Методическая статья

Система Zerio Tol2: модульный и гибкий подход к трансгенезу на основе шлюза

DOI:

10.3791/64679

⸱

30 ноября 2022 г.

 ,  , 
1Alcohol Research Center, Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Louisville

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой работе описывается протокол модульной системы трансгенеза Tol2, метода клонирования на основе шлюза для создания и введения трансгенных конструкций в эмбрионы рыбок данио.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Расстройства алкогольного спектра плода (FASD) характеризуются сильно варьирующимся набором структурных дефектов и когнитивных нарушений, которые возникают из-за пренатального воздействия этанола. Из-за сложной патологии ФАСН животные модели оказались критически важными для нашего нынешнего понимания дефектов развития, вызванных этанолом. Рыбки данио-рерио оказались мощной моделью для изучения дефектов развития, вызванных этанолом, из-за высокой степени сохранения как генетики, так и развития между рыбками данио-рерио и людьми. Как модельная система, рыбки данио-рерио обладают многими атрибутами, которые делают их идеальными для исследований развития, включая большое количество внешне оплодотворенных эмбрионов, которые генетически поддаются обработке и полупрозрачны. Это позволяет исследователям точно контролировать время и дозировку воздействия этанола в нескольких генетических контекстах. Одним из важных генетических инструментов, доступных у рыбок данио, является трансгенез. Однако создание трансгенных конструкций и установление трансгенных линий может быть сложным и трудным. Чтобы решить эту проблему, исследователи рыбок данио-рерио создали систему трансгенеза Tol2 на основе транспозонов. Эта модульная система использует многосайтовый подход клонирования шлюза для быстрой сборки полных трансгенных конструкций на основе транспозонов Tol2. Здесь мы описываем гибкий набор инструментов системы Tol2 и протокол для создания трансгенных конструкций, готовых к трансгенезу рыбок данио, и их использования в исследованиях этанола.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пренатальное воздействие этанола приводит к континууму структурных дефицитов и когнитивных нарушений, называемых расстройствами алкогольного спектра плода (FASD)1,2,3,4. Сложные взаимосвязи между несколькими факторами затрудняют изучение и понимание этиологии ФАСН у людей. Для решения этой проблемы были использованы самые разные модели животных. Биологические и экспериментальные инструменты, доступные в этих моделях, оказались решающими в развитии нашего понимания механистической основы тератогенности этанола, и результаты этих модельных систем удивительно согласуются с тем, что было обнаружено в исследованиях этанола на людях 5,6. Среди них рыбки данио-рерио стали мощной моделью для изучения тератогенезаэтанола 7,8, отчасти из-за их внешнего оплодотворения, высокой плодовитости, генетической обрабатываемости и полупрозрачных эмбрионов. Эти сильные стороны в совокупности делают рыбок данио-рерио идеальными для исследований ФАСН в реальном времени с использованием трансгенных линий рыбок данио.

Трансгенные рыбки данио-рерио широко используются для изучения многочисленных аспектов эмбрионального развития9. Однако создание трансгенных конструкций и последующих трансгенных линий может быть чрезвычайно трудным. Стандартный трансген требует активного промоторного элемента для управления трансгеном и поли-А-сигнала или «хвоста», и все это в стабильном бактериальном векторе для общего поддержания вектора. Традиционная генерация многокомпонентной трансгенной конструкции требует нескольких трудоемких этапов субклонирования10. Подходы, основанные на ПЦР, такие как сборка Гибсона, могут обойти некоторые проблемы, связанные с субклонированием. Тем не менее, уникальные праймеры должны быть разработаны и испытаны для генерации каждой уникальной трансгенной конструкции10. Помимо конструирования трансгенов, геномная интеграция, передача зародышевой линии и скрининг на надлежащую интеграцию трансгенов также были затруднены. Здесь мы описываем протокол использования системы трансгенеза Tol2 на основе транспозонов (Tol2Kit)10,11. Эта модульная система использует многосайтовое клонирование шлюза для быстрого создания нескольких трансгенных конструкций из постоянно расширяющейся библиотеки векторов «входа» и «назначения». Интегрированные переносимые элементы Tol2 значительно увеличивают скорость трансгенеза, обеспечивая быстрое построение и геномную интеграцию нескольких трансгенов. Используя эту систему, мы показываем, как генерация трансгенной линии эндодермы данио-рерио может быть использована для изучения тканеспецифических структурных дефектов, лежащих в основе FASD. В конечном счете, в этом протоколе мы показываем, что модульная установка и построение трансгенных конструкций значительно помогут исследованиям ФАСН на основе рыбок данио.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эмбрионы рыбок данио, используемые в этой процедуре, были выращены и разведены в соответствии с установленными протоколами IACUC12. Эти протоколы были одобрены Университетом Луисвилля.

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовались штамм рыбок данио-рерио дикого типа, AB, и двойная мутантная линия bmp4st72; smad5b1100 . Вся вода, используемая в этой процедуре, была стерильной водой обратного осмоса. Конфокальные изображения были получены под лазерно-сканирующим конфокальным микроскопом. Измерения энтодермы были сделаны с помощью инструмента измерения в ImageJ. Все статистические анализы проводились с использованием статистического программного обеспечения.

1. Создание решений и медиа

  1. Бактериальная среда: растворите бульон или агар LB в соответствии с инструкциями производителя и автоклав. Перед заливкой среды в чашки Петри диаметром 100 мм добавляют ампициллин (50 мкг/мл), канамицин (50 мкг/мл) или комбинацию ампициллина/хлорамфеникола (50 мкг/мл и 30 мкг/мл соответственно).
  2. Чтобы получить 20-кратный запас эмбриональных сред, растворите в 1 л воды: 17,5 г NaCl, 0,75 г KCl, 2,9 г CaCl2, 0,41 г K 2 HPO 4, 0,142 г Na 2 HPO 4 и 4,9 г MgSO4·7H2O. Фильтруйте исходный раствор с помощью вакуумной фильтрующей системы0,22 мкм, и хранить при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не обращайте внимания на образующийся белый осадок; Это не повлияет на СМИ.
  3. В 19 л воды растворяют 1,2 г NaHCO3 и добавляют 1 л 20-кратного запаса эмбриональной среды для получения рабочего раствора среды эмбриона и поддерживают этот раствор при 28 °C.
  4. Для получения 2% раствора фенолового красителя растворите 20 мг фенольной красной натриевой соли в 1 мл воды, не содержащей РНКазы, и храните при комнатной температуре.

2. Формы для литья эмбрионов под давлением

  1. Чтобы сделать пластину для инъекций агарозы, растворите агарозу в среде эмбриона до конечной концентрации 3% путем нагревания до кипения.
  2. Налейте 50 мл агарозы в чашки Петри диаметром 100 мм и, пока агароза еще жидкая, аккуратно поместите форму для литья под давлением в агарозу, чтобы предотвратить образование пузырьков под формой.
  3. Дайте агарозным пластинкам остыть. Как только агароза затвердеет, снимите форму для литья под давлением и храните при температуре 4 °C до использования.

3. Инъекционные пипетки

  1. Протяните капилляры диаметром 1,0 мм (OD), содержащие нить, в иглы с помощью вертикального съемника пипетки с соленоидом, установленным на 2,5, и нагревательным элементом, установленным на 14,6.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Любой съемник с подогревом будет работать, если он чисто и равномерно втягивает капилляры в две иглы, но иглы для инъекций необходимо вытащить в течение 1 недели после инъекции эмбрионов рыбок данио-рерио для получения стабильных результатов инъекции.
    1. Поместите капилляр в съемник, затяните зажим на каждом конце, а затем активируйте нагревательный элемент.
    2. Потяните за капилляры, чтобы создать две инъекционные иглы.
    3. Извлеките капилляры из съемника и храните их в пустой чашке Петри с полоской пластилина, которая действует как держатель иглы.

4. Транспозазная подготовка мРНК

  1. Линеаризируют плазмиду, содержащую транспозазу Tol2Kit, с рестрикционной эндонуклеазой NotI, комбинируя в микроцентрифужной пробирке объемом 0,5 мл: 10 мкл транспозазной плазмиды (150 нг/мкл), 1,5 мкл рестрикционного реакционного буфера эндонуклеазы, 0,3 мкл эндонуклеазы NotI.
  2. Залейте реакцию до 20 мкл водой, не содержащей РНКазы, а затем смешайте и переварите при 37 °C в течение ночи.
  3. Остановите транспозазное расщепление, добавив 1 мкл 0,5 М ЭДТА (рН 8,0), 2 мкл 5 М NH4OAc и 80 мкл 100% EtOH в реакцию пищеварения, а затем смешайте и охладите при -20 ° C в течение ночи.
  4. Центрифугируют раствор при 14 000x g в течение 20 мин при 4 °C, а затем аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулу ДНК в воде, не содержащей РНКазы.
  5. Определите концентрацию линейной плазмиды в нанограммах на микролитр (нг / мкл) с помощью флуорометра, сначала запустив 2 мкл чистой воды, не содержащей РНКазы, а затем запустив 2 мкл линеаризованной плазмиды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации плазмид обычно колеблются в пределах 100-200 нг/мкл
  6. Настройте производство мРНК SP6, объединив следующие компоненты по порядку в микроцентрифужной пробирке объемом 0,5 мл: 10 мкл 2x NTP/CAP, 2 мкл 10-кратного реакционного буфера, 0,1-1 мкг линейной матрицы ДНК и 2 мкл смеси ферментов SP6.
  7. Залейте реакцию до 20 мкл водой, не содержащей РНКазы, а затем перемешайте и инкубируйте при 37 °C в течение 2 ч.
  8. После инкубации в течение 2 ч добавляют 1 мкл ДНКазы, хорошо перемешивают и инкубируют еще 15 мин при 37 °C.
  9. Чтобы остановить реакцию SP6, добавьте 30 мкл осажденного раствора LiCl в реакционную пробирку, а затем перемешайте и охладите при -20 ° C в течение ночи.
  10. Центрифугируют раствор при 14 000 x g в течение 20 мин при 4 ° C, чтобы гранулировать мРНК, а затем аспирируют надосадочную жидкость и промывают гранулы мРНК 1 мл 80% EtOH (разбавленной водой, не содержащей РНКазы).
  11. Центрифугируют раствор при 14 000 x g в течение 20 мин при 4 ° C для гранулирования мРНК, а затем аспирируют надосадочную жидкость. Дайте гранулам высохнуть на воздухе.
  12. Ресуспендировать гранулу мРНК в 20 мкл воды, не содержащей РНКазы, определить концентрацию мРНК в нанограммах на микролитр (нг/мкл) с помощью флуорометра, как описано на шаге 4.5 (должно быть не менее 100 нг/мкл), аликвотировать 100 нг мРНК на пробирку для одноразового использования и хранить при -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы убедиться, что мРНК не разлагается, 2 мкл мРНК можно быстро запустить на геле для электрофореза ДНК, чтобы подтвердить одну полосу со скоростью 1,950 бит / с.

5. Клонирование Multisite Gateway для создания векторов входа для трансгенеза

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол модифицирован из Kwan et al.10, при этом реакция LR записана как реакция полуLR и имеет общий объем 5 мкл. Для генерации новых входных элементов необходимо использовать реакции АД с использованием 5', средних и 3'-донорных векторов10,13.

  1. Чтобы выполнить реакцию, соберите по 10 фмолей p5E, pME и p3E и 20 фмоль целевого вектора (pDest).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мультисайтальная рекомбинация LR использует четыре различных плазмидных вектора: 5'-вектор входа (p5E), средний вектор входа (pME), 3'-вектор входа (p3E) и вектор назначения (pDest) для создания уникальной трансгенной конструкции, окруженной повторами Tol2, готовыми к введению эмбрионам рыбок данио.
    1. Определите размер всех четырех векторов в парах оснований из источника плазмиды (Таблица 1, Tol2Kit Wiki стр.14 или Addgene11; см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для новых векторов полное секвенирование плазмиды с помощью коммерческих компаний, занимающихся секвенированием, может обеспечить точный размер плазмиды в битах / с .
    2. Определите концентрацию всех четырех векторов в нанограммах на микролитр (нг/мкл) с помощью флуорометра, как описано на шаге 4.5.
    3. Используя вес ДНК 660 г/моль и размер плазмиды (в битах / с), рассчитайте общее количество нанограммов (нг) плазмиды, необходимое для достижения либо 10 фмоль (входные векторы), либо 20 фмоль (целевой вектор).
      figure-protocol-1
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лаборатория Мосимана в Университете Колорадо, медицинский кампус Аншутц, создала свободно доступную электронную таблицу для расчета необходимого количества плазмиды (в нг) и объема (в мкл) векторов, необходимых в реакцииLR 15.
  2. Чтобы сгенерировать описанную ниже конструкцию sox17:EGFPCAAX, используйте следующие векторы: вектор p5E, содержащий промотор sox17 рыбок данио, который составляет 6,918.н. в размере16; вектор pME, содержащий пренилированный EGFP, который составляет 3,345.н. в размере10; вектор p3E, содержащий сигнальную последовательность позднего поли А SV40, которая составляет 2,838.н. в размере10; и pDest, который составляет 5,883.н. в размере10.
  3. Используя концентрацию плазмиды, определенную на шаге 5.1.2, и количество в нанограммах (нг) для каждого вектора (этап 5.1.3), вычислите общее количество микролитров (мкл) каждой плазмиды, необходимое для достижения либо 10 фмоль (входные векторы), либо 20 фмоль (целевой вектор), а затем разделите это на два для использования в 5 мкл полу-LR-реакциях (все значения, перечисленные ниже, перечислены в таблице 2).
    figure-protocol-2
    1. Чтобы получить 10 фмоль p5E-sox17, используйте 45,66 нг (при концентрации 140,3 нг/мкл) и разбавьте стерильной водой в 4 раза, чтобы получить 0,65 мкл.
    2. Чтобы получить 10 фмоль pME-EGFPCAAX, используйте 22,08 нг (при концентрации 213,5 нг / мкл) и разбавьте стерильной водой в 10 раз, чтобы получить 0,52 мкл.
    3. Чтобы получить 10 фмоль p3E-поли А, используйте 15,73 нг (при концентрации 276,1 нг/мкл) и разбавьте стерильной водой в 20 раз, чтобы получить 0,57 мкл.
    4. Для 20 фмоль целевого вектора используйте 77,66 нг pDest (при концентрации 307,3 нг/мкл) и разбавьте стерильной водой в 5 раз, чтобы получить 1,63 мкл.
  4. Чтобы начать реакцию полу-LR объемом 5 мкл, объедините объемы p5E, pME, p3E и pDest, определенные на шаге 5.3, в микроцентрифужной пробирке объемом 0,5 мл, а затем добавьте стерильную воду для достижения общего объема реакции 4 мкл.
  5. Энергично перемешивайте смесь ферментов LR 2 раза в течение 1 минуты каждая, чтобы обеспечить правильное перемешивание, а затем добавьте 1 мкл в реакцию и тщательно перемешайте.
  6. Инкубировать при 25 °C в течение ночи (16+ ч).
  7. Остановите реакцию LR, добавив 0,5 мкл протеиназы K (2 мкг/мкл), инкубируйте при 37 °C в течение 10 мин, а затем охладите до комнатной температуры.
  8. Превратите 3-4 мкл плазмиды в размороженные, химически компетентные клетки, добавив плазмиду и оставив клетки на льду в течение 25-30 минут.
  9. Пока клетки сидят на льду, нагрейте две пластины с ампициллиновым агаром LB до комнатной температуры.
  10. Термический шок клеток на водяной бане при температуре 42 °C в течение 30 секунд.
  11. После теплового шока добавьте в клетки 250 мкл жидкой среды, не содержащей антибиотиков, и инкубируйте при встряхивании при 37 ° C в течение 1,5 ч.
  12. Распределите 300 мкл бактерий на одной пластине ампициллина и инкубируйте при 37 ° C в течение ночи.
  13. На следующее утро проверьте колонии на наличие двух фенотипов, прозрачного и непрозрачного, соберите прозрачные колонии (как описано в Kwan et al.10) по одному, инокулируйте жидкую культуру, а затем встряхните при 37 ° C на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прозрачные колонии почти всегда содержат правильную колонию LR (>85% времени).
  14. Используя коммерческий набор в соответствии с инструкциями производителя, выполните подготовку плазмиды на каждой жидкой культуре и диагностическое переваривание каждой плазмиды, чтобы подтвердить соответствующий размер трансгенной конструкции, что указывает на то, что реакция шлюза LR работала должным образом.
  15. Повторно трансформируют правильные трансгенные конструкции с использованием стандартного протокола бактериальной трансформации, как описано на этапах 5.4-5.12, используя 0,5-1 мкл плазмиды, и инкубируют только при 37 °C в течение 1 часа.
  16. Повторно проведите полосы колоний и убедитесь, что каждая из них имеет трансгенную конструкцию LR, как показано на шаге 5.14.
  17. Определите концентрацию плазмиды, как описано на шаге 4.5 (для инъекции эмбриона необходимо не менее 150 нг/мкл).

6. Введение трансгена эмбрионам

  1. Разморозьте одноразовый образец мРНК транспозазы и трансгенную конструкцию Tol2 на льду и предварительно предупредите пластину для инъекций агарозы до комнатной температуры.
  2. Смешайте на льду: 150 нг плазмиды, 100 нг мРНК транспозазы и 2% фенол красный (0,3 мкл). Затем добавьте воду, не содержащую РНК, чтобы увеличить объем до 3 мкл.
  3. Перенесите эмбрионы на одной клеточной стадии с помощью пипеток для переноса на инъекционную пластину (описанную на этапе 2), заполненную ЭМ, полностью покрывающую агар, а затем осторожно прижмите примерно 50-75 эмбрионов в прорезь инъекционной пластины.
  4. Добавьте смесь мРНК/плазмиды/фенольного краса к открытому концу иглы для капиллярной инъекции, поместите капиллярную иглу в арматуру установки для инъекций и включите установку для инъекций.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Установка для впрыска использует сжатый газ, такой как воздух, для импульсного импульса желаемого объема (описанного на шаге 6.5) смеси мРНК/плазмид/фенол-красавица в эмбрион при активации.
  5. Опустите капиллярную иглу в ЭМ инъекционной пластины и сломайте наконечник с помощью щипцов, чтобы позволить откачать только небольшое количество смеси мРНК / плазмиды / фенола с помощью инъекционной установки.
  6. Вводят эмбрионам небольшой болюс 3 нл смеси мРНК/плазмид/фенол красный в тело клетки эмбриона.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Болюс 3 нл представляет собой объем смеси мРНК / плазмиды / фенола, при котором семь болюсов теоретически могут одинаково поместиться по средней линии эмбриона.
  7. Когда закончите инъекцию эмбрионов, удалите их из инъекционной пластины, осторожно вытащив их из прорези и перенеся пипеткой в 100-миллиметровую чашку Петри со свежим ЭМ (примерно 40 мл), а затем инкубируйте при 28,5 ° C, чтобы эмбрионы могли развиваться.

7. Скрининг эмбрионов для трансгенной вставки

  1. Для экспрессии флуоресцентных белков выберите соответствующую стадию развития, когда флуоресцентный трансген должен быть экспрессирован, и проведите скрининг на наличие флуоресценции под флуоресцентным препарирующим микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти эмбрионы будут мозаичными в своей экспрессии и покажут геномную вставку трансгенной конструкции.
  2. Скрининг на наличие нефлуоресцентных трансгенов путем скрининга флуоресцентного трансгенного маркера (как описано на шаге 7.1), такого как GFP, управляемый кардиоспецифическим промотором гена cmlc2 , или mCherry, управляемый хрусталиком-специфическим промотором αcyrstallin, которые содержатся в различных векторах назначения.
  3. Позвольте эмбрионам, положительным для трансгенной вставки, полностью развиться до стадии взрослых рыбок данио.
  4. Как только потенциальные трансгенные рыбы достигнут возраста размножения, проверьте их индивидуально как на передачу зародышевой линии, так и на экспрессивность трансгенов, скрещивая их с рыбками данио-рерио дикого типа.
  5. Те взрослые особи, чьи эмбрионы развиваются нормально и дают самую сильную и наиболее подходящую экспрессию трансгенов, сохраняются в качестве уникальных трансгенных линий рыбок данио-рерио для будущей работы и анализов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативного подхода к скринингу геномной вставки трансгенных конструкций разработайте праймеры ПЦР, которые амплифицируют только трансгенную конструкцию, а не ДНК дикого типа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для генерации трансгенных конструкций мы использовали систему трансгенеза Tol2. Три входных вектора, в том числе p5E, который содержит элементы промотора/энхансера гена, pME, который удерживает ген, экспрессируемый элементами промотора/энхансера, и p3E, который, как минимум, удерживает хвост полиА, были использованы для создания трансгенной конструкции с помощью клонирования LR с несколькими сайтами. Вектор назначения, pDest, обеспечивает повторы Tol2 для геномной вставки трансгенной конструкции в эмбрионы рыбок...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рыбки данио-рерио идеально подходят для изучения влияния воздействия этанола на развитие и болезненные состояния 7,8. Рыбки данио-рерио производят большое количество полупрозрачных, оплодотворенных, генетически обрабатываемых эмбрионов, что позволяет одновременно визуализировать в реальном времени несколько тканей и типов клеток, меченных трансгенами, в различных контекстах окружающей среды19,20. Эти силь...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам раскрывать нечего.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование, представленное в этой статье, было поддержано грантом Национального института здравоохранения / Национального института по борьбе со злоупотреблением алкоголем (NIH / NIAAA) R00AA023560 для C.B.L.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Addgene Tol2 toolboxhttps://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/
AirПредоставлено непосредственно университетом
AmpicillinFisher ScientificBP1760
Аналитические весыVWR10204-962
Borosil 1,0 мм OD x 0,75 мм ID КапиллярFHC30-30-0
Хлорид кальцияVWR97062-590
ХлорамфениколBioVision2486
Флуоресцентный препарирующий микроскоп
КанамицинFisher ScientificBP906
Fluoview FV1000
Lawson Lab Препарат для донорской плазмидыhttps://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/
LB АгарФишер СайнфикалBP9724
LB БульонФишер СайнтикалBP1426
Низкоээо/Многоцелевой/Молекулярно-биологический класс АгарозаФишер СайнфикBP160-500
LR Clonase II Plus ФерментFisher Scientific12538200
сульфата магния (гептагидрат)Fisher ScientificM63-500
Прикладная научная аппаратураMIMPH-M-PIP
Микроцентрифужная трубка 0,5 мл VWR10025-724
Микроцентрифужная пробирка 1,5 мл VWR10025-716
МикроманипуляторПрикладная научная аппаратураMM33
Наконечники для микропипеток 10 μ Л Fisher Scientific13611106
Наконечники для микропипеток 1000 μ Л Fisher Scientific13611127
Наконечники для микропипеток 200 μ Л Fisher Scientific13611112
mMESSAGE mMACHINE SP6 Набор для транскрипцииFisher ScientificAM1340
Mosimann Lab Tol2 Расчетный листhttps://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1
NanoDrop СпектрофотометрNanoDropND-1000
NcoINEBR0189S
NotINEBR0189S
Чашки Петри 100 мм Fisher ScientificFB012924
Фенол Красная натриевая сольSigma AldrichP4758-5G
Pipetman L p1000L МикропипеткаGilsonFA10006M
Pipetman L p200L МикропипеткаGilsonFA10005M
Pipetman L p2L МикропипеткаGilsonFA10001M
хлорид калияFisher ScientificP217-500
Фосфат калия (двухосновный)VWRBDH9266-500G
Инжектор давленияПрикладные научные приборыMPPI-3
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106
Бикарбонат натрияVWRBDH9280-500G
Хлорид натрияFisher ScientificS271-500
фосфат натрия (двухосновный)Fisher ScientificS374-500
Stericup .22 &m; m Вакуумная система фильтрации MilliporeSCGPU11RE
tol2 WikiСтраница http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page
Топ10 химически компетентных E. coliFisher ScientificC404010
Вертикальный пуллер пипеттеровDavid Kopf Instruments720
Форма для микровпрыска данио-рериоAdaptive Science Toolsi34
EDTA Fisher Scientific BP118-500 Olympus SZX16 Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп Olympus Держатель микропипетки

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Denny, L., Coles, S., Blitz, R. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders. American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).
  2. Popova, S., et al. Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).
  3. Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment. Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).
  4. Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder. The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).
  5. Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93(2014).
  6. Lovely, C. B. Animal models of gene-alcohol interactions. Birth Defects Research. 112 (4), 367-379 (2020).
  7. Fernandes, Y., Lovely, C. B. Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders. Genesis. 59 (11), 23460(2021).
  8. Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
  9. Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Animal Research. 37 (1), 26(2021).
  10. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  11. Don, E. K., et al. A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease. Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregan. (2000).
  13. Protocols. UMass Chan Medical School. , Available from: https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols (2017).
  14. The Tol2Kit. , Available from: http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page (2007).
  15. Mosimann, C. Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet. protocols.io. , (2022).
  16. Chung, W. -S., Stainier, D. Y. R. Intra-endodermal interactions are required for pancreatic β cell induction. Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).
  17. Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).
  18. Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish. Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).
  19. Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Science of The Total Environment. 848, 157665(2022).
  20. Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches. Aquatic Toxicology. 234, 105813(2021).
  21. Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109 (3), 577-584 (1988).
  22. Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103 (2), 403-412 (1990).
  23. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  24. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  25. Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system. Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Tol2zebrafishGatewayzebrafish

Похожие статьи