$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Кость представляет собой динамическую ткань, которая подвергается непрерывному ремоделированию, в котором участвуют резорбирующие кости остеокласты и костеобразующие остеобласты. Важно отметить, что эти процессы связаны с другими клетками, находящимися в пространстве костного мозга, такими как кроветворные клетки и адипоциты костного мозга. Разрыв костного обмена приводит к хрупкости скелета и последующему увеличению числа переломов1. Недавние исследования продемонстрировали важность метаболических субстратов и энергетического метаболизма для регуляции как костеобразования, так и резорбции костей 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17. Нацеливание на метаболические пути используется для лечения различных видов рака и может быть провокационным инструментом, который может быть применен для борьбы с различными состояниями, приводящими кувеличению частоты переломов. В связи с этим важно иметь полное представление о клеточном метаболизме во всех клетках костей. К сожалению, изучение костных клеток в их естественной среде является сложной задачей из-за их локализации в минерализованной ткани. По сравнению с неминерализованными тканями, необходимые этапы обработки кости затрудняют молекулярные и механистические исследования их метаболического статуса. Таким образом, эта коллекция направлена на освещение установленных методов, используемых для мониторинга метаболических путей в клетках, выделенных из их скелетной ниши.
«Остеоэнергетика» описывает метаболические процессы и биоэнергетический потенциал остеобластов и остается активной областью научного интереса и исследований. Однако, прежде чем клетки смогут вырабатывать и использовать АТФ, необходимо сначала получить энергетические субстраты. В трех статьях этой коллекции рассказывается о методах, используемых для мониторинга специфической судьбы субстрата в костных клетках. Во-первых, Шен и Карнерописывают методы оценки потребления аминокислот в культивируемых клетках in vitro или изолированных костях ex vivo. В системе in vitro культивируемые клетки ST2 инкубируют с L-[3,4-3 H]-глутамином в течение заданного времени, а поглощение глутамина количественно определяют с помощью сцинтилляционного счетчика. Аналогичным образом, в системе ex vivo кости, собранные у неонатальных мышей, инкубируются с радиоактивно мечеными аминокислотами, а поглощение аминокислот оценивается с помощью сцинтилляционного счетчика. Эти методы позволяют быстро и с высокой чувствительностью оценить поглощение аминокислот костными клетками или изолированными костями. Важно отметить, что эти методы легко модифицируются для оценки различных аминокислот или других энергетических субстратов и для проверки различных научных вопросов.
В дополнение к аминокислотам, глюкоза и длинноцепочечные жирные кислоты (LCFA) представляют собой плотный запас клеточной энергии или АТФ. В этом качестве ЛКЖК проникают в митохондрии через карнитинпальмитоилтрансферазу (CPTI/II), где они легко окисляются посредством β-окисления, а затем могут вступать в цикл трикарбоновой кислоты (ТСА) или окислительного фосфорилирования с образованием АТФ. Эта серия химических реакций в конечном итоге приводит к высвобождению углерода в виде газообразного углекислого газа (CO2), который трудно поддается количественной оценке. Song et al. и Kim et al. профессионально описывают два взаимосвязанных метода измерения метаболитов, образующихся в процессе окисления20,21. В обоих методах используется углеродная подложка с маркировкой 14C и фильтровальная бумага в качестве «улавливающего» инструмента для количественного определения высвобожденного 14CO2. Тем не менее, каждый метод одинаково важен, так как они описывают уникальные культуральные сосуды и методы нормализации данных. Кроме того, Song et al.20 описывают, как рассчитать окисление субстрата, в то время как Kim et al.21 включают дополнительный метод измерения кислоторастворимых метаболитов.
Эти исследования позволяют исследователю определить метаболическую судьбу различных субстратов. В дополнение к этому, Jayapalan et al.22 используют анализ метаболических потоков для мониторинга метаболических процессов, включая гликолиз и окислительное фосфорилирование через митохондриальное дыхание. Это оборудование в основном измеряет кислород и pH в живых клеточных культурах в режиме реального времени. Таким образом, культивируя первичные стромальные клетки костного мозга (BMSC) посредством дифференцировки остеобластов, можно проводить различные эксперименты при мониторинге метаболических путей23. Этот метод может быть выполнен с помощью четырех различных инъекций, что позволяет исследователям адаптировать эксперименты к конкретным научным вопросам, а также следовать стандартизированным протоколам, включая скорость АТФ, использование топлива/субстрата, митохондриальное дыхание и анализы гликолитической скорости. Наконец, поскольку многие из этих экспериментов носят механистический характер, крайне важно поддерживать однородную популяцию клеток без загрязнения другими типами клеток. Системы культивирования клеток in vitro , используемые для мониторинга метаболических процессов в клетках костей, имеют много ограничений. Guo и Wu24 предлагают отличный обзор ограничений, введенных во время стандартных культур BMSC, и предлагают подробный метод обогащения популяций стромальных клеток и минимизации гемопоэтического загрязнения с помощью гипоксии.
Таким образом, в этой коллекции демонстрируются методы мониторинга использования субстрата и биоэнергетической емкости в различных скелетных моделях как in vitro, так и ex vivo. Большинство этих методов выполняются с использованием систем клеточных культур и, следовательно, имеют ограничения из-за искусственной среды. Несмотря на то, что первичные клетки действительно обеспечивают более физиологичную систему, эти клетки часто культивируются с высоким содержанием кислорода в средах, содержащих избыточные концентрации метаболических субстратов, а иногда даже с загрязняющими клеточные популяции. Поэтому крайне важно, чтобы эти механистические эксперименты были подкреплены дополнительными данными in vivo. Тем не менее, эта захватывающая область исследований уже доказала свою полезность. В связи с этим продолжение характеристики «нормальных» и патологических метаболических процессов является перспективной научной нишей. Кроме того, изучение остеоэнергетики и метаболизма для понимания того, как, почему и когда костные клетки используют различные субстраты и какое влияние они оказывают на общее здоровье костей, открывает широкие возможности для терапевтических целей. С этой целью было обнаружено, что антирезорбтивные бисфосфонаты первого поколения (т.е. этидронат и клодронат), используемые для лечения остеопороза, влияют на энергию остеокластов. Эти широко назначаемые препараты представляют собой прекрасный пример того, как метаболические пути могут быть использованы для улучшения общего здоровья костей и улучшения качества жизни пациента. В дополнение к антирезорбтивным препаратам, существуют две одобренные FDA анаболические терапии, терипаратид и ромосозумаб, которые активируют пути PTH и WNT соответственно. Как ПТГ, так и WNT стимулируют поглощение и метаболизм глутамина в остеобластах 6,11,25,26. Подчеркивая терапевтическое значение этого, ингибирование активности метаболизма глютамина фармакологически или генетически снижает образование костей в ответ на лечение WNT или анаболической ПТГ 6,11. Таким образом, продолжение исследований для изучения метаболизма и биоэнергетики в костных клетках оправдано. Методы, описанные в этой коллекции, обеспечивают основу для решения различных научных вопросов, связанных с остеоэнергетикой и метаболизмом в костных клетках.