Методическая статья

Конструирование, характеристика и регенеративное применение самоорганизующихся агрегатов мезенхимальных стволовых клеток человека

DOI:

10.3791/64697

⸱

24 марта 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, The Fourth Military Medical University, 2Department of Preventive Dentistry, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 3College of Life Science, Northwest University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данном исследовании описан метод конструирования агрегатов на основе самосборки мезенхимальных стволовых клеток человека и определены морфологические и гистологические характеристики для регенеративного лечения дефектов костей черепа.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК), характеризующиеся способностью к самообновлению и потенциалом многолинейной дифференцировки, могут быть получены из различных источников и становятся многообещающими кандидатами для регенеративной медицины, особенно для регенерации зубов, костей, хрящей и кожи. Самоорганизующийся подход к агрегации МСК, который, в частности, конструирует клеточные кластеры, имитирующие развивающуюся мезенхимальную конденсацию, позволяет доставлять стволовые клетки с высокой плотностью наряду с сохраненными межклеточными взаимодействиями и внеклеточным матриксом (ВКМ) в качестве ниши микроокружения. Было показано, что этот метод обеспечивает эффективное приживление и выживание клеток, тем самым способствуя оптимизированному применению экзогенных МСК в тканевой инженерии и обеспечивая клиническую регенерацию органов. В данной работе представлен подробный протокол построения и характеризации самоорганизующихся агрегатов на основе мезенхимальных стволовых клеток пуповины (UCMSCs), а также пример регенеративного применения костей черепа. Реализация этой процедуры поможет разработать эффективную стратегию трансплантации МСК для тканевой инженерии и регенеративной медицины.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Конденсация мезенхимальных стволовых клеток (МСК) является важным этапом для обеспечения нормального роста и развития организма на ранних этапах органогенеза 1,2, особенно при формировании костей, хрящей, зубов и кожи 1,3,4. За последние несколько десятилетий тканевая инженерная терапия с использованием культивируемых постнатальных МСК в сочетании с биоразлагаемыми каркасами достигла значительных успехов в остеогеннойрегенерации5 и хрящевойрегенерации6. Тем не менее, использование скаффолдов может иметь некоторые недостатки, такие как иммунное отторжение, а также низкая клеточная аффинность ипластичность. В связи с этим нами исследована целесообразность применения метода сфероидной клеточной культуры для получения самоорганизующихся агрегатов, не содержащих каркасов, имитирующих развивающееся явление конденсации, которые содержат только МСК и депонированный внеклеточный матрикс (ВКМ)8. Образование агрегатов повышает аппликативную пластичность в соответствии с формой дефекта и позволяет избежать имплантации скаффолда и его расщепления протеолитическими ферментами для сбора МСК для трансплантации9.

Агрегаты МСК широко используются для регенерации кости, пульпы зуба, пародонта и кожи10, а также других тканей и органов. В качестве кандидатов на роль затравочных клеток могут быть выбраны многие различные типы МСК, включая, помимо прочего, МСК костного мозга (BMMSC), МСК пуповины (UCMSC), стромальные клетки, полученные из жировой ткани (ADSC), и стоматологические МСК (например, мезенхимальные стволовые клетки пульпы зуба [DPSC], мезенхимальные стволовые клетки из молочных зубов [SHED]11 и мезенхимальные стволовые клетки периодонта [PDLSC])12. За последнее десятилетие было разработано множество технологий для трехмерных кластеров ячеек, включая ассистированную и самоорганизующуюся агрегацию. Тем не менее, подходы с помощью агрегации часто слабы в создании ЭКМ и формировании однородных и плотных агрегатов, и поэтому не подходят для имитации физиологических условий 13,14,15. Более того, некоторые вспомогательные методы агрегации требуют взаимодействия клетки с материалом для формирования стабильных структур 16,17,18,19, в то время как этот метод самоорганизующейся агрегации обычно доступен для широкого спектра МСК. Примечательно, что в наших недавних клинических испытаниях агрегаты МСК были успешно использованы для регенерации пульп-дентинового комплекса и пародонта после имплантации в поврежденные резцы человека которые достигли регенерации тканей de novo с физиологической структурой и функцией20,21.

В этой статье представлена тщательная процедура построения и определения характеристик агрегата МСК, а также трансплантации in vivo . Этот подход привлечет внимание исследователей, когда они стремятся исправить дефекты в тканях, таких как зубы, кости, хрящи и кожа, на основе применения стволовых клеток. Этот способ прост, удобен и полностью составлен из клеток и ЭХМ без дополнительных скаффолдов, которые можно культивировать в течение длительного времени для получения плотных и стабильных агрегатов22. Между тем, агрегаты, культивируемые таким образом, богаты ВКМ, который имитирует развивающуюся нишу для этих клеток высокой плотности и, таким образом, способствует регенерациитканей23. Процесс конструирования можно разделить на два этапа: подготовка и культивирование клеток, а также самоорганизующееся формирование и сбор клеточных агрегатов. Характеристика агрегатов включает морфологическую идентификацию с помощью инвертированного оптического микроскопа и сканирующего электронного микроскопа (СЭМ), а также гистологический анализ с помощью гематоксилина и эозина (ПЭ) и окрашивание по Массону. Полученные агрегаты были продемонстрированы для регенеративной имплантации с целью восстановления дефекта костей черепа. Реализация этой процедуры поможет разработать эффективную стратегию трансплантации МСК для тканевой инженерии и регенеративной медицины.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Четвертого военно-медицинского университета и выполнялись в соответствии с Руководством Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Для настоящего исследования были использованы криоконсервированные человеческие UCMSC, полученные из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). Использование человеческих клеток было одобрено Этическим комитетом Четвертого военно-медицинского университета. В качестве примера для описания процедуры были взяты UCMSC. Дефект черепа был взят в качестве примера для демонстрации необходимости восстановления для описания процедуры имплантации. Все эксперименты повторялись три раза.

1. Строительство агрегатов UCMSC

  1. Подготовка и культура УКМСК
    1. Добавьте 10 мл предварительно подогретого фосфатно-солевого буфера (PBS) в новую центробежную пробирку объемом 15 мл в стерильном шкафу биобезопасности.
    2. Извлеките морозильную трубку с замороженными UCMSC из жидкого азота и быстро поместите ее на водяную баню при температуре 37 °C. Осторожно встряхните пробирку, чтобы способствовать быстрому и тщательному размораживанию клеток.
      ВНИМАНИЕ: Вся процедура должна быть завершена в течение 1 минуты, так как диметилсульфоксид (ДМСО) в замораживающем растворе может вызвать цитотоксичность.
    3. Слегка подвесьте клетки в морозильной пробирке и перенесите все содержимое в центрифужную пробирку, содержащую 10 мл PBS (шаг 1.1.1). Центрифугируйте образец при 100 × г в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте клетки 10 мл PBS.
    4. Центрифугируйте образец при 100 × г в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и осторожно восстановите клетки с помощью полной альфа-минимальной эссенциальной среды (α-MEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% пенициллин-стрептомицина и 584 мг/л глутамина.
    5. Высевайте ресуспендированные клетки в 10-сантиметровые культуральные чашки (часто одну-две чашки на одну пробирку, в зависимости от общего количества клеток после центрифугирования, при плотности 5 ×10-6 клеток на чашку). Добавляйте в посуду полную среду α-MEM до общего объема 10 мл.
    6. Аккуратно встряхните посуду, чтобы распределить ячейки. Инкубируйте чашки при температуре 37 °C с 5%CO2 в увлажненной камере. После ночной инкубации выбросьте надосадочную среду и добавьте 5 мл PBS 1-2x для удаления неадгезивных клеток. Добавьте 10 мл свежей полной среды α-MEM. Меняйте питательные среды каждые 2 дня.
    7. Для пассирования клеток, когда клетки достигают 80%-90% слияния, выбросьте надосадочную жидкость и промойте клетки 5 мл PBS для тщательного удаления среды. Инкубируйте клетки в 2 мл 0,25% трипсина-1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) при 37 °C в течение 2 мин.
    8. Когда клетки станут круглыми с нарушенными межклеточными соединениями под микроскопом, отделите клетки от чашек без слишком большого нарушения клеточной структуры. Нейтрализуйте трипсин, добавив 4 мл полной среды α-MEM.
    9. Соберите клетки из посуды несколько раз и осторожно с помощью пипетирования в свежую центрифужную пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте образец при 100 × г в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клетки полной средой α-MEM и засейте их в чашки для свежих культур или луночные тарелки. Меняйте питательные среды каждые 2 дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от размера дефектной области, дефект размером 25мм3 требует использования лунки из 6-луночных пластинчатых ячеек, культивируемых для образования агрегатов.
  2. Формирование и уборка агрегатов
    1. Приготовьте среды, индуцирующие клеточные агрегаты, добавив 50 мкг/мл витамина С в α-MEM с 10% FBS, 1% пенициллин-стрептомицином и 584 мг/л глутамина.
      ВНИМАНИЕ: При использовании витамина С следует избегать воздействия прямого света, так как витамин С окисляется под воздействием света и становится неэффективным.
    2. Когда клетки на шаге 1.1.12 достигнут 95% слияния (дополнительный рисунок S1), смените среду на среду, индуцирующую клеточный агрег; Меняйте свежие среды, индуцирующие клеточный агрегат, каждые 2 дня.
    3. После 7-10 дней индукции (продолжительность индукции зависит от типа стволовых клеток и часто составляет ~7 дней для края UCMSC) ищите под микроскопом формованные агрегаты с толстыми краями, отделенными от дна чашки.
    4. Выбросьте питательную среду и аккуратно промойте клетки 2 раза PBS. Аккуратно протолкните агрегаты от края к середине с помощью небольших стерильных щипцов, складывая агрегаты.
    5. В некоторых случаях UCMSC могут самопроизвольно скручиваться к центру, образуя твердую конденсацию. Эта структура эквивалентна агрегату, полученному на шаге 1.2.4.

2. Морфологическая идентификация агрегатов

  1. Общее и микроскопическое наблюдение
    1. Обратите внимание, что агрегаты плотные и цельные и не могут быть легко повреждены механическими силами, такими как вытягивание во время отсоединения и трансплантации.
    2. Под микроскопом ищите мембраноподобную структуру определенной толщины с тканым рисунком.
  2. Окрашивание живых/мертвых клеток
    1. Засейте клетки в 6-луночный планшет с плотностью 1 ×10-6 клеток в лунку.
    2. Приготовьте 2 μМ кальцеина AM и 4 μМ EthD-1 рабочий раствор и используя PBS.
    3. Добавьте 0,3% тритона в клетки на 5 минут, промойте PBS три раза, чтобы вызвать гибель клеток, в качестве контроля окрашивания.
    4. Промойте клетки, агрегаты и клетки, вызывающие мертвение, PBS дважды.
    5. Добавьте 100 мкл PBS и 100 мкл приготовленного окрашивающего раствора на шаге 2.2.2 в каждую лунку.
    6. Инкубируйте образец в течение 30 минут при RT. Промойте образец PBS дважды.
    7. Добавьте 200 мкл 10 мкг/мл Hoechst в каждую лунку и инкубируйте образец в течение 5 мин при RT. Дважды проведите отбор образца с PBS.
    8. Наблюдайте под флуоресцентным микроскопом.
  3. Наблюдение за СЭМ
    1. Затравить и индуцировать в клетку агрегаты, полученные на шаге 1.2.4 или 1.2.5. Промыть ячейки PBS после формирования агрегатов на шаге 1.2.4. или 1.2.5.
    2. Зафиксируйте клетки с помощью глутарового альдегида не менее чем на 4 ч.
    3. Промойте образцы PBS, затем обезвожьте через градиентную концентрацию этанола от 30%, 50%, 70%, 80%, 90% до 100% каждый в течение 5 минут. Обработайте 2 раза безводным этанолом.
    4. Погрузите агрегаты в 3 мл гексаметилдисилазана на 30 минут. Отсадите всю жидкость и естественным образом тщательно высушите образцы.
      ВНИМАНИЕ: Весь процесс необходимо проводить в вытяжном шкафу, потому что гексаметилдисилазан летуч и высокотоксичен.
    5. Наклейте высушенные образцы на стол для образцов с помощью двусторонней углеродной ленты и покройте поверхность металлом. Храните образец при комнатной температуре (RT) в течение нескольких дней.
    6. Наблюдайте под СЭМ.
      1. Установите образец на место внутри аппарата. Отрегулируйте напряжение станка на 5 К, а фокусное расстояние на ~12 мм. Отрегулируйте полосу фокусировки до тех пор, пока не появится четкое изображение.
      2. Делайте снимки с малым увеличением. Отрегулируйте увеличение и перефокусируйтесь, чтобы получить изображение с большим увеличением.
        ВНИМАНИЕ: Поверхность агрегатов нельзя трогать до начала наблюдения во избежание разрушения морфологии поверхности.

3. Гистологический анализ агрегатов

  1. Фиксация и секционирование образцов
    1. Зафиксируйте заполнители, полученные на шаге 1.2.4 или 1.2.5, с 4% параформальдегидом при температуре 4°С не менее чем на 24 часа. После фиксации промойте PBS и поместите образец в закладные кассеты на ночь для промывки проточной водой.
    2. Обезвоживайте образцы с помощью автоматических машин для обезвоживания с помощью градиентного этанола, ксилола и парафина, следуя инструкциям производителя. Весь процесс выглядит следующим образом: 85% этанола в течение 2 ч при RT, 95% этанола в течение 2 ч при RT, 95% этанола в течение 2 ч при RT, 100% этанола в течение 2 ч при RT, 100% этанола в течение 1,5 ч при RT, ксилола в течение 45 мин при RT, ксилола в течение 45 мин при RT, парафина в течение 30 мин при RT, парафин в течение 1,5 ч при RT и, наконец, парафин в течение 2 ч при 60 °C.
    3. Замажьте образцы парафином. Подготовьте срезы толщиной около 5 мкм, приклейте их к катионным предметным стеклам и высушите предметные стекла в течение 2 ч при 45 °C.
    4. Депарафинизируйте последовательно через ксилол в течение 15 минут, дважды и 100%, 90%, 80% и 70% этанола (каждый в течение 5 минут).
    5. Медленно промойте горки 3 раза проточной водой в течение 5 минут.
  2. Окрашивание HE
    1. Запачкайте гематоксилином в течение 3-5 минут, смойте водой, и тщательно удалите лишнюю жидкость вокруг ткани.
    2. Фракционировать этанолом, содержащим 1% соляной кислоты в течение 3-5 с и смыть проточной водой, во время которой цвет становится немного светлее и голубым. Удалите лишнюю воду вокруг ткани.
    3. Запачкайте эозином в течение 1 минуты, смойте проточной водой, удалите лишнюю жидкость вокруг ткани.
    4. Обезвожьте 70%, 80%, 90% и 100% этанолом в течение 10 секунд каждый, ксилолом в течение 15 минут, дважды и высушите естественным образом в вытяжном шкафу перед запечатыванием листа.
    5. Добавьте нейтральные капли смолы и запечатайте слайды покровными стеклами. Наблюдайте под световым микроскопом.
  3. Трихромное окрашивание Массона
    1. Запачкать гематоксилином железа Вейгерта в течение 5 минут, прополоскать водой, вытереть насухо.
    2. Фракционировать этанолом, содержащим 1% соляной кислоты в течение 3-5 с и смыть проточной водой, во время которой цвет становится немного светлее и голубым. Вытрите поверхность насухо.
    3. Окрасить раствором красного кислого пурпурного цвета Lixin на 5-10 мин и быстро смыть дистиллированной водой.
    4. Обработать водным раствором фосфомолибдиновой кислоты в течение 3-5 мин.
    5. Непосредственно повторно испачкать раствором анилинового синего в течение 5 минут, не смывая водой.
    6. Обработать 1% ледяной уксусной кислотой в течение 1 мин.
    7. Обезвожьте 70%, 80%, 90% и 100% этанолом в течение 10 секунд каждый, ксилолом в течение 15 минут, дважды и высушите естественным образом в вытяжном шкафу перед запечатыванием листа.
    8. Добавьте нейтральные капли смолы и запечатайте слайды покровными стеклами. Наблюдайте под световым микроскопом.

4. Имплантация

  1. Обезболите обнаженную мышь внутрибрюшинной инъекцией 50 мг/кг пентобарбитала натрия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что мыши находятся под надлежащей анестезией, основываясь на отсутствии роговичного рефлекса и реакции конечностей при защемлении подушечки лапы. Наносите мазь для глаз для предотвращения сухости.
  2. Вырежьте поперечный разрез (~3-4 см) на коже за ушами голой мыши стерильными маленькими ножницами после дезинфекции йодофором.
  3. Потяните кожу вперед, чтобы обнажить черепную коробку. Слегка проведите лезвием 11# края запланированной области дефекта и удалите фрагмент кости. Область дефекта представляет собой круглую область диаметром около 4 мм. Используйте физиологический раствор для промывания раны и обеспечения адекватного гемостаза.
  4. Полученные на шаге 1.2.5 или 1.2.6 агрегаты обмакнуть в стерильную марлю для впитывания поверхностной влаги перед имплантацией. Поместите заполнители в область и слегка надавите, чтобы заполнить дефект.
  5. Замените кожу после вытягивания, чтобы убедиться, что имплантат зафиксирован. Закройте разрез 1/2, 4 × 10 угловыми швами и 4-0 швами.
  6. После операции поместите животных на согревающее одеяло, пока они не станут активными, а затем верните их в клетку.
    Примечание: Животных нельзя оставлять без присмотра до тех пор, пока они не придут в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Животные, перенесшие операцию, не возвращаются в компанию других животных до полного выздоровления.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Агрегаты могут быть успешно построены из UCMSC в соответствии с экспериментальным рабочим процессом (рис. 1). Качество агрегатов должно быть оценено перед использованием с помощью морфологического наблюдения и гистологического анализа. Сформированная ламеллярная структура должна быть полной и плотной, а клетки переплетаются друг с другом, образуя тканый узор при микроскопическом наблюдении (рис. 2A). Загибание краев может быть обнаружено во время агрега...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С развитием биотехнологии тканевой инженерии многие ученые сосредоточили внимание многих ученых на стратегиях создания имплантируемой структуры с высокой пластичностью, содержащей долговременно выживающие клетки, способные достичь оптимальной регенерации. В настоящее время существует множество методов имплантации МСК, таких как чистоклеточные методы, скаффолды, дополненные цитокинами 6,24, или комбинация стволовых клеток и скаффо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (81930025, 82100969 и 82071075) и Национальной программы ключевых исследований и разработок Китая (2022YFA1104400 и 2021YFA1100600). Мы благодарны за помощь Национальному экспериментальному учебно-демонстрационному центру фундаментальной медицины (АМФУ).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,25% трипсин-ЭДТА (1x)SigmaT4049
Автоматическая машина для дегидратации Автоматическая машина для обезвоживанияLEICAASP200s
ЦентрифугаEppendorf5418RЦентрифуга для центрифугирования
Пробирка для центрифугированияThermo Nunc339650Чашка для центрифугирования
Thermo150466Культура UCMSC
ЭтанолSCR10009218Дегидратный агрегат
Смертельная бычья сывороткаSijiqing11011-8611Культура UCMSCs
ЩипцыJZJD1080Агрегат сбора урожая
ГлутаральдегидProandy10217-1Фиксация агрегата
Гематоксилин и Эозин Набор для окрашиванияbeyotimeC0105SHE
ГексаметилдисилазанSCR80068416Сухая поверхность агрегата
Hoechst33342Sigma14533Окрашивание ядра клеток
L-глутаминSigmaG5792Культура UCMSCs
Жизнеспособность/Цитотоксичность Набор InvitrogenL3224Окрашивание живых/мертвых клеток
Набор для окрашивания Masson's Staining KitZHCCD069Masson Staining
Minimum Essential Medium Alpha basic (1x)GibcoC12571500BTКультура UCMSCs
ПарафинLeica39601006Встраивание в ткань
ПараформальдегидSaint-BioD16013Фиксация заполнителя
PBS (1x)MeilunbioMA0015Ресуспендирование и очистка UCMSCs
Пенициллин/стрептомицинProcell Life SciencePB180120Культура UCMSCs
Пентобарбиталнатрия SigmaP3761Анестезия животных
ПолиспоринPfizerPrevent eye dry
Сканирующий электронный микроскопHitachis-4800SEM наблюдение
НожницыJZY00030Хирургический разрез
животного Шестилуночная пластинаThermo140675Культура UCMSCs
ШовJinhuanF603Закрытые раны
ШовXy4-0Закрытые раны
Термостатическое оборудованиеGrantv-0001-0005Водяная баня
UCMSCsBai'ao& НБСП;UKK220201Коммерчески продаваемый UCMSC
Витамин СDiyibioDY40138-25 гАгрегат, индуцирующий
ксилолSCR10023418обезвоживающий агрегат
культуры

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hall, B. K., Miyake, T. Divide, accumulate, differentiate: cell condensation in skeletal development revisited. The International Journal of Developmental Biology. 39 (6), 881-893 (1995).
  2. Hall, B. K., Miyake, T. All for one and one for all: condensations and the initiation of skeletal development. Bioessays. 22 (2), 138-147 (2000).
  3. Salhotra, A., Shah, H. N., Levi, B., Longaker, M. T. Mechanisms of bone development and repair. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 21 (11), 696-711 (2020).
  4. Mammoto, T., et al. Mechanochemical control of mesenchymal condensation and embryonic tooth organ formation. Developmental Cell. 21 (4), 758-769 (2011).
  5. Khanarian, N. T., Jiang, J., Wan, L. Q., Mow, V. C., Lu, H. H. A hydrogel-mineral composite scaffold for osteochondral interface tissue engineering. Tissue Engineering. Part A. 18 (5-6), 533-545 (2012).
  6. Liu, M., et al. Injectable hydrogels for cartilage and bone tissue engineering. Bone Research. 5, 17014(2017).
  7. Ai, C., et al. Osteochondral tissue engineering: Perspectives for clinical application and preclinical development. Journal of Orthopaedic Translatation. 30, 93-102 (2021).
  8. Huang, X., et al. Microenvironment influences odontogenic mesenchymal stem cells mediated dental pulp regeneration. Frontiers in Physiology. 12, 656588(2021).
  9. Li, M., Ma, J., Gao, Y., Yang, L. Cell sheet technology: a promising strategy in regenerative medicine. Cytotherapy. 21 (1), 3-16 (2019).
  10. An, Y., et al. marrow mesenchymal stem cell aggregate: an optimal cell therapy for full-layer cutaneous wound vascularization and regeneration. Scientific Reports. 5, 17036(2015).
  11. Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (10), 5807-5812 (2003).
  12. Gronthos, S., et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. Journal of Dental Research. 81 (8), 531-535 (2002).
  13. Chen, H., et al. Regeneration of pulpo-dentinal-like complex by a group of unique multipotent CD24a(+) stem cells. Science Advances. 6 (15), (2020).
  14. Yang, T., et al. hDPSC-laden GelMA microspheres fabricated using electrostatic microdroplet method for endodontic regeneration. Materials Science & Engineering. C: Materials for Biological Applications. 121, 111850(2021).
  15. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), 2720(2011).
  16. Nakao, K., et al. The development of a bioengineered organ germ method. Nature Methods. 4 (3), 227-230 (2007).
  17. Hasani-Sadrabadi, M. M., et al. An engineered cell-laden adhesive hydrogel promotes craniofacial bone tissue regeneration in rats. Science Translational Medicine. 12 (534), (2020).
  18. Fan, L., et al. Gravitational sedimentation-based approach for ultra-simple and flexible cell patterning coculture on microfluidic device. Biofabrication. 12 (3), 035005(2020).
  19. Singh, R., et al. Cell specificity of magnetic cell seeding approach to hydrogel colonization. Journal of Biomedical Materials Research: Part A. 105 (11), 2948-2957 (2017).
  20. Guo, H., et al. Odontogenesis-related developmental microenvironment facilitates deciduous dental pulp stem cell aggregates to revitalize an avulsed tooth. Biomaterials. 279, 121223(2021).
  21. Xuan, K., et al. Deciduous autologous tooth stem cells regenerate dental pulp after implantation into injured teeth. Science Translational Medicine. 10 (455), (2018).
  22. Sui, B. D., et al. Stem cell-based bone regeneration in diseased microenvironments: Challenges and solutions. Biomaterials. 196, 18-30 (2019).
  23. Shang, F., et al. Human umbilical cord MSCs as new cell sources for promoting periodontal regeneration in inflammatory periodontal defect. Theranostics. 7 (18), 4370-4382 (2017).
  24. Arnold, A. M., Holt, B. D., Daneshmandi, L., Laurencin, C. T., Sydlik, S. A. Phosphate graphene as an intrinsically osteoinductive scaffold for stem cell-driven bone regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (11), 4855-4860 (2019).
  25. Wu, M., et al. SHED aggregate exosomes shuttled miR-26a promote angiogenesis in pulp regeneration via TGF-beta/SMAD2/3 signalling. Cell Proliferation. 54 (7), e13074(2021).
  26. Li, Z., et al. Apoptotic vesicles activate autophagy in recipient cells to induce angiogenesis and dental pulp regeneration. Molecular Therapy. 30 (10), 3193-3208 (2022).
  27. Vogel, V. Unraveling the mechanobiology of extracellular matrix. Annual Review of Physiology. 80, 353-387 (2018).
  28. Huebsch, N., et al. Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate. Nature Materials. 9 (6), 518-526 (2010).
  29. Shuai, Y., et al. Melatonin treatment improves mesenchymal stem cells therapy by preserving stemness during long-term in vitro expansion. Theranostics. 6 (11), 1899-1917 (2016).
  30. Sui, B. D., Zhu, B., Hu, C. H., Zhao, P., Jin, Y. Reconstruction of regenerative stem cell niche by cell aggregate engineering. Methods in Molecular Biology. 2002, 87-99 (2019).
  31. Wei, F., et al. Vitamin C treatment promotes mesenchymal stem cell sheet formation and tissue regeneration by elevating telomerase activity. Journal of Cellular Physiology. 227 (9), 3216-3224 (2012).
  32. de Clerck, Y. A., Jones, P. A. The effect of ascorbic acid on the nature and production of collagen and elastin by rat smooth-muscle cells. The Biochemical Journal. 186 (1), 217-225 (1980).
  33. Fujisawa, K., et al. Evaluation of the effects of ascorbic acid on metabolism of human mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 93(2018).
  34. Wang, T., et al. The histone demethylases Jhdm1a/1b enhance somatic cell reprogramming in a vitamin-C-dependent manner. Cell Stem Cell. 9 (6), 575-587 (2011).
  35. Sun, J., et al. Osthole improves function of periodontitis periodontal ligament stem cells via epigenetic modification in cell sheets engineering. Scientific Reports. 7 (1), 5254(2017).
  36. Wang, Y. J., et al. Resveratrol enhances the functionality and improves the regeneration of mesenchymal stem cell aggregates. Experimental and Molecular. 50 (6), 1-15 (2018).
  37. Shang, F., et al. The effect of licochalcone A on cell-aggregates ECM secretion and osteogenic differentiation during bone formation in metaphyseal defects in ovariectomized rats. Biomaterials. 35 (9), 2789-2797 (2014).
  38. Dissanayaka, W. L., Zhu, L., Hargreaves, K. M., Jin, L., Zhang, C. Scaffold-free prevascularized microtissue spheroids for pulp regeneration. Journal of Dental Research. 93 (12), 1296-1303 (2014).
  39. Dissanayaka, W. L., Zhu, L., Hargreaves, K. M., Jin, L., Zhang, C. In vitro analysis of scaffold-free prevascularized microtissue spheroids containing human dental pulp cells and endothelial cells. Journal of Endodontics. 41 (5), 663-670 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Mesenchymal Stem CellsSelf Assembled AggregatesTissue EngineeringRegenerative MedicineCell EngraftmentExtracellular MatrixCell Cell InteractionsUmbilical Cord MSCsCranial Bone Regeneration
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи