Методическая статья

3-D покадровая визуализация динамики клеточной стенки с использованием калькофтора в Моховом Фискомитриум Патенсе

DOI:

10.3791/64651

⸱

10 февраля 2023 г.

 , 
1Department of Biology, University of Louisville

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой рукописи представлен подробный протокол для изображения динамики 3-D клеточной стенки живой ткани мха, что позволяет визуализировать отслоение клеточных стенок у мутантов ggb и утолщение паттернов клеточных стенок в диком типе во время развития в течение длительного периода.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Покадровая визуализация с флуоресцентной микроскопией позволяет наблюдать динамические изменения роста и развития на клеточном и субклеточном уровнях. В целом, для наблюдений в течение длительного периода метод требует трансформации флуоресцентного белка; однако для большинства систем генетическая трансформация либо отнимает много времени, либо технически недоступна. В этой рукописи представлен протокол для 3-D покадровой визуализации динамики клеточной стенки в течение 3-дневного периода с использованием калькофторового красителя (который окрашивает целлюлозу в клеточную стенку растения), разработанного во мхе Physcomitrium patens. Сигнал калькофторового красителя от клеточной стенки стабилен и может длиться в течение 1 недели без явного распада. С помощью этого метода показано, что отслойка клеток у мутантов ggb (при которой выбавливается бета-субъединица белка геранилгеранилтрансферазы-I) вызвана нерегулируемым расширением клеток и дефектами целостности клеточной стенки. Кроме того, паттерны окрашивания калькфтором меняются с течением времени; менее интенсивно окрашенные области коррелируют с будущими участками расширения/ветвления клеток в диком типе. Этот метод может быть применен ко многим другим системам, которые содержат клеточные стенки и которые могут быть окрашены калькофтором.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клеточные стенки растений претерпевают динамические изменения при расширении и развитии клеток 1,2,3. Поддержание целостности клеточной стенки имеет решающее значение для адгезии растительных клеток во время роста и развития, а также для реакции на сигналы окружающей среды. Хотя визуализация динамики клеточной стенки живых клеток в течение длительного периода времени имеет решающее значение для понимания того, как клеточная адгезия поддерживается во время развития и адаптации к изменениям окружающей среды, современные методы непосредственного наблюдения динамики клеточной стенки все еще сложны.

Покадровая визуализация клеточных изменений может обеспечить информативную динамику развития организма с помощью флуоресцентного микроскопа высокого разрешения 4,5,6,7. В то время как покадровая 3D-визуализация имеет большой потенциал для изучения динамических изменений формы клеток во время роста и развития, метод обычно требует преобразования флуоресцентного белка 4,5,6,7. Однако для большинства систем генетические трансформации либо отнимают много времени, либо технически сложны. В качестве альтернативы уже давно доступны флуоресцентные красители, которые прикрепляются к клеточным компонентам. Флуоресцентные красители могут излучать флуоресцентный свет после облучения светом определенной длины волны. Распространенными примерами являются Edu, DAPI, PI, FM4-64 и кальцифтор белый 8,9,10. Одним из основных недостатков, однако, является то, что эти красители обычно могут использоваться только в фиксированной ткани или для коротких экспериментов, отчасти из-за вреда, который они наносят клетке 8,9,10.

Согласно протоколу, представленному здесь, сигналы калькофтора стабильны, когда белый калькофтор смешивается в среде во время покадровых экспериментов во мхе P. patens. Используя этот метод, отслоение клеток у мутантов ggb с использованием 3-D покадровой визуализации наблюдалось в течение 3-дневного периода3 (рисунок 1). Этот метод может быть применен ко многим другим системам, которые содержат клеточные стенки и которые могут быть окрашены калькофтором.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Список материалов и оборудования см. в Таблице материалов , а в Таблице 1 - список решений, которые будут использоваться в настоящем протоколе.

1. Подготовка растений для стеклянной нижней посуды

  1. Выращивайте протонемальную ткань мха в агаровой среде BCDAT в чашке Петри 13 см при постоянном белом свете (~50 мкмоль м-2 с-1) в течение 7 дней при 25 °C в камере роста.
  2. Фильтруют-стерилизуют калькофтор белого цвета и хранят при 4 °C до использования. Реагент стабилен в течение нескольких месяцев.
  3. Диспергируйте 7-дневную ткань мха в микропробирку объемом 1,5 мл, содержащую 20 мкл стерилизованной воды. Убедитесь, что протонемальная ткань мха достаточно диспергирована в виде небольших кусочков в воде. Для дикого типа (WT) используйте щипцы для отделения протонематы; для мутанта ggb используйте пипетку P-1000.
  4. Добавьте 10 мкл стерилизованного белого калькофтора в микропробирку объемом 1,5 мл и оставьте микротрубку вертикально в капюшоне на 2 мин для окрашивания.
  5. Сразу после окрашивания смешайте растения с 200 мкл охлажденного BCDATG, содержащего среду BCDAT, дополненную 0,5% (мас./об.) глюкозы и 0,4% (мас./об.) геллановой камеди, путем пипетки P-1000 пять раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что среда BCDATG достаточно охлаждена (непосредственно перед затвердеванием среды), чтобы избежать стресса для растений.
  6. Переложите смесь, содержащую растения и среду BCDATG, в стеклянную базовую посуду диаметром 27 мм. Убедитесь, что объем BCDATG для смешивания клеток составляет не более 200 мкл и что 200 мкл BCDATG с образцами равномерно распределены по поверхности стеклянной нижней тарелки 7 мм для получения тонкого слоя пленки, так что образцы находятся в пределах объективного рабочего расстояния во время визуализации.
  7. После затвердевания в течение 2 мин при комнатной температуре накройте тонкий слой 3 мл охлажденного BCDATG и дайте ему затвердеть в течение 10 мин, чтобы снова затвердеть.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что этапы 1.2-1.5 проводятся в стерильной вытяжке во избежание загрязнения.
  8. На дне тарелки нарисуйте по девять линий в параллельном и перпендикулярном направлениях (рисунок 2). Пометьте строки символами от a до h и отметьте столбцы цифрами от 1 до 8. Используйте верхнюю, нижнюю, правую, среднюю и левую стороны, чтобы отметить позиции в пределах каждого квадрата. Например, если растение находится в квадрате во втором ряду и шестом столбце и расположено в верхней левой части квадрата, то этому растению дается название «b6_upper_left».
  9. Предварительно культивируйте стеклянную нижнюю посуду, содержащую растения под красным светом в течение 5 дней при 25 °C в камере роста, а затем под белым светом в течение 1-2 дней, прежде чем подвергаться покадровой визуализации каждый день в течение 3 дней. Для WT прекультуру растений в слабом красном свете (0,5 мкмоль m-2 s-1) сверху в течение 5 дней индуцировать фототропный ответ протонемата, чтобы растения могли прикрепляться к нижней части посуды11.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слабый красный свет обеспечивается путем пропускания белого света через красный акриловый пластиковый фильтр толщиной 3 мм в светонепроницаемые коробки. Для мутантов ggb предварительная обработка в красный свет является необязательной, так как мутанты ggb не имеют фототропного ответа3.

2. Визуализация и 3D-реконструкция

  1. Поместите стеклянную нижнюю тарелку, содержащую растения, на сцену перевернутого конфокального микроскопа, со стеклянным дном, обращенным к цели. Используйте конфокальный микроскоп для визуализации калькофтора с объективом 20x. Делайте снимки с помощью лазера 405 нм, точечного отверстия при 1,0, усиления HV при 100, регулировки смещенного фона при 0, мощности лазера при 5%-7%, размера сканирования 1,024 x 1,024 и скорости сканирования 1/2 кадра/с. Соберите оптические секции 17-30 z-серии с размером шага 1,0 мкм. Назовите изображения с помощью кода на шаге 1.6, например "b6_upper_left-day0", и сохраните.
    1. Выберите канал DAPI в разделе Приобретение и установите флажок Z в ND Acquisition. Чтобы установить нижний и верхний пределы для Z-стека, нажмите кнопки Сверху и Снизу .
  2. Чтобы восстановить 3D-изображения, откройте файл .nd2 (рисунок 3A; см. Таблица материалов) и щелкните Том (Рисунок 3B).

3. Визуализация одних и тех же растений в разные моменты времени

  1. После каждого снимка поместите стеклянную базовую тарелку обратно в камеру роста.
  2. Повторите шаг 2.1 для визуализации и 3D-реконструкции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы найти те же растения, используйте код, упомянутый на шаге 1.6, и дайте название «b6_upper_left-day1» или «b6_upper_left-day2» в зависимости от возраста растений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод позволяет наблюдать динамику клеточной стенки во время развития у мутантов дикого типа и ggb (рисунок 1). Результаты показали, что области с меньшим утолщением клеточной стенки коррелируют с участками расширения/ветвления клеток, что позволяет прогнозировать участки расширения/ветвления в диком типе (рисунок 1А). Поверхность клеточных стенок у мутантов ggb была разорвана во время развития из-за неконтролируемого расширения клеток

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Покадровая 3D-реконструкция, или 4-D визуализация, является мощным инструментом для наблюдения за динамикой клеточной морфологии во время процессов развития. В этом протоколе, путем смешивания белого калькофтора в среде, динамика морфологии 3-D клеток может наблюдаться у мха P. patens. Используя этот метод, мы наблюдали, что поверхность клеточных стенок у мутантов ggb разрывается на части во время развития3. Кроме того, уменьшенное утолщение клеточных стенок коррелирует с участка...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих или финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят доктора Суси Патрисию и Бетти Нанн из Университета Луисвилля за помощь с конфокальным микроскопом. Эта работа финансировалась Национальным научным фондом (1456884 до M.P.R.) и Соглашением о сотрудничестве Национального научного фонда (1849213 m.P.R.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Красный пластиковый светофильтр толщиной 3 мм  Mitsubishi  No.102
Стеклянное основание диаметром 27 мм Иваки3930-035
Агар  SigmaA6924
Calcofluor белый  Sigma18909-100ML-FCalcofluor белый M2R, 1 г/л и синий Эванса, 0,5 г/л
Конфокальный микроскоп Nikon Программное обеспечение A1

NIS element; файл .nd2 в NIS-elements Viewer, скачать с https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/en_AOM/products/software/nis-elements/viewer

Флуоресцентный микроскоп Nikon TE200 Оснащен камерой DS-U3;
Геллановая камедь Nacali Tesque12389-96
Камеры для выращивания растенийSANYO Sanyo MLR-350H
Стерилизованный шприц 0.22 μ m фильтрMilliporeSLGV033RS

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
  2. Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. Cell wall integrity maintenance during plant development and interaction with the environment. Naure Plants. 5 (9), 924-932 (2019).
  3. Bao, L., et al. The cellular function of ROP GTPase prenylation important for multicellularity in the moss Physcomitrium patens. Development. 149 (12), (2022).
  4. Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
  5. Fang, Y., Spector, D. L. Live cell imaging of plants. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), (2010).
  6. Goh, T. Long-term live-cell imaging approaches to study lateral root formation in Arabidopsis thaliana. Microscopy. 68 (1), 4-12 (2019).
  7. Hamant, O., Das, P., Burian, A. Time-lapse imaging of developing shoot meristems using a confocal laser scanning microscope. Methods in Molecular Biology. 1992, 257-268 (2019).
  8. Rigal, A., Doyle, S. M., Robert, S. Live cell imaging of FM4-64, a tool for tracing the endocytic pathways in Arabidopsis root cells. Methods in Molecular Biology. 1242, 93-103 (2015).
  9. Yagi, N., et al. Advances in synthetic fluorescent probe labeling for live-cell imaging in plants. Plant & Cell Physiology. 62 (8), 1259-1268 (2021).
  10. Whitewoods, C. D., et al. CLAVATA was a genetic novelty for the morphological innovation of 3D growth in land plants. Current Biology. 28 (15), 2365-2376 (2018).
  11. Bao, L., et al. A PSTAIRE-type cyclin-dependent kinase controls light responses in land plants. Science Advances. 8 (4), 2116(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Calcofluor StainingFluorescence Microscopy3D ImagingCell ExpansionCell Wall IntegrityPlant Cell WallProtonemata Separation

Похожие статьи