Протокол анализа малахитового зеленого является простым и экономически эффективным методом обнаружения супрессоров белка теплового шока 90 (Hsp90), а также других соединений-ингибиторов против АТФ-зависимых ферментов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Малахитовый зеленый анализ для открытия ингибиторов белка теплового шока 90
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Белок теплового шока 90 (Hsp90) является многообещающей противоопухолевой мишенью из-за его сопровождающего действия на несколько онкогенных белков. Активность Hsp90 зависит от его способности гидролизовать аденозинтрифосфат (АТФ) до аденозиндифосфата (АДФ) и свободного фосфата. Активность АТФазы Hsp90 связана с ее сопровождающей функцией; АТФ связывается с N-концевым доменом Hsp90, и нарушение его связывания оказалось наиболее успешной стратегией подавления функции Hsp90. Активность АТФазы можно измерить с помощью колориметрического анализа малахитового зеленого, который определяет количество свободного фосфата, образующегося при гидролизе АТФ. Здесь описана процедура определения АТФазной активности дрожжей Hsp90 с использованием набора для анализа малахитового зеленого фосфата. Кроме того, приведены подробные инструкции по обнаружению ингибиторов Hsp90 путем приема гелданамицина в качестве аутентичного ингибитора. Наконец, обсуждается применение этого протокола анализа посредством высокопроизводительного скрининга (HTS) молекул ингибитора против дрожжей Hsp90.
Введение
Белок теплового шока 90 (Hsp90) является молекулярным шапероном, который поддерживает стабильность белков, ответственных за развитие и прогрессирование рака. Кроме того, белки, ответственные за развитие резистентности к противоопухолевым средствам, также являются клиентами Hsp901. Hsp90 повсеместно экспрессируется во всех типах раковых клеток (>90% клеточных белков) по сравнению с нормальными клетками, где он может составлять менее 2% от общего количества белков. Более того, Hsp90 раковых клеток находится в комплексе с кошаперонами, тогда как в нормальной клетке он присутствует преимущественно в свободном, некомплексном состоянии
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Лабораторный анализ малахитового зеленого
- Приготовление пробирного буфера
- Подготовьте пробирный буфер в соответствии с составом и препаратом, представленными в таблице 1.
- Подготовка стандартов фосфатов
- Используйте стандарт фосфата 1 мМ, входящий в комплект для анализа фосфата малахитового зеленого (хранится при 4 ° C).
- Пипетка 40 мкл 1 мМ фосфатного стандарта в 960 мкл сверхчистой воды для получения 40 мкМ раствора фосфата (раствор премикса). Добавьте раствор премикса со сверхчистой водой в соответствии с инструкциями производителя для получения последовательного разбавления ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Результаты анализа интерпретируются с точки зрения поглощения из-за концентрации свободных фосфат-ионов. Поглощение свободным фосфатом в результате гидролиза АТФ дрожжами Hsp90 при 620 нм считается 100% активностью АТФазы или нулевым процентным ингибированием белка. Ингибирование белка приводит к прекращению гидролиза АТФ (меньше свободного фосфата). что отражается на снижении поглощения при 620 нм.
Результаты лабораторного анализа малахитового зеленого
Стандартный график д.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Hsp90 является важной мишенью для открытия новых противоопухолевых молекул лекарств. С тех пор, как в 1994 году была установлена его лекарственная пригодность,10 молекул достигли клинических испытаний. В настоящее время семь молекул находятся в различных фазах клинических испытаний, как по отдельности, так и в комбинации22. Все такие малые молекулы являются N-концевыми ингибиторами связывания АТФ. Другие средства ингибирования шаперона (С-концевые ингибиторы, ингибиторы сре.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Это исследование было поддержано программой Korea Research Fellowship (KRF), постдокторантом Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемой Министерством науки и ИКТ (NRF-2019H1D3A1A01102952). Авторы выражают благодарность внутреннему гранту KIST и гранту Министерства океанов и рыболовства No 2MRB130 за оказание финансовой помощи для этого проекта.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1М Раствор хлорида магния в воде | Sigma-Aldrich | 63069-100мл | |
| 1М Раствор хлорида калия в воде | Sigma-Aldrich | 60142-100мл | |
| 96-луночная пластина | SPL Науки о жизни | Не применимо | |
| Аденозин 5′-трифосфат динатрия соль | гидрат Sigma-Aldrich | A7699-5G | |
| Biomek FX лаборатория автоматизированная рабочая станция | Beckman Coulter | Не применимо | |
| Соединения 3-96 | Не применимо | Не применимо | Дрожжи, меченные гистидином Hsp90, были получены от доктора Хрисостомоса Продрому, Школа наук о жизни, Университет Сассекса, Великобритания, а белок был экспрессирован в Институте натуральных продуктов KIST Gangneung. Детали не могут быть раскрыты из-за проблем с нарушением патентных прав. |
| Диметилсульфоксид | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Geldanamycin, 99% (ВЭЖХ), порошок | AK Scientific, Inc. | V2064 | |
| Invitroge UltraPure ДНКаза/РНКаза Дистиллированная вода | ThermoFisher Scientific | 10977015 | |
| Малахитовый зеленый фосфат Набор для анализа | Sigma-Aldrich | MAK307-1KT | |
| Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT | Biotek Instruments, Inc. | Не применимо | |
| Synergy HT многопланшетный считыватель | Biotek Instruments, Inc. | Не применимо | |
| Тризма гидрохлоридный буферный раствор, pH7.4 | Sigma-Aldrich | 93313-1L | |
| Дрожжи Hsp90 | Не применимо | Не применимо | Школа наук о жизни, Университет Сассекса, Великобритания, а белок был экспрессирован в KIST Gangneung Institute of Natural Products. Основной регистрационный номер: P02829 |
Ссылки
- Workman, P. Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone. Cancer Letters. 206 (2), 149-157 (2004).
- Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: e....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
