмерных живых тканей или животных является гораздо более сложной задачей из-за технических сложностей, таких как рассеяние света живых тканей, разработка соответствующей стратегии монтажа и метода мечения, поддержание нормального физиологического состояния в течение длительного периода визуализации, доступность подходящего микроскопа. и так далее. Эти проблемы ограничивают использование визуализации в реальном времени во многих лабораториях. В этой коллекции методов в семи статьях сообщалось о новых методах подготовки живых образцов, маркировки и лазерных манипуляций. Все эти методы позволяют визуализировать процессы развития под разными углами в режиме реального времени.

Прямая визуализация глубоких областей технически сложна из-за сильного рассеяния живых тканей. Это рассеяние может быть сведено к минимуму за счет обнажения внутренних органов посредством диссекции, что улучшает пространственное разрешение изображений. В этой коллекции Янушке и Лойер7 описали протокол препарирования мозга личинок дрозофилы и метод монтирования с использованием фибриновых сгустков. Такая стратегия монтажа позволяла проводить покадровую визуализацию с использованием инвертированных микроскопов нескольких образцов на одной чашке, поскольку для этого требовалось только добавление фибриногена и тромбина. Li и Luo8 представили протокол препарирования экспланта антенн и мозга из куколок мух и условия культуры ex vivo , которые поддерживали нормальное развитие обонятельной цепи в течение 24 ч. Их система позволила визуализировать аксональное и дендритное нацеливание в сборке обонятельной цепи мухи из ее физиологического состояния. Эта эксплантная система подходит для двухфотонных микроскопов и решетчатых световых микроскопов с адаптивной оптикой на основе визуализации, что позволяет получать как долгосрочную непрерывную визуализацию, так и быструю визуализацию с высоким пространственно-временным разрешением за короткий период времени. Schramm et al.9 разработали минимально инвазивную хирургическую процедуру для удаления кожи и мягкого хряща черепа рыбок данио-рерио с помощью микропилинга. Это позволило им наблюдать некоторые ключевые события на более поздних стадиях развития, включая дифференцировку нейронов, созревание, пластичность и переходные процессыCa2+ в течение 30 дней после оплодотворения. Это также позволило им выполнять живую визуализацию после пигментации кожи личинок данио-рерио. Помимо вскрытия, правильное крепление образцов также имеет решающее значение для визуализации в реальном времени. Ratke et al.10 представили экспериментальную основу для одновременной визуализации нескольких эмбрионов мухи в реальном времени с помощью световой листовой микроскопии. Этот протокол увеличил общую пропускную способность и идеально подходит для сравнительного исследования.

Помимо пробоподготовки, новые методы мечения облегчают визуализацию специфических структур в живых тканях. Terzi et al.11 сообщили о генетически кодируемом биосенсоре H2O2, roGFP2-Orp1, для визуализации внутриклеточных уровней H2O2 из культивируемых нейронов рыбок данио и целых личинок во время развития. Одним из важных преимуществ этого генетически кодируемого биосенсора H2O2 было улучшение временного и пространственного разрешения обнаружения H2O2 . В другом исследовании, проведенном Mutlu et al.12 , описывается микроскопия вынужденного комбинационного рассеяния света (SRS), метод химической визуализации без меток для быстрого и количественного обнаружения липидов в живых клетках с субклеточным разрешением. КакH2,O2 , так и липиды легко теряются во время фиксации образца. Разработка методов мечения или визуализации в живых тканях не только обошла эту проблему, но и сохранила пространственную и временную информацию об этих структурах в биологических процессах.

Наконец, свет также можно использовать для клеточной абляции. Boutillon et al.13 показали метод абляции глубоких и пространственно четко определенных объемов у рыбок данио с использованием двухфотонного микроскопа. По сравнению с абляцией клеток на основе ультрафиолетового лазера, двухфотонный лазер улучшил осевое разрешение и проникновение в ткани. Этот протокол обеспечил стратегию возмущения для изучения межклеточного взаимодействия во время развития.

Развитие микроскопических технологий позволило нам понять многие процессы развития в четырех измерениях. Протоколы в этой коллекции помогут большему количеству ученых преодолеть технический барьер визуализации в реальном времени в различных биологических системах. Мы ожидаем, что в будущем будет разработано больше методов, облегчающих визуализацию в реальном времени.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Автору нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот выпуск коллекции методов JoVE был профинансирован NIH 1K99DC01883001. Я благодарю моего наставника по постдоку Лицюнь Ло, моих коллег Эрика Бетцига и Тянь-Мин Фу за сильную поддержку в развитии моего интереса к покадровой визуализации во время моего постдокторского проекта. Я также благодарю Школу наук о мозге и медицины мозга в Чжэцзянском университете за то, что они пригласили меня и поддержали в продолжении исследования покадровой визуализации в моей собственной лаборатории.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rieger, S., Wang, F., Sagasti, A. Time-lapse imaging of neural development: zebrafish lead the way into the fourth dimension. Genesis. 49 (7), 534-545 (2011).
  2. Wong, C., Chen, A. A., Behr, B., Shen, S. Time-lapse microscopy and image analysis in basic and clinical embryo development research. Reproductive Biomedicine Online. 26 (2), 120-129 (2013).
  3. Ezin, M., Fraser, S. Time-lapse imaging of the early avian embryo. Methods in Cell Biology. 87, 211-236 (2008).
  4. Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. Time-lapse analysis of retinal differentiation. Current Opinion in Cell Biology. 17 (6), 676-681 (2005).
  5. Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry. Part A. 93 (3), 357-370 (2018).
  6. Christen, P., Muller, R. In vivo visualisation and quantification of bone resorption and bone formation from time-lapse imaging. Current Osteoporosis Reports. 15 (4), 311-317 (2017).
  7. Januschke, J., Loyer, N. Applications of immobilization of Drosophila tissues with fibrin clots for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (166), e61954(2020).
  8. Li, T., Luo, L. An explant system for time-lapse imaging studies of olfactory circuit assembly in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (176), e62983(2021).
  9. Schramm, P., Hetsch, F., Meier, J. C., Koster, R. W. In vivo imaging of fully active brain tissue in awake Zebrafish larvae and juveniles by skull and skin removal. Journal of Visualized Experiments. (168), e62166(2021).
  10. Ratke, J., Kramer, F., Strobl, F. Simultaneous live imaging of multiple insect embryos in sample chamber-based light sheet fluorescence microscopes. Journal of Visualized Experiments. (163), e61713(2020).
  11. Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. M. ROS live cell imaging during neuronal development. Journal of Visualized Experiments. (168), e62165(2021).
  12. Mutlu, A. S., Chen, T., Deng, D., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid storage dynamics in Caenorhabditis elegans using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (171), e61870(2021).
  13. Boutillon, A., Escot, S., David, N. B. Deep and spatially controlled volume ablations using a two-photon microscope in the Zebrafish gastrula. Journal of Visualized Experiments. (173), e62815(2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Live ImagingDrosophilaImmobilizationTime lapse ImagingOlfactory Circuit AssemblyIn Vivo ImagingBrain TissueZebrafish LarvaeLight Sheet Fluorescence MicroscopyNeuronal DevelopmentROS ImagingLipid Storage DynamicsCaenorhabditis ElegansStimulated Raman Scattering MicroscopyTwo photon MicroscopeVolume Ablations

Related Articles