Технологии CRISPR-Cas произвели революцию в области редактирования генома. Тем не менее, поиск и изоляция желаемого редактирования зародышевой линии остается основным узким местом. Таким образом, в этом протоколе описывается надежный метод быстрого скрининга сперматозоидов рыбок данио, вводимых с помощью F0 CRISPR, на предмет редактирования зародышевой линии с использованием стандартных методов ПЦР, рестрикционного дайджеста и гель-электрофореза.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Скрининг сперматозоидов для быстрого выделения изменений зародышевой линии у рыбок данио-рерио
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Появление целевых нуклеазных технологий CRISPR-Cas произвело революцию в способности выполнять точное редактирование генома как в устоявшихся, так и в новых модельных системах. Системы редактирования генома CRISPR-Cas используют синтетическую направляющую РНК (sgRNA) для нацеливания CRISPR-ассоциированной (Cas) эндонуклеазы на конкретные локусы геномной ДНК, где эндонуклеаза Cas генерирует двухцепочечный разрыв. Восстановление двухцепочечных разрывов внутренними механизмами, подверженными ошибкам, приводит к вставкам и/или делециям, нарушая локус. В качестве альтернативы, включение двухцепочечных доноров ДНК или одноцепочечных олигонуклеотидов ДНК в этот процесс может вызвать включение точных изменений генома, начиная от однонуклеотидных полиморфизмов и заканчивая небольшими иммунологическими метками или даже большими флуоресцентными белковыми конструкциями. Однако основным узким местом в этой процедуре может быть поиск и изоляция нужного редактирования в зародышевой линии. В этом протоколе изложен надежный метод скрининга и выделения мутаций зародышевой линии в определенных локусах у Danio rerio (рыбки данио); Тем не менее, эти принципы могут быть адаптированы в любой модели, где возможен сбор спермы in vivo .
Введение
Система CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas является мощным инструментом для выполнения локус-специфического мутагенеза и точного редактирования генома в модельной системе Danio rerio (рыбки данио) 1,2,3,4. Cas-рибонуклеопротеин (RNP) состоит из двух основных компонентов: эндонуклеазы Cas (обычно Cas9 или Cas12a) и локус-специфической синтетической направляющей РНК (sgRNA)5. Вместе Cas-RNP генерирует двухцепочечный разрыв (DSB) в желаемом локусе, который может быть восстановле....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Это исследование было проведено в соответствии с руководящими принципами, изложенными в Руководстве по уходу за лабораторными животными и их использованию Национальных институтов здравоохранения. Протокол был одобрен Комитетом по уходу за животными и их использованию Техасского университета в Остине (AUP-2021-00254).
1. Проектирование сгРНК для мутагенеза CRISPR
- Получите последовательность экзонов, содержащую целевые локусы.
- Разработка синтетической направляющей РНК (сгРНК) с соседним сайтом протоспейсерного мотива (PAM), специфичным для эндонуклеазы Cas.
- Если вы вводите донорскую конструкцию, спр....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Экспериментальные подходы, описанные в этом протоколе, позволяют более быстро идентифицировать изменения генома или предполагаемые вредные аллели, сосредоточив внимание на анализе тысяч геномов, полученных из коллекции F0-инъекционных мужских сперматозоидов. На рисунке 2 показано, как интерпретировать результаты, полученные с помощью этого протокола.
Для генерации мутаций в локусе p2ry12 эмбрионам рыбок данио-рерио на одноклеточной стадии вводили эндонуклеазу Cas9.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол описывает метод быстрой характеристики предполагаемых изменений генома или целевых мутаций с использованием технологии CRISPR-Cas путем целенаправленного анализа мужских геномов сперматозоидов F0. Этот протокол должен быть совместим с другими моделями животных, где сперма легко доступна для отбора проб без эвтаназии. Этот метод увеличит пропускную способность скрининга на наличие желаемых правок и особенно полезен для выявления редких событий, опосредованных HDR. Этот подход также служит для сокращения числ.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Анну Хайндес из Медицинской школы Вашингтонского университета за ее первоначальные усилия по получению геномной ДНК сперматозоидов хорошего качества с использованием метода горячего выстрела. Эта работа была профинансирована Национальным институтом артрита, скелетно-мышечных и кожных заболеваний Национального института здравоохранения в рамках премии (R01AR072009 для R.S.G.).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Порошок агарозы | Биореагенты Fisher | BP1356-100 | |
| Селекционные резервуары | Carolina Biological | ||
| BstNI Фермент рестрикции | NEB | R0168S | |
| Cas9 Эндонуклеаза | IDT | 1081060 | |
| DNA Ladder, 100.н. | Термо Научный | ||
| днк10 донорская конструкция | Сигма-Олдрич | ДНК олиго в пробирке; 0,025 нМ, стандартная очистка от осолей, сухая. фосфоротиоатная связь на доноре на первых трех фосфатных связях как на 5', так и на 3'-концах (5'-CCTCTCTCTCTTTCAGAAGCT TGCTCATCCGCTGCTGCTGCTGCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3')dnah10 | |
| прямой праймер | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0,025 нМ, стандартная очистка от осолей, сухая (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3')dnah10 | |
| обратный праймер | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0,025 нМ, стандартная очистка от солей, сухая ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3') | |
| dnah10 синтетическая sgRNA | Синтез | Синтетическая sgRNA, последовательность-мишень: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3'Источник | |
| питания электрофореза | Thermo Scientific | 105ECA-115 | |
| Фильтрующие щипцы | Millipore | XX6200006P | |
| Fish (system) water Generic | n/a | ||
| Система гель-электрофореза (включая литую раму, гребень и камеру электрофореза) | Термо Научный | Световой короб B2 | |
| Gel для визуализации | Azure Biosystems | AZI200-01 | |
| Гелевая морилка, 10000X | Invitrogen | S33102 | |
| Стеклянная миска, 250 мл | Общие | н/д | |
| Изоляционные баки, 0,8 л | Aquaneering | ZT080 | |
| Microcap капиллярная трубка с колбой, 20 & микро; Л | Drummond | 1-000-0020/CA | |
| Миницентрифуга | Bio-Rad | 12011919EDU | |
| Микропипетки, различные с соответствующими наконечниками | Generic | н/д | |
| Микроволновая печь | Дженерик | н/д | |
| Вода без нуклеазы | Promega | P119-C | |
| Бумажные полотенца | Общие | н/д | |
| ПЦР-пробирки, 0,2 мл Bioexpress | T-3196-1 | ||
| Пластиковая ложка, с просверленными отверстиями | Дженерик | н/д | |
| раствор KCl, 0,2 М РНКазы свободный | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| p2ry12 прямой праймер | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0,025 нМ, стандартная очистка от осолей, сухая (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3') | |
| p2ry12 обратный праймер | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0,025 нМ, стандартная очистка от обессолов, сухая (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3') | |
| p2ry12 синтетическая sgRNA | Синтез | Синтетическая sgРНК, последовательность-мишень: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3'Фермент | |
| рестрикции 10X Buffer | NEB | B6003SVIAL | |
| раствор NaOH, 50 mM | Термо Научный | S318; 424330010 | |
| Губка, 1 дюйм x 1 дюйм с маленьким овальным углублением | Generic | н/д | |
| Стереомикроскоп | Zeiss | Stemi 508 | |
| Taq полимераза мастер-микс, 2X | Promega | M7122 | |
| TBE Буферный концентрат, 10X | VWR | E442 | |
| Термоамплификатор | Bio-Rad | 1861096 | |
| Папиросная бумага | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Раствор трикаина-метансульфоната (Syncaine, MS-222), 0,016% в рыбьей воде (pH 7,0&m; 0.2) | Syndel | 200-266 | |
| Tris Base, 1M (с буферизацией HCl до ph 8.0) | Promega | H5131 |
Ссылки
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
