Конструирование, характеристика и регенеративное применение самоорганизующихся агрегатов мезенхимальных стволовых клеток человека

Summary

В данном исследовании описан метод конструирования агрегатов на основе самосборки мезенхимальных стволовых клеток человека и определены морфологические и гистологические характеристики для регенеративного лечения дефектов костей черепа.

Abstract

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК), характеризующиеся способностью к самообновлению и потенциалом многолинейной дифференцировки, могут быть получены из различных источников и становятся многообещающими кандидатами для регенеративной медицины, особенно для регенерации зубов, костей, хрящей и кожи. Самоорганизующийся подход к агрегации МСК, который, в частности, конструирует клеточные кластеры, имитирующие развивающуюся мезенхимальную конденсацию, позволяет доставлять стволовые клетки с высокой плотностью наряду с сохраненными межклеточными взаимодействиями и внеклеточным матриксом (ВКМ) в качестве ниши микроокружения. Было показано, что этот метод обеспечивает эффективное приживление и выживание клеток, тем самым способствуя оптимизированному применению экзогенных МСК в тканевой инженерии и обеспечивая клиническую регенерацию органов. В данной работе представлен подробный протокол построения и характеризации самоорганизующихся агрегатов на основе мезенхимальных стволовых клеток пуповины (UCMSCs), а также пример регенеративного применения костей черепа. Реализация этой процедуры поможет разработать эффективную стратегию трансплантации МСК для тканевой инженерии и регенеративной медицины.

Introduction

Конденсация мезенхимальных стволовых клеток (МСК) является важным этапом для обеспечения нормального роста и развития организма на ранних этапах органогенеза ^1,2, особенно при формировании костей, хрящей, зубов и кожи ^1,3,4. За последние несколько десятилетий тканевая инженерная терапия с использованием культивируемых постнатальных МСК в сочетании с биоразлагаемыми каркасами достигла значительных успехов в остеогенной^{регенерации5} и хрящевой^рег....

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Четвертого военно-медицинского университета и выполнялись в соответствии с Руководством Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Для настоящего исследования были использованы криоконсервированные человеческие UCMSC, полученные из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). Использование человеческих клеток было одобрено Этическим комитетом Четвертого военно-медицинского университета. В качестве примера для описания процедуры были взяты UCMSC. Дефект черепа был взят....

Results

Агрегаты могут быть успешно построены из UCMSC в соответствии с экспериментальным рабочим процессом (рис. 1). Качество агрегатов должно быть оценено перед использованием с помощью морфологического наблюдения и гистологического анализа. Сформированная ламеллярная структура должна быть полной и плотной, а клетки переплетаются друг с другом, образуя тканый узор при микроскопическом наблюдении (рис. 2A). Загибание краев может быть обнаружено во время агрега.......

Discussion

С развитием биотехнологии тканевой инженерии многие ученые сосредоточили внимание многих ученых на стратегиях создания имплантируемой структуры с высокой пластичностью, содержащей долговременно выживающие клетки, способные достичь оптимальной регенерации. В настоящее время существует множество методов имплантации МСК, таких как чистоклеточные методы, скаффолды, дополненные цитокинами ^6,24, или комбинация стволовых клеток и скаффо.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25% трипсин-ЭДТА (1x)	Sigma	T4049
Автоматическая машина для дегидратации Автоматическая машина для обезвоживания	LEICA	ASP200s
Центрифуга	Eppendorf	5418R	Центрифуга для центрифугирования
Пробирка для центрифугирования	Thermo Nunc	339650	Чашка для центрифугирования
	Thermo	150466	Культура UCMSC
Этанол	SCR	10009218	Дегидратный агрегат
Смертельная бычья сыворотка	Sijiqing	11011-8611	Культура UCMSCs
Щипцы	JZ	JD1080	Агрегат сбора урожая
Глутаральдегид	Proandy	10217-1	Фиксация агрегата
Гематоксилин и Эозин Набор для окрашивания	beyotime	C0105S	HE
Гексаметилдисилазан	SCR	80068416	Сухая поверхность агрегата
Hoechst33342	Sigma	14533	Окрашивание ядра клеток
L-глутамин	Sigma	G5792	Культура UCMSCs
Жизнеспособность/Цитотоксичность Набор	Invitrogen	L3224	Окрашивание живых/мертвых клеток
Набор для окрашивания Masson's Staining Kit	ZHC	CD069	Masson Staining
Minimum Essential Medium Alpha basic (1x)	Gibco	C12571500BT	Культура UCMSCs
Парафин	Leica	39601006	Встраивание в ткань
Параформальдегид	Saint-Bio	D16013	Фиксация заполнителя
PBS (1x)	Meilunbio	MA0015	Ресуспендирование и очистка UCMSCs
Пенициллин/стрептомицин	Procell Life Science	PB180120	Культура UCMSCs
Пентобарбитал	натрия Sigma	P3761	Анестезия животных
Полиспорин	Pfizer		Prevent eye dry
Сканирующий электронный микроскоп	Hitachi	s-4800	SEM наблюдение
Ножницы	JZ	Y00030	Хирургический разрез
животного Шестилуночная пластина	Thermo	140675	Культура UCMSCs
Шов	Jinhuan	F603	Закрытые раны
Шов	Xy	4-0	Закрытые раны
Термостатическое оборудование	Grant	v-0001-0005	Водяная баня
UCMSCs	Bai'ao& НБСП;	UKK220201	Коммерчески продаваемый UCMSC
Витамин С	Diyibio	DY40138-25 г	Агрегат, индуцирующий
ксилол	SCR	10023418	обезвоживающий агрегат