Белковый гомеостаз, или протеостаз, имеет основополагающее значение для здоровья клеток и организмов 1,2. Консервативные клеточные процессы взаимодействуют для поддержания правильно свернутого протеома, влияя на синтез, сворачивание и клиренс белка 3,4. Нарушения в протеостазе связаны с возрастными нейродегенеративными заболеваниями и раком 5,6. Основываясь на высоком уровне сохранности, модельные организмы, такие как нематода Caenorhabditis elegans (C. elegans), сыграли важную роль в понимании роли протеостаза в здоровье и болезнях человека 7,8. C. elegans обладает многими характеристиками, которые делают его идеальной экспериментальной моделью, включая короткий жизненный цикл, прозрачную кутикулу и простоту химических и генетическихманипуляций. Эта коллекция методов содержит подробные протоколы мониторинга дисбаланса протеостаза на молекулярном, клеточном и организменном уровнях у C. elegans.
Клетки реагируют на нарушения в протеостазе, активируя различные реакции на стресс, включая реакцию теплового шока (HSR), реакцию развернутого белка (UPR) и реакцию на окислительный стресс (OxSR) для перестройки клеточного протеома10. Для повышения воспроизводимости в полевых условиях Голдени коллеги описали стандартизированные методы робастной индукции HSR. ОТ-кПЦР является широко используемым, чувствительным методом анализа экспрессии генов путем количественного определения мРНК, и этот анализ может быть использован для измерения клеточных уровней мРНК различных генов, индуцируемых тепловым шоком11. Чтобы распространить этот подход на крупномасштабный высокопроизводительный анализ, Chauve et al.12 описывают новую адаптацию для получения кДНК в сочетании с нанофлюидной платформой RT-qPCR, которая является надежной и высокочувствительной. Точные измерения экспрессии генов могут быть выполнены на отдельных червях или объемных образцах12. Рекомендуемые мишени генов реакции на стресс вместе с парами праймеров для измерения транскрипционной апрегуляции генов реакции на стресс перечислены в соответствующих протоколах12,13.
Одним из ограничений использования ОТ-кПЦР для оценки активации реакций на стресс является то, что это может быть дорого, технически сложно и требует использования специализированного оборудования. Таким образом, специфичные для пути транскрипционные репортерные штаммы, экспрессирующие флуоресцентный белок под действием стресс-индуцируемого промотора (например, hsp-16.2p::gfp для мониторинга HSR), часто используются для оценки клеточных реакций на стресс11. Используя простой рабочий процесс с открытым исходным кодом на Фиджи под названием Worm-align в сочетании с конвейером CellProfiler Worm_CP, Оккенхауг и его коллеги наметили14 шагов для быстрой количественной оценки флуоресценции отдельных червей. Кроме того, Bar-Ziv et al.13 описывают метод с высокой пропускной способностью с использованием проточного цитометра с крупными частицами, который позволяет фиксировать интенсивность, размер и пространственное (2D) распределение флуоресценции для тысяч животных. Приведены сведения о транскрипционных репортерах для оценки активации клеточных стрессовых реакций, а также рекомендуемые настройки для флуоресцентной микроскопии и количественного определения с помощью червячного биосортировщика13. Важно отметить, что эти репортеры могут быть сопряжены со специфическими физиологическими тестами на выживание после стресса, которые контролируют состояние здоровья животного после определенного режима стресса11,13. Хотя флуоресцентные репортеры имеют преимущество в выявлении тканеспецифичных различий, они могут обнаружить индукцию только выше определенного порога, а стабильность определенных флуорофоров, таких как GFP, исключает обнаружение динамических вариаций в экспрессии генов. Кроме того, большинство физиологических анализов отнимают много времени и, следовательно, имеют ограниченную масштабируемость. Несмотря на эти ограничения, эти методы позволяют всесторонне охарактеризовать клеточные и физиологические эффекты внутренних и внешних стрессоров.
Хронические протеотоксические возмущения связаны с коллапсом сети протеостаза (ПН), механизма контроля качества, отвечающего за поддержание функционального протеома 5,6. Прогрессирующее снижение протеостаза связано со многими возрастными заболеваниями. C. elegans является отличной модельной системой для изучения уязвимости конкретных тканей к неудачам протеостаза. Lazaro-Pena et al.15 описывают подход к мониторингу мышечной стенки тела или функциональности нейронов по мере старения червя. Этот подход может быть адаптирован для более высокопроизводительного генетического анализа или скрининга лекарственных препаратов15. Основная проблема состоит в том, чтобы понять, как взаимодействуют между различными компонентами ПН in vivo. Чтобы устранить этот недостаток, Дрори его коллеги разработали систему для сбора специфической информации о взаимодействиях молекулярных шаперонов, ключевых компонентов ПН, в конкретных тканях в процессе развития и старения. Связывая тканеспецифические возмущения сворачивающегося равновесия с доступными мутантами или трансгенными штаммами, которые обеспечивают тканеспецифическое подавление генов-мишеней с помощью РНК-интерференции, можно исследовать шапероновую сеть в данной ткани. Дополнение этой стратегии простыми поведенческими анализами, которые оценивают функциональность конкретных тканей или типов клеток, может выявить биологически значимые взаимодействия PN in vivo 15,16. Важно понимать, что дисбаланс протеостаза в одной ткани или типе клеток может влиять на систему контроля качества дополнительных тканей неавтономным образом. Майлз и ван-Остен-Хоул17 описывают подход к идентификации механизмов и компонентов клеточно-неавтономной ПН с использованием тканеспецифичных подходов к РНК-интерференции в сочетании с рядом репортеров стресса и датчиков протеостаза17. Эта стратегия позволяет исследовать способность PN в различных тканях в результате неавтономно-активируемых клеточных механизмов реакции на стресс.
C. elegans обычно используется для моделирования возрастных нейродегенеративных заболеваний, вызванных мутациями расширения полиглутаминовых повторов, таких как болезнь Хантингтона18. Активно используемый протеостаз представляет собой фрагмент полиглутамина (polyQ), слитый с флуоресцентным белком, который образует очаги in vivo в зависимости от длины polyQ и возраста19 лет. Улучшение воспроизводимости в биологических испытаниях, между отдельными людьми и между лабораториями требует определения того, что оценивается как фокусы. Lazaro-Pena et al.15 описывают стратегию точного измерения образования очагов polyQ::YFP в нейронах или мышцах стенки тела во время старения. Для мониторинга скорости обновления склонного к агрегации мутантного белка гентингтина, несущего полиглутаминовую экспансию, Pigazzini и Kirstein20 описывают неинвазивную методику, которая требует использования фотоконвертируемого флуорофора Dendra2. Используя конфокальную микроскопию и штамм C. elegans, экспрессирующий мутантный гентингтин, слитый с Dendra2, можно контролировать и количественно оценивать деградацию этого склонного к агрегации белка в стареющем организме20. Для количественной оценки амилоидной фибрилизации склонных к агрегации белков, таких как мутантный хантингтин, можно использовать флуоресцентную микроскопию времени жизни (FLIM)21. FLIM позволяет проводить неинвазивный анализ процесса агрегации путем мониторинга гашения флуорофоров в непосредственной близости от амилоидных структур, тем самым уменьшая время жизни флуоресценции21. Время жизни флуоресценции отрицательно коррелирует с агрегацией слитого амилоидного белка и не зависит от уровней экспрессии флуорофора. Этот метод позволяет исследователю проследить влияние старения и ухудшения PN на склонность к агрегации любого белка. Однако, если интенсивность флуорофора низкая, это может стать проблематичным, поскольку FLIM требует получения относительно большого количества фотонов. Поэтому требуется более высокая мощность возбуждающего лазера, что приводит к более быстрому фотообесцвечиванию и ненадежной кривой затухания. Кроме того, этот метод требует сложного и дорогостоящего оборудования в качестве дополнения к уже существующим системам микроскопии. Важный стандартизированный подход включен для другого протокола, исследующего повторно-ассоциированную не-AUG-зависимую (RAN) трансляцию, связанную с РНК, содержащей повторные расширения. Поскольку трансляция RAN не требует стартового кодона для определения рамки считывания, количество возможных токсичных пептидов, ассоциированных с заболеванием, увеличивается. Рудич и коллеги22 подробно рассказывают о том, как количественно оценить токсичность пептида RAN с помощью движения и размножения C. elegans.
Дисбаланс в протеоостазе приводит к неправильному сворачиванию белка и накоплению белковых агрегатов, которые связаны с множественными возрастными нейродегенеративными заболеваниями 5,6. Штаммы C. elegans, экспрессирующие различные склонные к агрегации белки, слитые с флуоресцентными репортерами, были использованы для мониторинга дисбаланса протеостаза в различных типах клеток и тканей. Анализ этих моделей привел к ряду новых наблюдений; Моника Дрисколл и ее коллеги заметили, что нейроны высвобождают агрегаты PolyQ и другой клеточный мусор, такой как поврежденные органеллы, в «экзоферах», открывая ранее неизвестную ветвь нейронального протеостаза23. Поскольку это новое явление, крайне важно предоставить четкие инструкции по мониторингу производства экзоферов для обеспечения воспроизводимости в полевых условиях. Arnold et al.24 описывают физические особенности экзоферов C. elegans, стратегии их обнаружения, критерии идентификации и оптимальные сроки количественной оценки. Кроме того, этот протокол подчеркивает необходимость строгого контроля условий роста для устранения непреднамеренных напряжений, которые могут модулировать уровни экзофера для достижения воспроизводимой оценки производства экзофера.
Эта коллекция предоставляет несколько методологических стратегий для мониторинга дисбаланса протеостаза на молекулярном, клеточном и организменном уровнях у C. elegans. Стрессоры, такие как неправильно свернутые белки болезней, могут быть экспериментально введены в определенные типы тканей, в то время как клеточная и организменная реакция на протеотоксичность отслеживается с течением времени. Эта коллекция представляет собой набор инструментов для исследования и мониторинга протеостаза, оценки систем контроля качества, которые поддерживают свернутый протеом, и исследования дисрегуляции этих систем, которые приводят к заболеванию.